實(shí)驗(yàn)離心技術(shù)酶學(xué)實(shí)驗(yàn)

1、目目 錄錄實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二 離離 心心 技技 術(shù)術(shù)及酶的提取、比活性測定及酶的提取、比活性測定目目 錄錄v概念概念 生物樣品懸浮液在高速旋轉(zhuǎn)下，由于巨大生物樣品懸浮液在高速旋轉(zhuǎn)下，由于巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒的離心力作用，使懸浮的微小顆粒( (細(xì)胞器、細(xì)胞器、生物大分子的沉淀等生物大分子的沉淀等) )以一定的速度沉降，從以一定的速度沉降，從而與溶液得以分離的一種技術(shù)。沉降速度取決而與溶液得以分離的一種技術(shù)。沉降速度取決于顆粒的質(zhì)量、大小和密度，離心技術(shù)主要用于顆粒的質(zhì)量、大小和密度，離心技術(shù)主要用于各種生物樣品的分離和制備。于各種生物樣品的分離和制備。目目 錄錄基本原理基本原理v離心力離

2、心力 當(dāng)一個粒子當(dāng)一個粒子( (生物大分子或細(xì)胞器生物大分子或細(xì)胞器) )在高速在高速旋轉(zhuǎn)下受到離心力作用時，此離心力旋轉(zhuǎn)下受到離心力作用時，此離心力“F”F”由下式定義，即：由下式定義，即：rmamF2目目 錄錄v相對離心力（相對離心力（RCF） 通常離心力常用地球的引力的倍數(shù)來表通常離心力常用地球的引力的倍數(shù)來表示，所以稱為相對離心力。示，所以稱為相對離心力。 在離心場中，作用于顆粒的離心力相當(dāng)在離心場中，作用于顆粒的離心力相當(dāng)于地球重力的倍數(shù)，單位是重力加速度于地球重力的倍數(shù)，單位是重力加速度g（980cm/s2）。）。目目 錄錄v RCF = 1.11910-5(rpm)2rv(rpm

3、-revolutions per minute為每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)，r/min)v低速離心時常以轉(zhuǎn)速低速離心時常以轉(zhuǎn)速“rpm”來表示來表示v高速離心時則以高速離心時則以“g”表示表示9802rRCF602rpm目目 錄錄離心機(jī)的主要構(gòu)造和類型離心機(jī)的主要構(gòu)造和類型 工業(yè)用離心機(jī)工業(yè)用離心機(jī)離心機(jī)離心機(jī) 制備性離心機(jī)制備性離心機(jī) 實(shí)驗(yàn)用離心機(jī)實(shí)驗(yàn)用離心機(jī) 分析性離心機(jī)分析性離心機(jī) 目目 錄錄v一、制備性離心機(jī)的三類一、制備性離心機(jī)的三類1 1 普通離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速普通離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速6000rpm6000rpm左右左右2 2 高速冷凍離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速為高速冷凍離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速為2000020000 2

4、5000rpm25000rpm（r/minr/min）3 3超速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速可達(dá)超速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速可達(dá)500005000080000rpm80000rpm， 超速離心機(jī)裝有真空系統(tǒng)，這是它與高速離超速離心機(jī)裝有真空系統(tǒng)，這是它與高速離 心機(jī)的主要區(qū)別。心機(jī)的主要區(qū)別。 目目 錄錄二、轉(zhuǎn)頭二、轉(zhuǎn)頭v1 1角式轉(zhuǎn)頭角式轉(zhuǎn)頭 目目 錄錄v2 2蕩平式轉(zhuǎn)頭：蕩平式轉(zhuǎn)頭： 這種轉(zhuǎn)頭是由吊著的這種轉(zhuǎn)頭是由吊著的4 4或或6 6個自由活動個自由活動 的吊桶的吊桶( (離心套管離心套管) )構(gòu)成。構(gòu)成。 v3 3區(qū)帶轉(zhuǎn)頭：區(qū)帶轉(zhuǎn)頭： 區(qū)帶轉(zhuǎn)頭無離心管，主要由一個轉(zhuǎn)子區(qū)帶轉(zhuǎn)頭無離心管，主要由一個轉(zhuǎn)子 桶和可旋開的

5、頂蓋組成。桶和可旋開的頂蓋組成。 v4 4 垂直轉(zhuǎn)頭：垂直轉(zhuǎn)頭： 其離心管是垂直放置的。其離心管是垂直放置的。 v5 5 連續(xù)流動轉(zhuǎn)頭：連續(xù)流動轉(zhuǎn)頭： 轉(zhuǎn)頭與區(qū)帶轉(zhuǎn)頭類似，由轉(zhuǎn)子桶和有入口和出口轉(zhuǎn)頭與區(qū)帶轉(zhuǎn)頭類似，由轉(zhuǎn)子桶和有入口和出口 的轉(zhuǎn)頭蓋及附屬裝置組成。的轉(zhuǎn)頭蓋及附屬裝置組成。目目 錄錄三、離心管三、離心管 v塑料離心管常用材料有聚乙烯塑料離心管常用材料有聚乙烯(PE)(PE)，聚碳酸，聚碳酸酯酯(PC)(PC)，聚丙烯，聚丙烯(PP)(PP)等，其中等，其中PPPP管性能較好。管性能較好。塑料離心管的優(yōu)點(diǎn)是透明塑料離心管的優(yōu)點(diǎn)是透明( (或半透明或半透明) )，硬度，硬度小，可用穿刺

6、法取出梯度。缺點(diǎn)是易變形，小，可用穿刺法取出梯度。缺點(diǎn)是易變形，抗有機(jī)溶劑腐蝕性差，使用壽命短?？褂袡C(jī)溶劑腐蝕性差，使用壽命短。目目 錄錄v不銹鋼管強(qiáng)度大，不變形，能抗熱，抗凍，不銹鋼管強(qiáng)度大，不變形，能抗熱，抗凍，抗化學(xué)腐蝕。但用時也應(yīng)避免接觸強(qiáng)腐蝕性抗化學(xué)腐蝕。但用時也應(yīng)避免接觸強(qiáng)腐蝕性的化學(xué)藥品，如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等。的化學(xué)藥品，如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等。v離心管蓋離心管蓋離心前必須蓋嚴(yán)，配平時需帶管蓋重量離心前必須蓋嚴(yán)，配平時需帶管蓋重量防止樣品外泄、揮發(fā)防止樣品外泄、揮發(fā)支持離心管，防止離心管變形支持離心管，防止離心管變形目目 錄錄v制備性超速離心的分離方法制備性超速離心的分離方法差速沉降離心法差速

7、沉降離心法 逐漸增加離心速度，或者低速、高速交替逐漸增加離心速度，或者低速、高速交替進(jìn)行離心，使不同的離心速度及不同離心時進(jìn)行離心，使不同的離心速度及不同離心時間下分批分離的方法。間下分批分離的方法。用途：分離沉降系數(shù)相差較大的顆粒用途：分離沉降系數(shù)相差較大的顆粒優(yōu)點(diǎn)：操作簡便優(yōu)點(diǎn)：操作簡便缺點(diǎn)：分理效果差，顆粒受擠壓易變性失活缺點(diǎn)：分理效果差，顆粒受擠壓易變性失活目目 錄錄密度梯度區(qū)帶離心法（區(qū)帶離心法）密度梯度區(qū)帶離心法（區(qū)帶離心法）定義：將樣品加在惰性梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心沉定義：將樣品加在惰性梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心沉降或沉降平衡，在一定的離心力下把顆粒分降或沉降平衡，在一定的離心力下把顆粒分配

8、到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。的分離方法。優(yōu)點(diǎn)：分理效果好、適應(yīng)范圍廣、顆粒不會擠優(yōu)點(diǎn)：分理效果好、適應(yīng)范圍廣、顆粒不會擠壓變形保持活性壓變形保持活性缺點(diǎn)：離心時間長、需制備惰性梯度介質(zhì)溶液、缺點(diǎn)：離心時間長、需制備惰性梯度介質(zhì)溶液、操作嚴(yán)格不易掌握操作嚴(yán)格不易掌握目目 錄錄五、離心操作的注意事項(xiàng)五、離心操作的注意事項(xiàng)v使用各種離心機(jī)時，必須事先在天平上精密地使用各種離心機(jī)時，必須事先在天平上精密地平衡離心管和其內(nèi)容物，轉(zhuǎn)頭中絕對不能裝載平衡離心管和其內(nèi)容物，轉(zhuǎn)頭中絕對不能裝載單數(shù)的管子，當(dāng)轉(zhuǎn)頭只是部分裝載時，管子必單數(shù)的管子，當(dāng)轉(zhuǎn)頭只是

9、部分裝載時，管子必須互相對稱地放在轉(zhuǎn)頭中，以便使負(fù)載均勻地須互相對稱地放在轉(zhuǎn)頭中，以便使負(fù)載均勻地分布在轉(zhuǎn)頭的周圍。分布在轉(zhuǎn)頭的周圍。v每個轉(zhuǎn)頭各有其最高允許轉(zhuǎn)速和使用累計期限，每個轉(zhuǎn)頭各有其最高允許轉(zhuǎn)速和使用累計期限，使用轉(zhuǎn)頭時要查閱說明書，不得過速使用。使用轉(zhuǎn)頭時要查閱說明書，不得過速使用。目目 錄錄裝載溶液時，要根據(jù)各種離心機(jī)的具體操作說裝載溶液時，要根據(jù)各種離心機(jī)的具體操作說明進(jìn)行，根據(jù)待離心液體的性質(zhì)及體積選用適合明進(jìn)行，根據(jù)待離心液體的性質(zhì)及體積選用適合的離心管，有的離心管無蓋，液體不得裝得過多，的離心管，有的離心管無蓋，液體不得裝得過多，以防離心時甩出，造成轉(zhuǎn)頭不平衡、生銹或被腐

10、以防離心時甩出，造成轉(zhuǎn)頭不平衡、生銹或被腐蝕蝕; ;而制備性超速離心機(jī)的離心管，則常常要求而制備性超速離心機(jī)的離心管，則常常要求必須將液體裝滿，以免離心時塑料離心管的上部必須將液體裝滿，以免離心時塑料離心管的上部凹陷變形。凹陷變形。若要在低于室溫的溫度下離心時。轉(zhuǎn)頭在使用若要在低于室溫的溫度下離心時。轉(zhuǎn)頭在使用前應(yīng)放置在冰箱或置于離心機(jī)的轉(zhuǎn)頭室內(nèi)預(yù)冷。前應(yīng)放置在冰箱或置于離心機(jī)的轉(zhuǎn)頭室內(nèi)預(yù)冷。 離心過程中不得隨意離開離心過程中不得隨意離開目目 錄錄實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容v酶的提取及比活性測定酶的提取及比活性測定目目 錄錄一、堿性磷酸酶堿性磷酸酶(alkaline (alkaline phosphat

11、asephosphatase, AKP), AKP)的分離純化及的分離純化及比活性測定比活性測定 目的目的 1 1掌握掌握AKPAKP分離純化的實(shí)驗(yàn)原理、方法分離純化的實(shí)驗(yàn)原理、方法 及注及注意事項(xiàng)意事項(xiàng) 2 2了解檢測了解檢測AKPAKP活性測定的原理和方法活性測定的原理和方法。目目 錄錄v方法方法酶的本質(zhì)：蛋白質(zhì)酶的本質(zhì)：蛋白質(zhì)p鹽析法鹽析法p有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法p層析法層析法p電泳電泳目目 錄錄酶組織細(xì)胞：先破碎細(xì)胞，組織細(xì)胞：先破碎細(xì)胞， 再用一定的試劑提取再用一定的試劑提取體液：直接提取體液：直接提取方法方法物理方法物理方法化學(xué)方法化學(xué)方法目目 錄錄v原則原則p制備的原料制備

12、的原料p初期采用、后期采用方法初期采用、后期采用方法p影響因素影響因素目目 錄錄p影響因素影響因素pH：最適：最適pH溫度：低溫時酶比較穩(wěn)定，有機(jī)溶劑需預(yù)冷溫度：低溫時酶比較穩(wěn)定，有機(jī)溶劑需預(yù)冷氧化：氧化：SH對某些酶的活性必需，加入還原劑對某些酶的活性必需，加入還原劑重金屬離子污染：與重金屬離子污染：與SH發(fā)生作用而失活：發(fā)生作用而失活：EDTA蛋白酶的污染，蛋白酶的污染，PMSF、DFP介質(zhì)的極性和離子強(qiáng)度：疏水介質(zhì)的極性和離子強(qiáng)度：疏水最穩(wěn)定pH目目 錄錄v評估指標(biāo)評估指標(biāo)p酶的純度用比活性代表酶的純度用比活性代表定義：單位重量（定義：單位重量（mg）蛋白樣品中所含酶的活性單位）蛋白樣品

13、中所含酶的活性單位表示方法：每表示方法：每mg蛋白質(zhì)所具有酶的活性單位蛋白質(zhì)所具有酶的活性單位測定方法：測定方法：每每mlml樣品中的蛋白質(zhì)樣品中的蛋白質(zhì)mgmg數(shù)數(shù) 每每mlml樣品中酶的活性單位樣品中酶的活性單位酶的活性單位：酶促反應(yīng)在單位時間（秒、分鐘、小時）酶的活性單位：酶促反應(yīng)在單位時間（秒、分鐘、小時）內(nèi)生成一定量的產(chǎn)物或消耗一定量的底物所需要的酶量。內(nèi)生成一定量的產(chǎn)物或消耗一定量的底物所需要的酶量。目目 錄錄p酶的回收率酶的回收率 提取純化過程中雜蛋白逐步去除，同時伴隨提取純化過程中雜蛋白逐步去除，同時伴隨部分酶的損失。部分酶的損失。 在保證純度的前提下，應(yīng)盡可能提高酶的收在保證

14、純度的前提下，應(yīng)盡可能提高酶的收率。率。目目 錄錄 原理原理 機(jī)械破碎法制備肝勻漿機(jī)械破碎法制備肝勻漿 勻漿液勻漿液 低濃度醋酸鈉：低滲破膜低濃度醋酸鈉：低滲破膜 低濃度醋酸鎂：保護(hù)和穩(wěn)定低濃度醋酸鎂：保護(hù)和穩(wěn)定AKPAKP 有機(jī)溶劑沉淀法分離純化有機(jī)溶劑沉淀法分離純化AKPAKP 加入不同有機(jī)溶劑，重復(fù)離心加入不同有機(jī)溶劑，重復(fù)離心 正丁醇：沉淀部分除正丁醇：沉淀部分除AKPAKP的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì) 3333丙酮丙酮(30(30乙醇乙醇) )：AKPAKP溶解溶解 5050丙酮丙酮(60(60乙醇乙醇) )：AKPAKP不溶解不溶解 ( (一一) )堿性磷酸酶的分離提純堿性磷酸酶的分離提純目目

15、 錄錄 操作步驟操作步驟 25g25g肝組織剪碎肝組織剪碎 +0.01M+0.01M醋酸鎂醋酸鎂- -醋酸鈉溶液醋酸鈉溶液75ml75ml，勻漿機(jī)中勻漿，勻漿機(jī)中勻漿取肝勻漿取肝勻漿4ml(A4ml(A液）液） A1A1：?。喝?.1mlA0.1mlA液液+1.9mlpH8.8Tris+1.9mlpH8.8Tris緩沖液，待測比活性緩沖液，待測比活性A2A2：取：取0.1mlA0.1mlA液液+4.9ml+4.9ml生理鹽水，待測蛋白濃度生理鹽水，待測蛋白濃度 +2ml+2ml正丁醇，混勻正丁醇，混勻2min2min，室溫置，室溫置30min30min，離心，離心 （2500rpm)5min2

16、500rpm)5min下清液（吸取）下清液（吸取） 沉淀（棄）沉淀（棄） + +等體積丙酮，等體積丙酮，離心離心（2000rpm)5min2000rpm)5min 上清液（棄）上清液（棄） 沉淀沉淀 +0.5M+0.5M醋酸鎂醋酸鎂2ml2ml溶解（溶解（B B液）液）目目 錄錄 操作步驟操作步驟 B B 液液 +95%+95%冷乙醇至冷乙醇至30%30%，離心（，離心（2500rpm2500rpm）5min5min上清液（吸?。┥锨逡海ㄎ。?沉淀（棄）沉淀（棄） + 95%+ 95%冷乙醇至冷乙醇至60%60%，離心（，離心（2500rpm2500rpm）5min5min上清液（棄）上清液

17、（棄） 沉淀沉淀 +0.01M +0.01M 醋酸鎂醋酸鎂- -醋酸鈉醋酸鈉2ml,2ml,溶解（溶解（C C液）液） C1C1：?。喝?.1mlC0.1mlC液液+1.9mlpH8.8Tris+1.9mlpH8.8Tris緩沖液，待測比活性緩沖液，待測比活性 C2C2：?。喝?.1mlC0.1mlC液液+0.1ml+0.1ml生理鹽水，待測蛋白濃度生理鹽水，待測蛋白濃度 B1B1：取：取0.1mlB0.1mlB液液+1.9mlpH8.8Tris+1.9mlpH8.8Tris緩沖液，待測比活性緩沖液，待測比活性B2B2：取：取0.1mlB0.1mlB液液+0.9ml+0.9ml生理鹽水，待測蛋

18、白濃度生理鹽水，待測蛋白濃度目目 錄錄加入有機(jī)溶劑計算公式加入有機(jī)溶劑計算公式設(shè)加入設(shè)加入Xml95%Xml95%乙醇乙醇至終濃度至終濃度30%30% 30% 30%（B B液體積液體積+X+X）=95%=95%X X X=30%B X=30%B液體積液體積95%-30%=0.462B95%-30%=0.462B液體積液體積至終濃度至終濃度60%60% 60% 60%（上清液體積（上清液體積+X+X）30%30%上清液體積上清液體積=95%X=95%X X= X=（60%-30%60%-30%）上清液體積）上清液體積 95%-60%=0.867 95%-60%=0.867上清液體積上清液體積目

19、目 錄錄 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) l各步加入有機(jī)溶劑量要準(zhǔn)確。否則會影響整個實(shí)驗(yàn)結(jié)果。各步加入有機(jī)溶劑量要準(zhǔn)確。否則會影響整個實(shí)驗(yàn)結(jié)果。l操作要在低溫下進(jìn)行操作要在低溫下進(jìn)行l(wèi)加入有機(jī)溶劑時要慢慢滴加，充分?jǐn)嚢?，避免局部濃度過高而引起升溫加入有機(jī)溶劑時要慢慢滴加，充分?jǐn)嚢?，避免局部濃度過高而引起升溫和變性。和變性。l加入有機(jī)溶劑混勻后不宜放置過久，應(yīng)立即離心。加入有機(jī)溶劑混勻后不宜放置過久，應(yīng)立即離心。l離心析出的蛋白質(zhì)沉淀應(yīng)立即將溶于適量的緩沖液中，以避免酶活力的離心析出的蛋白質(zhì)沉淀應(yīng)立即將溶于適量的緩沖液中，以避免酶活力的喪失。喪失。目目 錄錄( (二二) )堿性磷酸酶的比活性測定堿性磷酸酶的比

20、活性測定 原理原理 比活性的定義比活性的定義l單位重量的蛋白質(zhì)樣品中所含的酶活性單位重量的蛋白質(zhì)樣品中所含的酶活性單位。單位。l通常用每毫克蛋白質(zhì)具有的酶活性單位通常用每毫克蛋白質(zhì)具有的酶活性單位來表示。來表示。l用以鑒定酶的純化程度，是酶提取與純用以鑒定酶的純化程度，是酶提取與純化成功與否的評價指標(biāo)之一。化成功與否的評價指標(biāo)之一。目目 錄錄測定樣品的比活性必須測定：測定樣品的比活性必須測定：l每毫升樣品中的酶活性單位數(shù)。每毫升樣品中的酶活性單位數(shù)。l每毫升樣品中的蛋白質(zhì)毫克數(shù)。每毫升樣品中的蛋白質(zhì)毫克數(shù)。目目 錄錄磷酸苯二鈉法測定堿性磷酶活酸性磷酸苯二鈉法測定堿性磷酶活酸性 AKP 4-AK

21、P 4-氨基安替比林氨基安替比林l磷酸苯二鈉磷酸苯二鈉 酚酚 醌衍生物（紅色）醌衍生物（紅色） 鐵氰化鉀鐵氰化鉀 根據(jù)紅色的深淺用比色法測定酚的含量。根據(jù)紅色的深淺用比色法測定酚的含量。l3737保溫保溫1515分鐘產(chǎn)生分鐘產(chǎn)生1g1g酚者為酚者為1 1個酶活性單位。個酶活性單位。 目目 錄錄目目 錄錄考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)原理（實(shí)驗(yàn)講義第實(shí)驗(yàn)原理（實(shí)驗(yàn)講義第5252頁）。頁）。目目 錄錄 操作步驟操作步驟 1.AKP1.AKP活性單位測定活性單位測定 取試管取試管5 5支，按下表操作：支，按下表操作：試劑（試劑（mlml）空白管空白管標(biāo)準(zhǔn)管標(biāo)準(zhǔn)管A AB B

22、C0.04mol/L0.04mol/L基質(zhì)液基質(zhì)液1.01.01.01.01.01.01.01.01.0pH10pH10碳酸緩沖液碳酸緩沖液0.50.50.50.50.50.50.50.50.53737水浴保溫水浴保溫5 5分鐘分鐘蒸餾水蒸餾水0.10.1_ _ _ _酚標(biāo)準(zhǔn)液（酚標(biāo)準(zhǔn)液（0.1mg/ml0.1mg/ml）_ _0.10.1_ _ _測定液測定液_ _ _A1A1液液0.10.1B B液液0.10.1C1液液0.1混勻，立即置于混勻，立即置于37 37 水浴保溫水浴保溫1515分鐘分鐘目目 錄錄 加加0.2M NaOH0.2M NaOH溶液溶液1ml1ml加加0.3%4-0.3%4-氨基安替比林氨基安替比林1ml, 0.5%1ml, 0.5%鐵氰化鉀溶液鐵氰化鉀溶液2ml2ml