血清γ球蛋白的提純

1、會計學(xué)1血清血清球蛋白的提純球蛋白的提純1.1.掌握鹽析、凝膠層析、透析法分離純化蛋白質(zhì)掌握鹽析、凝膠層析、透析法分離純化蛋白質(zhì)的基本原理及操作；的基本原理及操作；2.2.掌握離心機(jī)的操作；掌握離心機(jī)的操作；3.3.熟悉蛋白質(zhì)定性檢測的方法；熟悉蛋白質(zhì)定性檢測的方法； （一）鹽（一）鹽 析析 法法定義：定義：加入大量中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的穩(wěn)定因素并加入大量中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的穩(wěn)定因素并 使從溶液中沉淀析出的現(xiàn)象。使從溶液中沉淀析出的現(xiàn)象。 原理原理: : 破壞蛋白質(zhì)兩個穩(wěn)定因素：水化膜和電荷層破壞蛋白質(zhì)兩個穩(wěn)定因素：水化膜和電荷層中性鹽：中性鹽：(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4、Na

2、Na2 2SOSO4 4、NaClNaCl等。等。優(yōu)點：優(yōu)點：蛋白質(zhì)不變性，常用。蛋白質(zhì)不變性，常用。（二二）透）透 析析 法法定義：定義：臨床應(yīng)用：臨床應(yīng)用：血液透析血液透析 （三三）層析法）層析法待分離物質(zhì)隨待分離物質(zhì)隨( (流動相流動相) )經(jīng)過一個固態(tài)經(jīng)過一個固態(tài)物質(zhì)物質(zhì)( (固定相固定相) )時，根據(jù)溶液中待分離物質(zhì)時，根據(jù)溶液中待分離物質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離蛋白組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同離蛋白組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同流速流經(jīng)固定相實現(xiàn)分離。流速流經(jīng)固定相實現(xiàn)分離。凝膠層析法凝膠層析法（四）離心技術(shù)（四）離心技術(shù) 離心技

3、術(shù)離心技術(shù) 是將含有微小顆粒的懸浮液置于離心是將含有微小顆粒的懸浮液置于離心轉(zhuǎn)子中，利用轉(zhuǎn)子繞軸旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力將微小顆轉(zhuǎn)子中，利用轉(zhuǎn)子繞軸旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力將微小顆粒按密度或質(zhì)量的差異將其分離的方法。粒按密度或質(zhì)量的差異將其分離的方法。沉降速度沉降速度(v) 指在強(qiáng)大的離心力作用下，單位時間內(nèi)物質(zhì)顆粒沿半指在強(qiáng)大的離心力作用下，單位時間內(nèi)物質(zhì)顆粒沿半徑方向運(yùn)動的距離。徑方向運(yùn)動的距離。 v=6.09210-4D2（m）n2r/m D 顆粒直徑顆粒直徑 顆粒的密度顆粒的密度m 介質(zhì)的密度介質(zhì)的密度m 介質(zhì)粘度介質(zhì)粘度 r 旋轉(zhuǎn)半徑（物質(zhì)質(zhì)點所處位置與旋轉(zhuǎn)中心的距離）旋轉(zhuǎn)半徑（物質(zhì)質(zhì)點所處位置與旋

4、轉(zhuǎn)中心的距離） N 轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速 人血清中幾種主要蛋白組分人血清中幾種主要蛋白組分血清蛋白質(zhì)血清蛋白質(zhì)等電點等電點分子量分子量占總蛋白的占總蛋白的清蛋白清蛋白 4.6469,0005772 1球蛋白球蛋白 5.06200,000252球蛋白球蛋白 5.06300,00049球蛋白球蛋白 5.1290,000150,0006.512球蛋白球蛋白 6.857.3 156,000950,0001220 【離心操作要領(lǐng)離心操作要領(lǐng)】1 1、根據(jù)待離心的溶液性質(zhì)及體積選擇合適的離心管。裝載液體時要按各種、根據(jù)待離心的溶液性質(zhì)及體積選擇合適的離心管。裝載液體時要按各種離心機(jī)操作說明進(jìn)行。無蓋離心管不能

5、裝的太滿。密封的或有蓋離心管離心機(jī)操作說明進(jìn)行。無蓋離心管不能裝的太滿。密封的或有蓋離心管常要求裝滿，以免離心管變形常要求裝滿，以免離心管變形。 2 2、精確地平衡離心管及其內(nèi)容物。、精確地平衡離心管及其內(nèi)容物。3 3、平衡后的離心管和內(nèi)容物（包括套筒）應(yīng)對稱放置、平衡后的離心管和內(nèi)容物（包括套筒）應(yīng)對稱放置4 4、啟動離心時離心速度由慢到快，當(dāng)?shù)竭_(dá)離心時間時，、啟動離心時離心速度由慢到快，當(dāng)?shù)竭_(dá)離心時間時， 開啟減速或速度調(diào)開啟減速或速度調(diào)節(jié)旋鈕減速。節(jié)旋鈕減速。（五五）檢測蛋白質(zhì)、檢測蛋白質(zhì)、 NH NH4 4+ +的方法的方法檢測蛋白質(zhì)檢測蛋白質(zhì) 雙二縮脲試劑：溶液顯紫紅色雙二縮脲試劑：

6、溶液顯紫紅色 2020磺柳酸磺柳酸 ：有白色沉淀產(chǎn)生：有白色沉淀產(chǎn)生檢測檢測NHNH4 4+ + 納氏試劑：黃色或棕色納氏試劑：黃色或棕色1. 1. 鹽鹽 析析2.2. 透透 析析3.3. 脫脫 鹽鹽4. 4. 檢檢 測測1.1.鹽析鹽析取離心管一支加入血清取離心管一支加入血清2ml加入加入2ml PBS搖勻搖勻逐滴加入逐滴加入pH7.2飽和飽和(NH4)2SO4 2ml,搖勻搖勻靜止靜止10分鐘，再離心（分鐘，再離心（2000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分）分）10分鐘分鐘上清液（主要含清蛋白上清液（主要含清蛋白）傾入試管中）傾入試管中沉淀用沉淀用1ml PBS攪拌溶解攪拌溶解逐滴加飽和逐滴加飽和(NH4)2SO

7、4 0.5ml,搖勻搖勻靜止靜止10分鐘，再離心（分鐘，再離心（2000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分）分）10分鐘分鐘傾棄上清液（主要含傾棄上清液（主要含、球蛋白）球蛋白）沉淀即為初步純沉淀即為初步純化的化的球蛋白球蛋白脫脫 鹽鹽透析透析2.2.透透 析析清蛋白清蛋白 換換 水水透析袋未放入水中時透析袋未放入水中時, ,立立即取水中液體檢查有無即取水中液體檢查有無NHNH4 4；放入水中后，每隔放入水中后，每隔4 4分鐘分鐘檢查一次，共檢查一次，共3 3次，比較次，比較NHNH4 4透出的情況。透出的情況。 約約0.50.5小時，檢查袋外液體的小時，檢查袋外液體的NHNH4 4；取袋外液取袋外液2 2滴，置于小試

8、管中，然后滴加滴，置于小試管中，然后滴加2020磺柳酸磺柳酸1212滴，觀察有無沉淀產(chǎn)生。滴，觀察有無沉淀產(chǎn)生。3.3.脫鹽脫鹽上樣上樣球蛋白，球蛋白，PBS 10PBS 10滴溶解滴溶解 加入洗脫劑加入洗脫劑PBS 1020ml 裝柱裝柱 葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠G25，柱，柱 高高1/22/3柱長，柱長，玻璃柱玻璃柱標(biāo)識的標(biāo)識的200處。處。流速：每分鐘流速：每分鐘10滴左右滴左右 收集收集20滴滴換一換一支試管支試管 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10每組兩塊比色板每組兩塊比色板, ,洗凈備用。洗凈備用。一塊在各孔滴加納氏試劑（檢測一塊在各孔滴加納氏試劑（檢測NHNH4 4+ +）,

9、,另一塊滴加雙二縮脲試劑（檢測蛋白質(zhì)另一塊滴加雙二縮脲試劑（檢測蛋白質(zhì)）。若發(fā)現(xiàn)有顯色反應(yīng)此孔顯色劑棄用。）。若發(fā)現(xiàn)有顯色反應(yīng)此孔顯色劑棄用。不用滴管不用滴管, ,避免污染避免污染, ,直接用試管倒直接用試管倒用用“- -”表示無現(xiàn)象，用表示無現(xiàn)象，用“+ +”, , “+”, , “+”等表示顏色深淺等表示顏色深淺 回收凝膠回收凝膠.層析后洗脫液檢測【表表1. 層析后洗脫液的顯色結(jié)果層析后洗脫液的顯色結(jié)果表表2. 透析后的袋外溶液顯色結(jié)果透析后的袋外溶液顯色結(jié)果試管編號試管編號12345678910縮二脲試劑縮二脲試劑檢測后現(xiàn)象檢測后現(xiàn)象納氏試劑檢納氏試劑檢測后現(xiàn)象測后現(xiàn)象檢測次數(shù)檢測次數(shù)1

10、23456試試 劑劑納氏試劑納氏試劑納氏試劑納氏試劑納氏試劑納氏試劑納氏試劑納氏試劑納氏試劑納氏試劑20%磺柳酸磺柳酸現(xiàn)現(xiàn) 象象棕色（棕色（+）. .使用離心機(jī)的操作注意事項。使用離心機(jī)的操作注意事項。. .裝柱時檢查旋鈕是否旋緊，是否漏水。裝柱時檢查旋鈕是否旋緊，是否漏水。. .裝柱后凝膠均一無斷層，無氣泡，柱床面平整。柱床面保持有緩沖液。裝柱后凝膠均一無斷層，無氣泡，柱床面平整。柱床面保持有緩沖液。. .層析加樣時動作緩慢輕柔，不要破壞柱床面的平整。層析加樣時動作緩慢輕柔，不要破壞柱床面的平整。 . .層析時，先用層析時，先用專用移液管專用移液管將將PBSPBS移到小燒杯中，然后再用巴氏滴

11、管在層析柱上端加緩沖溶移到小燒杯中，然后再用巴氏滴管在層析柱上端加緩沖溶液。液。. .每用一次滴管，請用水清洗干凈，防止試劑及被測樣每用一次滴管，請用水清洗干凈，防止試劑及被測樣品交叉污染品交叉污染金式法測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶酶活性金式法測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶酶活性下次預(yù)習(xí)要點下次預(yù)習(xí)要點 【離心操作要領(lǐng)離心操作要領(lǐng)】1 1、根據(jù)待離心的溶液性質(zhì)及體積選擇合適的離心管。裝載液體時要按各種、根據(jù)待離心的溶液性質(zhì)及體積選擇合適的離心管。裝載液體時要按各種離心機(jī)操作說明進(jìn)行。無蓋離心管不能裝的太滿。密封的或有蓋離心管離心機(jī)操作說明進(jìn)行。無蓋離心管不能裝的太滿。密封的或有蓋離心管常要求裝滿，以免離心管變形常要

12、求裝滿，以免離心管變形。 2 2、精確地平衡離心管及其內(nèi)容物。、精確地平衡離心管及其內(nèi)容物。3 3、平衡后的離心管和內(nèi)容物（包括套筒）應(yīng)對稱放置、平衡后的離心管和內(nèi)容物（包括套筒）應(yīng)對稱放置4 4、啟動離心時離心速度由慢到快，當(dāng)?shù)竭_(dá)離心時間時，、啟動離心時離心速度由慢到快，當(dāng)?shù)竭_(dá)離心時間時， 開啟減速或速度調(diào)開啟減速或速度調(diào)節(jié)旋鈕減速。節(jié)旋鈕減速。. .使用離心機(jī)的操作注意事項。使用離心機(jī)的操作注意事項。. .裝柱時檢查旋鈕是否旋緊，是否漏水。裝柱時檢查旋鈕是否旋緊，是否漏水。. .裝柱后凝膠均一無斷層，無氣泡，柱床面平整。柱床面保持有緩沖液。裝柱后凝膠均一無斷層，無氣泡，柱床面平整。柱床面保持有緩沖液。. .層析加樣時動作緩慢輕柔，不要破壞柱床面的平整。層析加樣時動作緩慢輕柔，不要破壞柱床面的