金匱腎氣丸對2型糖尿病腎病大鼠igf-et及心臟組織形態(tài)影響

1、獨 創(chuàng) 性 聲 明本人聲明所呈交的學位論文是本人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。學位論文中凡引用他人已經(jīng)發(fā)表或未發(fā)表的成果、數(shù)據(jù)、觀點等，均已明確注明出處。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的科研成果。對本研究做出奉獻的個人和集體均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。論文作者簽名：簽字日期：年月日學位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學位論文作者完全了解甘肅中醫(yī)學院有關(guān)保存、使用學位論文的規(guī)定，本人同意學院保存或向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的紙質(zhì)版和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)甘肅中醫(yī)學院可以將學位論文的全部或局部內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用任

2、何復制手段保存、匯編學位論文。保密的學位論文在解密后適用本授權(quán)書學位論文作者簽名：導師簽名：簽字日期：簽字日期：年年月月日日目 錄中 文 摘 要 . 1ABSTRACT . 3縮 略 詞 表 . 5前 言 . 6一 立 題 依 據(jù) . 71 現(xiàn)代醫(yī)學研究進展 . 71.1 糖尿病腎病流行病學概況 . 71.2 糖尿病腎病的發(fā)病機制 . 71.3 糖尿病腎病的臨床分期 . 111.4 糖尿病腎病的現(xiàn)代醫(yī)學治療現(xiàn)狀 . 122 傳統(tǒng)醫(yī)學研究進展 . 122.1 糖尿病及糖尿病腎病中醫(yī)病機概述 . 122.2 中醫(yī)藥治療糖尿病腎病研究進展 . 143 選取實驗指標的依據(jù) . 153.1 胰島素樣生長

3、因子-1IGF-1 . 153.2 血漿內(nèi)皮素ET . 163.3 糖尿病腎病中 IGF-1 與 ET 的關(guān)系 . 173.4 心臟組織 . 17二 實 驗 研 究 . 191 實驗材料 . 191.1 試驗藥物及試劑 . 191.2 實驗儀器 . 192 技術(shù)路線圖 . 203 實驗方法 . 213.1 造模與分組 . 213.2 給藥 . 213.3 標本采集與處理 . 213.4 檢測指標 . 223.5 統(tǒng)計學處理 . 224 實驗結(jié)果 . 234.1 金匱腎氣丸對 2 型糖尿病腎病大鼠給藥前后血糖的影響 . 234.2 金匱腎氣丸對 2 型糖尿病腎病大鼠血脂的影響 . 244.3 金

4、匱腎氣丸對 2 型糖尿病腎病大鼠血肌酐、尿素氮的影響 . 254.4 金匱腎氣丸對 2 型糖尿病腎病大鼠尿白蛋白排泄率的影響 . 264.5 金匱腎氣丸對 2 型糖尿病腎病大鼠 IGF-1、ET 的影響 . 274.6 金匱腎氣丸對 2 型糖尿病腎病大鼠心臟組織形態(tài)的影響 . 285 討論 . 295.1 模型評價 . 295.2 金匱腎氣丸的選用依據(jù) . 295.3 羅格列酮的選用依據(jù) . 305.4 金匱腎氣丸治療 2 型糖尿病腎病的機理探討 . 316結(jié)語 . 337 問題與展望 . 33參考文獻 . 34致謝 . 40附錄 1附錄二心臟組織切片. 41動物實驗設施使用證 . 42附錄三

5、 實驗動物質(zhì)量合格證 . 43附錄四 在校期間發(fā)表論文 . 44金匱腎氣丸對 2 型糖尿病腎病大鼠 IGF-1、ET 及心臟組織形態(tài)的影響中 文 摘 要目的：觀察金匱腎氣丸對實驗性 2 型糖尿病腎病大鼠血清 IGF-1、血漿 ET 以及心臟組織形態(tài)的影響，探討金匱腎氣丸防治 2 型糖尿病腎病的機制。方法：SPF 級 Wistar 大鼠 60 只，雄性,體重為 20020g，普通飼料適應性喂養(yǎng) 1周后，將大鼠按體重編號，以隨機數(shù)字表法抽取 8 只為空白組，喂以普通飼料；其余52 只大鼠喂以高脂高糖飼料誘發(fā)胰島素抵抗。第 6 周，分 2 次左側(cè)下腹部腹腔注射30mg/kg 鏈脲佐菌素Strepto

6、zotocin，STZ，誘發(fā) 2 型糖尿病腎病大鼠模型。第 8 周，檢測相關(guān)指標后選擇造模成功的 40 只大鼠，稱重并按體重編號，以隨機數(shù)字表法分為5 組：模型組、西藥羅格列酮組、金匱腎氣丸大劑量組、金匱腎氣丸中劑量組和金匱腎氣丸小劑量組，分別給予生理鹽水、羅格列酮、金匱腎氣丸溶液灌胃治療。第 13 周,于實驗結(jié)束前一天，用代謝籠收集 24h 尿標本以測定 24h 尿白蛋白含量，并計算尿白蛋白排泄率(UAER)。取血檢測各組大鼠血糖、血肌酐SCr、血尿素氮(BUN)、總膽固醇TC、甘油三酯TG、高密度脂蛋白HDL、低密度脂蛋白LDL、胰島素樣生長因子-1IGF-1和內(nèi)皮素ET含量；處死大鼠，取

7、大鼠心臟組織切片，并觀察心臟形態(tài)改變。結(jié)果：模型組與空白組相比擬，血糖、血肌酐、血尿素氮、尿白蛋白排泄率、甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白和內(nèi)皮素ET均升高，而高密度脂蛋白與胰島素樣生長因子-1IGF-1降低P0.01。與模型組比擬，羅格列酮組和金匱腎氣丸大劑量組血糖、血肌酐、血尿素氮、尿白蛋白排泄率、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、內(nèi)皮素均降低，而高密度脂蛋白和胰島素樣生長因子-1 升高P0.01 或 P0.05；金匱腎氣丸中劑量組，除高密度脂蛋白以外差異均有統(tǒng)計學意義P0.01 或 P0.05；金匱腎氣丸小劑量組甘油三酯、尿白蛋白排泄率、胰島素樣生長因子-1 和內(nèi)皮素降低，差異有統(tǒng)計學意

8、義P0.01 或 P0.05。與羅格列酮組比擬，金匱腎氣丸小劑量組內(nèi)皮素升高，差異有統(tǒng)計學意義P0.01, 金匱腎氣大、中、小劑量組胰島素樣生長因子-1 均無明顯差異P0.05。與中、小劑量組比擬，金匱腎氣丸大劑量組血糖、尿白蛋白排泄率、甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白均降低，差異有統(tǒng)計學意義P0.01 或 P0.05。各治療組均可不同程度的修復受損的心肌組織，羅格列酮組與金匱腎氣丸大、中劑量組優(yōu)于小劑量組。1金匱腎氣丸對 2 型糖尿病腎病大鼠 IGF-1、ET 及心臟組織形態(tài)的影響結(jié)論：金匱腎氣丸有降低 2 型糖尿病腎病大鼠血糖、血肌酐、血尿素氮、尿白蛋白排泄率、甘油三酯、總膽固醇、低密度脂

9、蛋白和血漿內(nèi)皮素的作用，可升高高密度脂蛋白及胰島素樣生長因子-1 的含量，從而防治 2 型糖尿病腎病的發(fā)生與開展，同時亦促進心臟受損組織的修復。關(guān)鍵詞：金匱腎氣丸；糖尿病腎?。荒虬椎鞍着判孤?；IGF-1；ET；心臟組織2金匱腎氣丸對 2 型糖尿病腎病大鼠 IGF-1、ET 及心臟組織形態(tài)的影響ABSTRACTObjective: To observe the effects on insulin-like growth factor-1(IGF-1) , endothelin(ET) and the heart tissue morphologic changes in the experim

10、ental rats of type 2 diabeticnephropathyDNby using Jin kui shen qi pill. To explore the mechanism of the preventionand cure of type 2 diabetic nephropathy.Methods: 60 SPF grade Wistar male rats whose weight were about 20020g wereselected to feed the normal food for 1 week. Number the rats according

11、to their weight, then 8rats would be selected randomly as the blank group for ordinary food. The remaining 52 ratswere fed with the high-fat and high-sugar food to cause the insulin resistance. At the 6th week,the 52 rats would be undergo intraperitoneal injection twice on left hypogastrium with30mg

12、kg-1 streptozotocin (STZ) to made Type 2 diabetic nephropathy rats models. At the 8thweek, test the related indexes and select 40 successful animal models which were dividedrandomly into 5 groups: a models group, a rosiglitazone (RSG) group, a Jin kui shen qi pill(JK) high dose group, a Jin kui shen

13、 qi pill medium dose group and a Jin kui shen qi pill lowdose group. Then therapy them by NS、Rosiglitazone and Jin kui shen qi pill solution. At the13th week, the day before the end of the experiment, collect urine samples using metaboliccages to test the contents of 24h urinary albumin, then calcul

14、ated urinary albumin excretionrate (UAER). Collect the blood to test for the blood glucose, SCr, BUN, TC, TG, HDL, LDL,IGF-1 and ET. Kill the rats, make heart slices and observe the changes of heart biopsy.Results: Compared model group with blank group，the level of the blood glucose,SCr, BUN, UAER,

15、TG, TC, LDL and ET of the model group increased，while the HDL andIGF-1 decreasedP0.01). Compared with the model group, the blood glucose, SCr,BUN, UAER, TC, TG, LDL, ET of the RSG group and the JK high dose group decreased, butthe HDL and IGF-1 increased(P0.01 or P0.05). Compared with the model grou

16、p, otherresults of the JK medium dose group except HDL had differences which had statisticalsignificanceP0.01 or P0.05. The JK low dose group compared with model group,there were obvious difference on the level of TG, UAER, IGF-1 and ET which decreasedbetween the two groupsP0.01 orP0.05. Compared wi

17、th the rosiglitazone group,ET of the JK low dose group was different which increasedP0.01. The levels of IGF-13金匱腎氣丸對 2 型糖尿病腎病大鼠 IGF-1、ET 及心臟組織形態(tài)的影響had no obvious difference between the Jin kui shen qi pill groups and the rosiglitazone groupP0.05. Compared with the JK medium and low dose group, bloo

18、d glucose, UAER,TG ,TC, LDL of the JK high dose group decreased which had Statistically significant (P0.01 or P0.05). Pathological biopsy of the heart tissue shows that the heart tissue hadobservably repaired by the treatment groups. Rosiglitazone group, Jin kui shen qi pill highdose group and Jin k

19、ui shen qi pill medium dose group had gotten better curative effect thanJin kui shen qi pill low dose group.Conclusion: Jin kui shen qi pill can decrease the level of the blood glucose, SCr, BUN,UAER, TG, TC, LDL and ET, also can increase HDL and IGF-1 of type 2 diabeticnephropathy rats in order to

20、prevent and treat the development of diabetic nephropathy. Jinkui shen qi pill can improve insulin resistance and promote the heart tissue repairs at the sametime.KEY WORDS: Jin kui shen qi pill (JK)； diabetic nephropathy(DN)；urinary albuminexcretion tate(UAER)；insulin-like growth factor-1(IGF-1); e

21、ndothelinET；the heart tissuepathological morphology4金匱腎氣丸對 2 型糖尿病腎病大鼠 IGF-1、ET 及心臟組織形態(tài)的影響縮 略 詞 表縮 略 詞AGEsAngARBUNDNECMESRDETFBGGHHDLIGF-1LDLPKCSCrSTZTCTGUAER英 文 全 稱Advanced GlucosylationEndproductsangiotensin Aldose reductaseBlood urea nitrogenDiabetic nephropathyExtracellular matrixEnd stage renal

22、diseaseEndothelinFasting blood glucosegrowth hormoneHigh density lipoproteinInsulin-like growth factor-1Low density lipoproteinProtein kinase CSerum creatinineStreptozotocinTotal cholesterolTriglycerideUrinary albumin excretion tate5中 文 名 稱晚期糖化終末產(chǎn)物血管緊張素醛糖復原酶血尿素氮糖尿病腎病細胞外基質(zhì)終末期腎臟病內(nèi)皮素空腹血糖生長激素高密度脂蛋白膽固醇胰島

23、素樣生長因子-1低密度脂蛋白膽固醇蛋白激酶 C血肌酐鏈脲佐菌素總膽固醇甘油三脂尿白蛋白排泄率金匱腎氣丸對 2 型糖尿病腎病大鼠 IGF-1、ET 及心臟組織形態(tài)的影響前 言由于社會經(jīng)濟的開展，生活水平的提高和生活方式的改變，過去 20 年中世界糖尿病患者數(shù)量飛速增長，預計將來還會增加，尤其在開展中國家，糖尿病患者增長速度極快。本病使患者生活質(zhì)量降低，并發(fā)癥及病死率增高，已成為嚴重威脅人類健康的疾病之一。而在糖尿病患者中，2 型糖尿病占絕大多數(shù)，我國患病人群中，以 2 型糖尿病為主，占糖尿病總數(shù)的 93.7%，1 型糖尿病占 5.6%，其他類型糖尿病僅占 0.7%。糖尿病腎病(diabetic

24、nephropathy，DN)作為糖尿病常見的微血管并發(fā)癥之一，在糖尿病患者中的發(fā)病率為 20%40%，是導致終末期腎病end-stage renal disease，ESRD發(fā)生的最重要原因之一 1。糖尿病腎病多見于病程 10 年以上的糖尿病患者，已成為糖尿病病人主要的死亡原因之一。DN 發(fā)病機制十分復雜，尚未完全說明，可以確定的是，DN 的發(fā)生是多種因素共同作用的結(jié)果，主要包括遺傳因素、腎小球血流動力學改變、多元醇途徑活化、醛糖復原酶AR和蛋白激酶 CPKC的激活、蛋白非酶糖基化以及細胞因子、生長因子、炎癥、介質(zhì)、高血壓等因素。中醫(yī)認為糖尿病腎病屬于“消渴、“水腫、“尿濁、“癃閉、“關(guān)格等

25、范疇，其病機那么為陰虛燥熱，本虛標實。金匱腎氣丸是中醫(yī)治療消渴的根本方之一，可起到陰陽雙補之效，從根本上改善腎臟疾患。從現(xiàn)代醫(yī)學研究來看，該方能夠改善糖類、脂類代謝，調(diào)節(jié)機體內(nèi)分泌，提高免疫力。進一步加深對該方的研究對指導臨床治療糖尿病腎病具有非凡的意義。本實驗旨在通過對 2 型糖尿病腎病模型大鼠血糖、SCr、BUN、UAER、TC、TG、LDL、HDL、IGF-1 及 ET 的檢測，和對心臟組織形態(tài)學改變的觀察，進一步揭示金匱腎氣丸對糖尿病及其并發(fā)癥的治療作用和可能機理，探討金匱腎氣丸對 DN 的防治作用，以及觀察 DN 發(fā)生同時可能出現(xiàn)的心臟病變的影響，為金匱腎氣丸臨床用于防治糖尿病及其并

26、發(fā)癥提供理論依據(jù)。6金匱腎氣丸對 2 型糖尿病腎病大鼠 IGF-1、ET 及心臟組織形態(tài)的影響一 立 題 依 據(jù)1 現(xiàn)代醫(yī)學研究進展1.1 糖尿病腎病流行病學概況糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，病變主要累及腎臟小血管和腎小球，引起蛋白尿排泄和濾過異常。2007 年 2 月美國腎臟病基金會公布了?糖尿病及慢性腎臟病的臨床實踐指南?，其中指出 “糖尿病腎病這一專業(yè)術(shù)語應被“糖尿病腎臟疾病diabetic kidney disease，DKD所替代。糖尿病腎病是導致終末期腎病end-stage renal disease，ESRD發(fā)生的最

27、重要原因之一，在美國有近 1/3 的終末期腎病是由糖尿病腎病引起的；在歐洲 DN 約占ESRD 的 7.9%，日本約占 18%，而我國約為 5%。人群研究顯示，1 型糖尿病在發(fā)病 1-3 年有 8%患者出現(xiàn)微量蛋白尿，30 年后發(fā)病率增加至 50%-60%。而臨床蛋白尿在發(fā)病 5 年左右開始出現(xiàn)，30 年后發(fā)生率增加至 30%。2 型糖尿病診斷時已有 5%-10%的患者伴有 DN，英國前瞻性糖尿病研究UKPDS統(tǒng)計表明，2 型糖尿病診斷 10 年后的微量白蛋白尿發(fā)病率是 25%。糖尿病人群腎功能衰竭發(fā)生率是一般人群的 17 倍。DN 一般出現(xiàn)在糖尿病發(fā)生數(shù)年后，目前認為 DN 發(fā)病可能與遺傳易

28、感性、糖脂代謝紊亂及腎小球血流動力學改變等因素有關(guān)。早期積極干預治療是可以阻止或延緩其向下一階段開展的，即早期 DN 是可逆轉(zhuǎn)的。1.2 糖尿病腎病的發(fā)病機制DN 的發(fā)病機制甚為復雜，很多因素尚未明確，可以肯定的是 DN 的發(fā)病是多種因素共同作用的結(jié)果。包括遺傳易感性、腎小球血液動力學改變、高血糖導致的生化代謝紊亂、氧化應激、血管活性物質(zhì)和細胞因子等。1.2.1 遺傳易感性目前，很多學者發(fā)現(xiàn)DN的發(fā)病出現(xiàn)了家庭聚集現(xiàn)象，因此可以判斷DN的發(fā)病具有明顯的遺傳傾向。大多數(shù)學者認為遺傳因素在DN的發(fā)生、開展中起著重要作用，并且DN的發(fā)病具有種族差異，這種種族差異也說明了其發(fā)病具有遺傳傾向。目前對于D

29、N遺傳因素多認為是與基因多態(tài)性相關(guān)。這些基因包括血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)基因、血管緊張素l型受體(AT1R)基因、醛糖復原酶(AR)基因、亞甲基四氫葉酸復原酶(MTH-FR)基因及7金匱腎氣丸對 2 型糖尿病腎病大鼠 IGF-1、ET 及心臟組織形態(tài)的影響胱硫醚D合成酶(CBS)基因等的多態(tài)性都與DN的發(fā)病關(guān)系密切2。亦有報道，葡萄糖轉(zhuǎn)運體-1(GLUT-1)基因、血管緊張素原(AGT)基因、轉(zhuǎn)化生長因子 (TGF-)基因、白細胞介素-6(IL-6)基因及載脂蛋白E基因的多態(tài)性也與DN的發(fā)生有一定的相關(guān)性3-4。1.2.2 腎血流動力學改變一般認為腎血流動力學改變在糖尿病腎病發(fā)生中，起至關(guān)重

30、要的作用，甚至可能是始動因素。其早期主要表現(xiàn)為腎小球高灌注、高濾過狀態(tài)；中晚期發(fā)生腎血管硬化、狹窄，腎血流量減少，腎功能逐漸降低乃至喪失。腎血流動力學改變可以導致蛋白尿的產(chǎn)生、ECM增加，腎小球硬化5。其發(fā)生腎小球硬化的機理為：高血糖可導致很多血管活性因子反響性增強，如AT-、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶、激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)、前列腺素系統(tǒng)、心鈉素、血栓素、內(nèi)皮素和NO等活性改變，這些因素使腎小球出、入球小動脈舒縮平衡失調(diào)，造成腎小球“三高狀態(tài)，即高灌注、高內(nèi)壓和高濾過 6。高血糖時，腎小球內(nèi)處于高灌注，高濾過狀態(tài)，毛細血管內(nèi)壓力增高，使系膜細胞擴張，上皮細胞足突融合產(chǎn)生致密小滴，腎小球上皮細胞從基底膜上

31、脫落；腎小球基膜型膠原信使糖核酸增高，使基底膜增厚，最終形成系膜的彌漫性、結(jié)節(jié)性病變，發(fā)生腎小球硬化。在壓力增高的情況下，損害腎小球毛細血管上皮細胞，濾過膜通透性增加，蛋白濾過增加，沉積于系膜區(qū)和腎小球基底膜，促進基質(zhì)增生，形成惡性循環(huán)，并可造成結(jié)節(jié)性和彌漫性腎小球硬化。1.2.3 高血糖導致的生化代謝紊亂蛋白質(zhì)非酶糖化有證據(jù)說明，高糖狀態(tài)下非酶糖化形成的晚期糖化終末產(chǎn)物AGEs在DN的發(fā)病機制中起重要作用，是DN發(fā)病機制的重要因素之一7。AGEs為蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸與葡萄糖及其衍生物通過非酶促反響產(chǎn)生的化合物。細胞外蛋白質(zhì)AGEs干擾基質(zhì)與細胞、基質(zhì)與基質(zhì)的相互作用，影響多種基質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)和

32、功能。AGEs導致的細胞外基質(zhì)功能異?？捎绊懷艿墓δ芎徒Y(jié)構(gòu)，如血管彈性的降低、NO擴張血管功能的缺陷。AGEs形成除可影響蛋白質(zhì)的功能外，還會影響蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)變及去除過程，導致AGEs在組織中的堆積。腎小球的AGEs可誘發(fā)腎小球漿膜膠原分子的過度交聯(lián)，影響腎小球基底膜及腎小球膜細胞的結(jié)構(gòu)，并通過血小板生長因子作用于腎小球膜細胞，造成細胞合成更多的細胞外基質(zhì)。這些過程可能導致腎小球膜細胞的細胞外基質(zhì)沉積，阻礙腎小球膜細胞大分子的清除，改變巨噬細胞功能，造成腎小球系膜細胞擴張及腎小球閉鎖。8金匱腎氣丸對 2 型糖尿病腎病大鼠 IGF-1、ET 及心臟組織形態(tài)的影響AGEs亦可通過與特異受體相互作用

33、影響細胞功能。AGEs與巨噬細胞受體結(jié)合會刺激白介素-1、胰島素樣生長因子-1、腫瘤壞死因子以及巨噬細胞克隆刺激因子的產(chǎn)生，這些細胞因子促進各種細胞生長和膠原的合成。AGEs與腎小球膜細胞受體結(jié)合，刺激血小板生長因子分泌，介導型膠原、層粘連蛋白的產(chǎn)生，使基底膜增厚，最終形成系膜的彌漫性、結(jié)節(jié)性病變，發(fā)生腎小球硬化。1.2.3.2 蛋白激酶C蛋白激酶CPKC是許多外在刺激因子如激素、生長因子等發(fā)揮作用的信號調(diào)節(jié)因子8。PKC的激活可引起胰島素抵抗IR及糖尿病血管并發(fā)癥的出現(xiàn)。DN最早期的表現(xiàn)是血流動力學的異常，腎小球濾過率的升高及輕微的血流速度的增加是其特征性改變。DN早期的高濾過率及腎小球高濾

34、過壓是高血糖介導的微動脈阻力變化的結(jié)果，包括血管緊張素活性的增強、前列腺素類化合物PGE2、PGI2、PGF2a及花生四烯酸水平的升高。PKC激活可以引起血管緊張素活性增強，也可以引起前列腺素水平的升高，導致DM早期腎小球高灌注、高濾過。血管通透性增加是糖尿病另一個特征性血管異常。PKC沖動劑能使白蛋白或其他大分子物質(zhì)通過腎小球毛細血管內(nèi)皮細胞屏障，反之，使用PKC抑制劑可使其降低。此外，在高糖環(huán)境中，血管內(nèi)皮細胞血管內(nèi)皮生長因子VEGF表達增高，能調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞增殖和新生血管形成，使用PKC抑制劑后，VEGF表達降低，細胞通透性也明顯降低。PKC的激活參與高糖狀態(tài)下轉(zhuǎn)化生長因子TGF-的激

35、活，增加細胞外基質(zhì)沉積，亦導致DN的發(fā)生。另外，PKC激活后可上調(diào)細胞粘附因子在腎小球系膜細胞中的表達，促進腎小球處自細胞粘附聚集，加速腎小球損傷9。1.2.3.3 多元醇代謝旁路多元醇代謝旁路又稱山梨醇代謝旁路，醛糖復原酶aldose reductase，AR不可逆的將葡萄糖轉(zhuǎn)化為其醇糖山梨醇；多元醇脫氫酶將山梨醇轉(zhuǎn)化為果糖。一般情況下，多元醇通路葡萄糖代謝極少，高血糖狀態(tài)下激活該通路，使葡萄糖轉(zhuǎn)換成山梨醇和果糖。山梨醇不易透過細胞膜而果糖極少進一步代謝，使細胞內(nèi)山梨醇和果糖堆積，導致細胞內(nèi)滲透壓增加，血流動力學障礙，影響腎小球和腎小管功能，誘使早期DN腎小球高濾過的發(fā)生。近年來認為NO在D

36、N的發(fā)病中起到重要作用，而NOS起作用時要消耗NADPH，多元醇通路激活也需消耗NADPH，因此多元醇通路的激活有可能影響到NO的代謝，使NO生成減少，影響血管張力，損傷血管內(nèi)皮，導致DN的發(fā)生。9金匱腎氣丸對 2 型糖尿病腎病大鼠 IGF-1、ET 及心臟組織形態(tài)的影響1.2.4 氧化應激2005年，Michael Brownlee10根據(jù)實驗結(jié)果提出了糖尿病慢性并發(fā)癥的統(tǒng)一機制：氧化應激。氧化應激產(chǎn)生活性氧簇(ROS),ROS包括有大量氧自由基、活性氧等，在DN的發(fā)病機制中起重要作用。ROS通過激活線粒體、NF-KB、DNA氧化損傷及影響基因表達來誘導細胞凋亡,促進DN的發(fā)生開展。在DN中

37、，ROS的過量產(chǎn)生可以直接導致高血糖，而各種細胞包括內(nèi)皮細胞、系膜細胞、血管平滑肌細胞和腎小管上皮細胞等又在高血糖狀態(tài)下產(chǎn)生ROS，形成惡性循環(huán)，不斷地損傷腎臟而加重DN的開展。ROS可影響到多元醇通路、蛋白激酶C、糖基化終末產(chǎn)物形成及轉(zhuǎn)化生長因子-活化等多條途徑,激起內(nèi)皮素-1、結(jié)締組織生長因子及血管內(nèi)皮生長因子等細胞因子的活化，引起腎小球細胞外基質(zhì)蛋白增加。抗氧化劑能有效抑制蛋白激酶C的活化、轉(zhuǎn)化生長因子-和纖維連接蛋白表達的上調(diào),說明ROS介導了腎小球細胞外基質(zhì)的沉積11。細胞生長因子1.2.5.1 結(jié)締組織生長因子(CTGF)在糖尿病腎病出現(xiàn)腎小球硬化及腎小管間質(zhì)纖維化的過程中, CT

38、GF是關(guān)鍵性的細胞因子之一,作為轉(zhuǎn)化生長因子的下游調(diào)節(jié)因子, 參與整個纖維化過程。CTGF具有有絲分裂原活性, 能促使成纖維細胞活化、增殖, 并誘導成纖維細胞和腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化。有學者發(fā)現(xiàn)，在高糖培養(yǎng)液或者晚期糖基化終末化產(chǎn)物培養(yǎng)液中，腎小球系膜細胞CTGF mRNA水平明顯上升。說明CTGF在過度表達可能是導致糖尿病腎病細胞外基質(zhì)沉積和腎小球進行性硬化的重要原因之一。1.2.5.2 轉(zhuǎn)化生長因子-1TGF-1TGF-1在DN的病理形成過程中占有重要的地位。高血糖、高血脂、AGEs等因素使TGF-1的活性增加，TGF-1mRNA表達上調(diào)，抑制細胞增生、促使細胞肥大，使ECM沉

39、積，從而導致了腎小球硬化及腎小管間質(zhì)纖維化12-13。TGF-1能抑制細胞增殖，促進糖尿病腎臟肥大；TGF-1亦可刺激膠原I、纖連蛋白等異常增加，抑制降解ECM所需的蛋白酶如膠原酶的合成，減少ECM的降解，增加ECM的產(chǎn)生，促進腎小球硬化。1.2.5.3 胰島素樣生長因子-1IGF-1高糖狀態(tài)下, IGF-1 分泌升高，能夠刺激系膜基質(zhì)生成, 減少系膜細胞中膠原蛋白的降解,并促進系膜細胞產(chǎn)生NO, 增加系膜細胞對葡萄糖的攝入。IGF- 1受體介導IGF- 1的生物學行為, 而二者間的相互作用受IGF-1結(jié)合蛋白( IGFBP) 的調(diào)節(jié)。IGF- 1、IGFBP以及IGF- 1受體三者共同在糖尿

40、病腎病的發(fā)生開展中起著重要作用。另外，生長激素GH/10金匱腎氣丸對 2 型糖尿病腎病大鼠 IGF-1、ET 及心臟組織形態(tài)的影響IGF-1軸也在DN的發(fā)病過程中起重要作用，IGF-1直接作用于靶細胞,促進GH的生物效應,同時反響性地調(diào)節(jié)垂體對GH的合成與釋放。 血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)VEGF可作用于血管內(nèi)皮細胞，通過改變內(nèi)皮細胞的結(jié)構(gòu)和功能，增加腎小球毛細血管的通透性，促進細胞外基質(zhì)合成，促使腎小球基底膜增厚、腎小球與腎小管纖維化及腎臟肥大。高血糖與PKC、AngII、AGEs、TGF-Bl等均可上調(diào)VEGF。上述各種因子在糖尿病腎病的病理改變中都起到了不同的作用，使腎小球基底膜增厚，

41、系膜細胞增生，細胞外基質(zhì)增多、沉積，促進了DN的發(fā)生。1.3 糖尿病腎病的臨床分期目前臨床使用的分期標準是由Mogensen提出的，根據(jù)尿蛋白和腎小球濾過率GFR將DN的自然病程分為5個階段。期腎小球高濾過期：以腎小球濾過率GFR增高和腎體積增大為特征，GFR 可高達 150 ml/min；尿白蛋白排泄率UAER正常20 g/min，或30 mg/24 h；血壓正常。病理：腎小球肥大，基底膜GBM和系膜正常。期正常白蛋白尿期：GFR 增高或正常；UAER 正常20 g/min，或5 年的糖尿患者。期 臨床糖尿病腎病期或顯性糖尿病腎病期：GFR 下降(早期 13070 ml/min，后期 703

42、0 ml/min)，平均每月下降 1 ml/min；大量白蛋白尿，UAER200g/min，或持續(xù)尿蛋白0.5 g/24 h，為非選擇性蛋白尿，約 30%的患者可出現(xiàn)典型的糖尿病腎病“三聯(lián)征大量尿蛋白(3.0 g/24 h)、水腫和高血壓的腎病綜合征特點；血壓增高。病理：GBM明顯增厚，系膜基質(zhì)增寬，荒廢的腎小球增加平均占 36%，剩余腎小球代償性肥大。期腎功能衰竭期：GFR 進行性下降，多16.7mmol/L，尿糖定性+ + 以上，且尿量增加 1 倍以上為糖尿病模型形成54。再繼續(xù)喂養(yǎng) 1 周,第 8 周用代謝籠收集 24h 尿液，記錄 24 小時尿量，混勻后留取 10ml檢測尿白蛋白含量，

43、并計算尿白蛋白排泄率尿白蛋白排泄率=尿白蛋白含量24h 尿量/1440min，以尿白蛋白排泄率20g/min，確定 DN 模型成立55。選擇造模成功的大鼠 40 只，稱重后按體重編號，按照隨機數(shù)字表法分為 5 組，分別為模型對照組，西藥羅格列酮治療組，金匱腎氣丸大劑量治療組，金匱腎氣丸中劑量治療組，金匱腎氣丸小劑量治療組。各組均繼續(xù)喂以高脂高糖飼料 5 周，并每周測血糖。3.2 給藥第 8 周，各組動物開始灌胃給藥，每日一次，持續(xù) 5 周。給藥按人與大鼠體外表積比折算成等效劑量?？瞻捉M、模型對照組分別每日灌胃等劑量的生理鹽水；羅格列酮治療組每日灌以羅格列酮 0.36mg/kg 溶液；金匱腎氣丸

44、大、中、小劑量治療組分別每日灌以等體積金匱腎氣丸溶液 1600mg/kg、800 mg/kg、400mg/kg。3.3 標本采集與處理第 13 周，實驗結(jié)束前 1 天，用代謝籠收集 24h 尿液，記錄 24 小時尿量，混勻后留取 10ml 檢測尿白蛋白含量，并計算尿白蛋白排泄率。禁食不禁水 12h，腹腔注射 2%戊巴比妥鈉生理鹽水溶液 40mg/kg 麻醉，尾靜脈取血測血糖后，行股動脈取血后處死大鼠，取出相關(guān)臟器。將血液分成兩局部，一局部血液迅速參加裝有 40000U/ml 抑肽酶 20ul的冰冷試管中混勻，以 3500 rpm 離心 10 min，別離血漿，于-20冰箱內(nèi)保存以檢測ET 含量

45、。另一局部血液放在 37溫箱，使其充分凝固，然后置 4過夜，以 1500rpm21金匱腎氣丸對 2 型糖尿病腎病大鼠 IGF-1、ET 及心臟組織形態(tài)的影響離心 30 分鐘，吸取上部清亮的血清于-20冰箱內(nèi)保存以檢測檢測空腹血糖、血肌酐、血尿素氮、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白LDL、血清 IGF-1 指標。取大鼠心臟稱重，去除包膜后，長軸方向?qū)η?，?10%中性甲醛固定后，石蠟包埋切片。經(jīng)二甲苯脫蠟、酒精水化后，分別制成蘇木精-伊紅HE染色切片，于光學顯微鏡下觀察、攝片。3.4 檢測指標血糖使用血糖儀和血糖試紙取大鼠尾靜脈血測定；尿白蛋白檢測按照試劑

46、盒說明書，采用放射免疫法測定；血漿 ET 水平按放免分析試劑盒說明書使用 y 放射免疫計數(shù)儀測定； 血清 IGF-1 按照大鼠 Elisa-胰島素樣生長因子 1 試劑盒說明書操作后，使用酶標儀檢測。總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白LDL、血肌酐SCr、血尿素氮(BUN)均用酶比色法測定，全自動生化分析儀讀數(shù)。3.5 統(tǒng)計學處理采用 SPSS17.0 統(tǒng)計軟件處理。所有數(shù)據(jù)用 x s 表示。組間均數(shù)比擬采用單因素方差分析及 t 檢驗，P0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。22金匱腎氣丸對 2 型糖尿病腎病大鼠 IGF-1、ET 及心臟組織形態(tài)的影響4 實驗結(jié)果4

47、.1 金匱腎氣丸對 2 型糖尿病腎病大鼠給藥前后血糖的影響表 1 各組大鼠血糖比擬 x s見表 1 和圖 1組別空白組模型對照組N88給藥前空腹血糖5.140.4827.542.59給藥后空腹血糖5.290.6026.302.87羅格列酮組827.251.9718.152.65金匱腎氣大劑量組828.031.6518.142.21金匱腎氣中劑量組827.152.0523.253.22金匱腎氣小劑量組828.102.0124.383.60P0.01，P0.05；與給藥前比擬P0.05，PP30252015給藥前FPG給藥后FPG1050空白組模型組羅格列酮 金匱大劑 金匱中劑 金匱小劑圖 1 各

48、組大鼠血糖比擬由表 1 和圖 1 我們可以看出：給藥前，模型組及各治療組血糖較空白組顯著升高P0.01，說明高脂高糖飼料喂養(yǎng)與 STZ 腹腔注射造模后大鼠血糖明顯升高，模型成功。給藥后，與模型組血糖相比，羅格列酮組、金匱腎氣丸大劑量組血糖降低，有顯著性差異P0.01，說明金匱腎氣丸大劑量與羅格列酮降糖效果相當；金匱腎氣丸中劑量組血糖降低，差異有統(tǒng)計學意義P0.05；金匱腎氣丸小劑量組血糖與模型組相比沒有差異P0.05。與羅格列酮組比擬，金匱腎氣丸中、小劑量組血糖水平升高，差異有統(tǒng)計學意義P0.05，說明金匱腎氣丸的降糖作用存在劑量上的差異性，在本實驗中金匱腎氣丸大劑量的降糖效果最正確。23注：

49、與空白組相比擬P0.01；與模型組相比擬0.01；與羅格列酮組比擬 0.05。金匱腎氣丸對 2 型糖尿病腎病大鼠 IGF-1、ET 及心臟組織形態(tài)的影響4.2 金匱腎氣丸對 2 型糖尿病腎病大鼠血脂的影響見表 2 與圖 2表 2 各組大鼠血脂的比擬 x s組別空白組模型對照組羅格列酮組金匱腎氣大劑量N TG1.24250.334.89750.72TC4.57250.508.63750.72HDL-C1.47130.290.77630.16LDL-C2.22750.595.11750.97金匱腎氣中劑量0.84880.12金匱腎氣小劑量注：與空白組相比擬P0.01；與模型組相比擬P0.01，P0

50、.05；與羅格列酮組比擬P0.01，P0.05。987654321TGTCHDL-CLDL-C0空白組模型組羅格列酮金匱大劑金匱中劑金匱小劑圖 2 各組大鼠血脂的比擬表 2 和圖 2 可以看出，模型組血清 TG、TC、LDL-C 含量與空白組相比升高，HDL-C降低，差異有統(tǒng)計學意義P0.01。各治療組與模型組相比：TG 含量在羅格列酮組、金匱腎氣丸大、中、小劑量組均降低P0.01 或 P0.05，說明藥物降低大鼠血清TG 含量效果顯著；而金匱腎氣丸對于降低本指標尤為敏感，無論大、中、小劑量組差異均有統(tǒng)計學意義P0.01 或 P0.05。血清 TC、LDL-C 含量在羅格列酮組、金匱腎氣丸大、

51、中劑量組降低，差異有統(tǒng)計學意義P0.01 或 P0.05，說明藥物降低 TC、LDL-C 含量療效可靠；組間相比擬，羅格列酮組較金匱腎氣丸中、小劑量組血清 TC、LDL-C值降低P0.01，說明西藥羅格列酮比中成藥金匱腎氣丸藥效更顯著。與模型組相比，血清 HDL-C 含量僅在羅格列酮組、金匱腎氣丸大劑量組升高P0.01 或 P0.05，說明金匱腎氣丸改善大鼠血清 HDL-C 指標的效果略差于其它同類指標。從整體觀察，羅格242.13630.6785.44501.351.05500.193.10130.822.14500.5685.61500.950.98871.493.25380.8082.9

52、5500.9287.68000.734.27130.953.95250.9888.45750.490.84630.134.68130.72金匱腎氣丸對 2 型糖尿病腎病大鼠 IGF-1、ET 及心臟組織形態(tài)的影響列酮和金匱腎氣丸對于脂代謝紊亂都有改善作用，且羅格列酮治療組略優(yōu)于中藥治療組。此外，從數(shù)值上看金匱腎氣丸大劑量組比中、小劑量組降低血脂作用為好。4.3 金匱腎氣丸對 2 型糖尿病腎病大鼠血肌酐、尿素氮的影響 見表 3 與圖 3、圖 3-1表 3各組大鼠血肌酐、尿素氮的比擬 x s組別空白組模型對照組羅格列酮組金匱腎氣大劑量金匱腎氣中劑量金匱腎氣小劑量N888888SCr (umol/L

53、)57.08758.2898.06254.50BUN(mmol/L)5.31250.7511.4003.44P0.01，P0.05；與羅格列酮組比擬P0.05。1008060SCr4020SCr0空白組模型組羅格列酮金匱大劑金匱中劑金匱小劑圖 3 各組大鼠血肌酐的比擬BUN12108642BUN0空白組模型組羅格列酮金匱大劑金匱中劑金匱小劑圖 3-1各組大鼠尿素氮的比擬2577.925014.797.72502.0683.575013.798.07501.7686.32507.528.68751.8088.63759.0910.35003.01注：與空白組相比擬P0.01；與模型組相比擬金匱腎

54、氣丸對 2 型糖尿病腎病大鼠 IGF-1、ET 及心臟組織形態(tài)的影響從表 3 和圖 3、圖 3-1 可以看出，模型組血清 SCr、BUN 含量與空白組相比擬升高，差異有統(tǒng)計學意義P0.01。各治療組與模型組相比擬，血清 SCr、BUN 在羅格列酮組、金匱腎氣丸大、中劑量組降低P0.01 或 P0.05，說明藥物降低 SCr、BUN 療效顯著；組間相比擬，羅格列酮組較金匱腎氣丸小劑量組血清 SCr、BUN 降低，差異有統(tǒng)計學意義P0.05，說明西藥羅格列酮比中成藥金匱腎氣丸藥效更顯著?？傊?，羅格列酮和金匱腎氣丸均能降低大鼠血清 SCr、BUN 含量，從數(shù)值上看，羅格列酮效果略勝與金匱腎氣丸，且金

55、匱腎氣丸存在不同劑量療效存在差異。4.4 金匱腎氣丸對 2 型糖尿病腎病大鼠尿白蛋白排泄率的影響表 4 各組大鼠尿白蛋白排泄率的比擬 x s見表 4 與圖 4組別空白組模型對照組羅格列酮組金匱腎氣大劑量金匱腎氣中劑量金匱腎氣小劑量N888888尿白蛋白排泄率ug/min7.73750.9527.90002.7030252015105UAERP0.01，P0.05。UAER0空白組模型組羅格列酮 金匱大劑 金匱中劑 金匱小劑圖 4 各組大鼠尿白蛋白排泄率的比擬2622.77503.9021.40001.7524.68753.0825.13571.81注：與空白組相比擬P0.01；與模型組相比擬金

56、匱腎氣丸對 2 型糖尿病腎病大鼠 IGF-1、ET 及心臟組織形態(tài)的影響從表 4 和圖 4 可以看出，模型組與空白組相比擬 UAER 升高，差異有統(tǒng)計學意義P0.01。各治療組與模型組相比擬 UAER 均降低，差異有統(tǒng)計學意義P0.01 或 P0.05，說明兩種藥物均能降低 UAER,改善腎功能；而金匱腎氣丸降低 UAER 跟顯著，其大、中、小劑量組與模型組比擬均降低，差異有統(tǒng)計學意義P0.01 或 P0.05；從數(shù)值上看，金匱腎氣丸大劑量組的效果最有效。4.5 金匱腎氣丸對 2 型糖尿病腎病大鼠 IGF-1、ET 的影響見表 5 與圖 5、圖 5-1表 5各組大鼠 IGF-1、ET 的比擬

57、x s組別空白組模型對照組羅格列酮組金匱腎氣大劑量金匱腎氣中劑量金匱腎氣小劑量N888888IGF-1pg/ml5.34250.363941.86120.18879ETpg/ml49.99871.18690140.72883.01345P0.01；與羅格列酮組比擬P0.05；與金匱6543IGF-1210空白組模型組羅格列酮金匱大劑金匱中劑金匱小劑圖 5 各組大鼠 IGF-1 的比擬273.65500.23379114.51881.236693.40750.27814113.44502.269583.22130.20032114.89881.508113.18880.21108120.2800

58、1.71887注：與空白組相比擬P0.01；與模型組相比擬腎氣大、中劑量組比擬 P0.05。金匱腎氣丸對 2 型糖尿病腎病大鼠 IGF-1、ET 及心臟組織形態(tài)的影響圖 5-1 各組大鼠 ET 的比擬由表 5、圖 5 和圖 5-1 可以看出，與空白組比擬，各組 IGF-1 明顯降低，ET 均明顯升高P0.01；與模型組比擬，各治療組 IGF-1 均明顯升高，ET 明顯降低P0.01，說明兩種藥物均有升高 IGF-1，降低 ET 的作用；與羅格列酮組比擬，金匱腎氣大、中、小劑量組 IGF-1 均無明顯差異P0.05，說明二者對 IGF-1 的療效相當，且中藥劑量對療效影響不大；除金匱腎氣小劑量組

59、外，金匱腎氣大、中劑量組與羅格列酮組降低ET 療效相當，差異無統(tǒng)計學意義P0.05；與金匱腎氣大、中劑量組比擬，金匱腎氣小劑量組 ET 明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義P0.05。從數(shù)值上看，金匱腎氣大劑量組對降低 ET 水平效果最好，中藥對大鼠 ET 的影響具有量效關(guān)系。4.6 金匱腎氣丸對 2 型糖尿病腎病大鼠心臟組織形態(tài)的影響圖片見附錄一從心肌組織圖片可以看出，正常心臟組織細胞排列整齊，細胞形態(tài)未見異常；模型組可見肌纖維增粗，排列紊亂，細胞核腫脹；西藥組、中藥大、中劑量治療組肌纖維排列較整齊，細胞核腫脹不明顯；中藥小劑量組細胞核輕度腫脹，肌纖維增粗，排列輕度紊亂。因此，可以得出結(jié)論，金匱腎氣丸

60、可以改善細胞核腫脹及心肌纖維的增粗情況，它對于心臟組織形態(tài)改變具有一定的改善作用。28金匱腎氣丸對 2 型糖尿病腎病大鼠 IGF-1、ET 及心臟組織形態(tài)的影響5 討論5.1 模型評價目前, DN 的動物模型均由誘發(fā) DM 而來,而誘發(fā) DM 動物模型主要有四種方法：胰腺切除、用 STZ、四氧嘧啶等化學物質(zhì)誘導、自發(fā)性模型及轉(zhuǎn)基因模型等56 。本研究工程的造模，采用高脂、高糖飲食誘發(fā)胰島素抵抗，后給予低劑量(30mg/kg)STZ 溶液分 2 次左側(cè)下腹部注射。造模后連續(xù)三天測空腹血糖16.7mmol/L，尿糖定性+以上且尿量增加 1 倍以上為糖尿病模型形成。繼而計算尿白蛋白排泄率，以尿白蛋白