第二章 谷氨酸發(fā)酵

1、 第二章第二章 谷氨酸發(fā)酵谷氨酸發(fā)酵n氨基酸的制造是從1820 年水解蛋白質(zhì)開(kāi)始。n1866 年德國(guó)的立好生博士利用硫酸水解小麥面筋，分離出一種酸性氨基酸，依據(jù)原料的取材，便將此氨基酸命名為谷氨酸。n隨后，日本有一教授在探討海帶汁液的鮮味時(shí)，提取了谷氨酸，并在1908 年開(kāi)始制造商品味之素味精。1910 年日本味之素公司用水解法生產(chǎn)谷氨酸，與食鹽配合出售。但是這種方法生產(chǎn)谷氨酸耗糧太多，成本太高。n二次世界大戰(zhàn)后不久，美國(guó)有人提出用發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酸的報(bào)告。n日本也相繼開(kāi)始了研究，1956 年日本協(xié)和發(fā)酵公司分離出一種新的細(xì)菌，它可以利用100 克葡萄糖轉(zhuǎn)化為40 克以上的谷氨酸。1957 19

2、57 年發(fā)酵法味精正年發(fā)酵法味精正式商業(yè)性生產(chǎn)，這標(biāo)志著氨基酸發(fā)酵工業(yè)的誕生。式商業(yè)性生產(chǎn)，這標(biāo)志著氨基酸發(fā)酵工業(yè)的誕生。氨基酸的制備方法氨基酸的制備方法n發(fā)酵法發(fā)酵法：發(fā)酵法又可分為直接發(fā)酵法與添加前體的發(fā)酵法。添加前體法是以氨基酸的中間產(chǎn)物為原料，用微生物法轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的氨基酸。n提取法提取法：將蛋白質(zhì)原料用酸水解，然后從水解液中提取氨基酸。目前，胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸仍用提取法生產(chǎn)。n酶法酶法：利用微生物細(xì)胞或微生物產(chǎn)生的酶來(lái)制造氨基酸。n合成法合成法：用化學(xué)合成法制造的氨基酸有DL-蛋氨酸、DL-丙氨酸，甘氨酸和苯丙氨酸。 n生產(chǎn)氨基酸的大國(guó)為日本和德國(guó)。生產(chǎn)氨基酸的大國(guó)為日本和德國(guó)。

3、n日本的味之素、協(xié)和發(fā)酵及德國(guó)的德固沙是世界氨基酸生產(chǎn)的三巨頭。它們能生產(chǎn)高品質(zhì)的氨基酸,可直接用于輸液制劑的生產(chǎn)。n日本在美國(guó)、法國(guó)等建立了合資的氨基酸生產(chǎn)廠(chǎng)家,生產(chǎn)氨基酸和天冬甜精等衍生物。 n國(guó)內(nèi)生產(chǎn)氨基酸的廠(chǎng)家主要是天津氨基酸公司,湖北八峰氨基酸公司,但目前無(wú)論生產(chǎn)規(guī)模及產(chǎn)品質(zhì)量還難于與國(guó)外抗衡。n在80年代中后期,我國(guó)從日本的味之素、協(xié)和發(fā)酵以技貿(mào)合作的方式引進(jìn)輸液制劑的制造技術(shù)和仿造產(chǎn)品,1991年銷(xiāo)售量為二千萬(wàn)瓶,1996年達(dá)六千萬(wàn)瓶,主要廠(chǎng)家有無(wú)錫華瑞,北京費(fèi)森尤斯,昆明康普萊特,但生產(chǎn)原料都依賴(lài)進(jìn)口。n2000年,世界氨基酸產(chǎn)值達(dá)45億美元,占生物技術(shù)市場(chǎng)的7%,國(guó)內(nèi)的氨基酸

4、產(chǎn)值達(dá)40億元,占全國(guó)發(fā)酵產(chǎn)業(yè)總產(chǎn)值的12%。 一、氨基酸發(fā)酵一、氨基酸發(fā)酵n氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本成分，其中有8種氨基酸是人體不能合成但又必需的氨基酸，稱(chēng)為必需氨基酸，人體只有通過(guò)食物來(lái)獲得。n另外在食品工業(yè)中，氨基酸可作為調(diào)味料，如谷氨酸鈉、肌苷酸鈉、鳥(niǎo)苷酸鈉可作為鮮味劑，色氨酸和甘氨酸可作為甜味劑，n在食品中添加某些氨基酸可提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等等。因此氨基酸的生產(chǎn)具有重要的意義。n表1列出部分氨基酸生產(chǎn)所用的菌株。 氨基酸氨基酸使用的菌株使用的菌株谷氨酸谷氨酸谷氨酸棒桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌或黃色短菌桿、谷氨酸棒桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌或黃色短菌桿、北京棒桿菌、鈍齒棒桿菌北京棒桿菌、鈍齒棒桿菌纈氨

5、酸纈氨酸北京棒桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌北京棒桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌丙氨酸丙氨酸凝結(jié)芽孢桿菌凝結(jié)芽孢桿菌脯氨酸脯氨酸鏈形寇氏桿菌鏈形寇氏桿菌、黃色短桿菌、黃色短桿菌賴(lài)氨酸賴(lài)氨酸黃色短桿菌黃色短桿菌、乳糖發(fā)醇短桿菌、乳糖發(fā)醇短桿菌、谷氨酸棒桿菌、谷氨酸棒桿菌蘇氨酸蘇氨酸大腸桿菌、大腸桿菌大腸桿菌、大腸桿菌鳥(niǎo)氨酸鳥(niǎo)氨酸谷氨酸棒桿菌谷氨酸棒桿菌、黃色短桿菌、黃色短桿菌亮氨酸亮氨酸黃色短桿菌黃色短桿菌酪氨酸酪氨酸氨酸棒桿菌氨酸棒桿菌表表1 1部分氨基酸及其生產(chǎn)所用菌株部分氨基酸及其生產(chǎn)所用菌株 氨基酸發(fā)酵是典型的氨基酸發(fā)酵是典型的代謝控制發(fā)酵代謝控制發(fā)酵 以谷氨酸為例，以谷氨酸為例，谷氨酸的大量積累不谷氨酸的

6、大量積累不是由于生物合成途徑的特異，而是菌體代是由于生物合成途徑的特異，而是菌體代謝謝調(diào)節(jié)控制調(diào)節(jié)控制和和細(xì)胞膜通透性細(xì)胞膜通透性的特異調(diào)節(jié)以的特異調(diào)節(jié)以及及發(fā)酵條件發(fā)酵條件的適合。的適合。n自從60年代以來(lái)，微生物直接用糖類(lèi)發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸獲得成功并投入工業(yè)化生產(chǎn)。我國(guó)成為世界上最大的味精生產(chǎn)大國(guó)。味精成為調(diào)味品的重要成員之一，氨基酸的研究和生產(chǎn)得到了迅速發(fā)展。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，對(duì)傳統(tǒng)的工藝不斷地進(jìn)行改革。n如何保持傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的特有風(fēng)味，從而使新工新工藝生產(chǎn)出的產(chǎn)品更具魅力藝生產(chǎn)出的產(chǎn)品更具魅力，是今后研究的課題。 味精的產(chǎn)品特性味精的產(chǎn)品特性 味精,也稱(chēng)味素,因味精起源于小麥,俗稱(chēng)麩酸鈉

7、、谷氨酸鈉（分子式C5H8NO4Na ） 。 味精是無(wú)色至白色的柱狀結(jié)晶或白色結(jié)晶性粉末,含一分子結(jié)晶水，無(wú)氣味，易溶于水，微溶于乙醇，無(wú)吸濕性，對(duì)光穩(wěn)定，中性條件下水溶液加熱也不分解，一般情況下無(wú)毒性。有很濃的鮮味,味精被食用后,經(jīng)胃酸作用轉(zhuǎn)化為谷氨酸,被消化吸收構(gòu)成蛋白質(zhì)并參與體內(nèi)其他代謝過(guò)程,有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。味精的使用是否安全？味精的使用是否安全？ 自從1968年以來(lái)，有關(guān)谷氨酸的研究報(bào)告超過(guò)8,000份。 自1970年起與 的聯(lián)合食品專(zhuān)家委員會(huì)，就味精的安全性加以慎重研討，認(rèn)為一般人味精攝取量可以達(dá)到一天0.12公克/公斤體重。 此即表示體重50公斤的人，每天即使食用高達(dá)6公克的味精

8、，。 19871987年年, ,聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和和世世界衛(wèi)生組織界衛(wèi)生組織宣布宣布, ,取消對(duì)味精的食用取消對(duì)味精的食用限量限量, , 作為一種增加食品風(fēng)味的調(diào)味作為一種增加食品風(fēng)味的調(diào)味料料, ,味精不再需要評(píng)價(jià)其每日容許攝入味精不再需要評(píng)價(jià)其每日容許攝入量量, ,消費(fèi)者可以放心食用味精。消費(fèi)者可以放心食用味精。味精的使用是否安全？味精的使用是否安全？ 味精安全性報(bào)告味精安全性報(bào)告 美國(guó)食品藥物管理局（美國(guó)食品藥物管理局（FDAFDA）在1995年8月31日公布一份最新的報(bào)告，結(jié)論是： 這份報(bào)告是美國(guó)食品藥物管理局（FDA）委托獨(dú)立的科學(xué)研究機(jī)構(gòu)美國(guó)實(shí)驗(yàn)生物學(xué)學(xué)會(huì)聯(lián)盟（FASE

9、B）進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)三年的研究評(píng)估后得出的。報(bào)告。 還味精一個(gè)清白還味精一個(gè)清白 的研究報(bào)告，解除消費(fèi)者的疑慮，澄清了一般人對(duì)味精的誤解，也使科學(xué)家改變研究態(tài)度，而能從正面的角度來(lái)思考味精這一種廣泛被使用的調(diào)味料，到底對(duì)人體有哪些重要性，這是二十一世紀(jì)的一個(gè)重要研究課題。 味精對(duì)人體的重要性味精對(duì)人體的重要性 1、生物化學(xué)的研究顯示，味精中的谷氨酸是生物體內(nèi)氨基酸和碳水化合物。2、美國(guó)Reeds博士的最新研究發(fā)現(xiàn)，飲食中的谷氨酸進(jìn)入消化道時(shí)，提供消化道表面細(xì)胞代謝所需的大部分能量，也提供其所需的材料。3、Schiffman教授的研究證實(shí)，食物中添加味精可以增加正常老人和患病老人的，也顯著地改善營(yíng)養(yǎng)狀況

10、和身體免疫力。 中國(guó)味精產(chǎn)量走勢(shì)中國(guó)味精產(chǎn)量走勢(shì) 萬(wàn)噸中國(guó)味精業(yè)空間巨大中國(guó)味精業(yè)空間巨大 2001年?yáng)|南亞地區(qū)味精人均消費(fèi)量：臺(tái)灣：2000克韓國(guó)：1200克日本：1020克香港：1000克中國(guó)大陸：500克 中國(guó)味精消費(fèi)每年至少有160160萬(wàn)噸萬(wàn)噸的空間 作為調(diào)味品的市售味精，為干燥顆?；蚍勰蚝欢康氖雏}而稍有吸濕性，故應(yīng)密封防潮貯存。商品味精中的谷氨酸鈉含量分別有90、80、70、60等不同規(guī)格。以80最為常見(jiàn)，其余為精鹽。食鹽起助鮮作用兼作填充劑。也有不含鹽的顆粒較大的“結(jié)晶味精”。谷氨酸生產(chǎn)谷氨酸生產(chǎn)n工業(yè)化生產(chǎn)開(kāi)始于由水解小麥面筋或大豆蛋白質(zhì)n1957年，日本率先采用微生物

11、發(fā)酵法生產(chǎn)，并投入大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，這是被譽(yù)為現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)的重大創(chuàng)舉，使發(fā)酵工業(yè)進(jìn)入調(diào)節(jié)代謝的調(diào)控階段。n目前世界產(chǎn)谷氨酸鈉30萬(wàn)噸/年，占氨基酸總量的2/3。n我國(guó)現(xiàn)已有200余家生產(chǎn)，年產(chǎn)量達(dá)15萬(wàn)噸，居世界首位。谷氨酸理論轉(zhuǎn)化率谷氨酸理論轉(zhuǎn)化率n如果四碳二羧酸(草酰乙酸、蘋(píng)果酸)全部由CO2固定獲得,則1摩爾葡萄糖生成1摩爾的谷氨酸.n C6H12O6+NH3+1.5O2C5H9O4+CO2+3H2On 理論轉(zhuǎn)化率=147/180=81.7%谷氨酸產(chǎn)生菌的主要特征谷氨酸產(chǎn)生菌的主要特征1. -酮戊二酸氧化能力微弱: -酮戊二酸脫氫酶喪失或活性低.2. 谷氨酸脫氫酶活性強(qiáng).3. 還原性輔酶

12、(NADPH+H+)進(jìn)入呼吸鏈能力缺陷或微弱.4. 異檸檬酸裂解酶活力微弱.5. 不利用谷氨酸.6. 耐高糖耐高谷氨酸 .7. CO2固定能力強(qiáng).8 .解除谷氨酸反饋抑制.9. 具有向胞外分泌谷氨酸的能力.谷氨酸生產(chǎn)菌細(xì)胞膜的通透性谷氨酸生產(chǎn)菌細(xì)胞膜的通透性n通過(guò)用能積累谷氨酸菌株做實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：谷，結(jié)果表明：谷氨酸的分泌是由細(xì)胞膜控制氨酸的分泌是由細(xì)胞膜控制n控制細(xì)胞膜通透性的方法：控制細(xì)胞膜通透性的方法：1. 1.控制磷脂的合成；控制磷脂的合成；2.2.控制細(xì)胞壁的合成；選育溫敏突變株控制細(xì)胞壁的合成；選育溫敏突變株 （1 1）生物素營(yíng)養(yǎng)缺陷型）生物素營(yíng)養(yǎng)缺陷型n作用機(jī)制作用機(jī)制: :生

13、物素是脂肪酸生物合成最初反應(yīng)的關(guān)鍵生物素是脂肪酸生物合成最初反應(yīng)的關(guān)鍵酶酶乙酰乙酰CoACoA羧化酶羧化酶的輔酶的輔酶, ,參與了脂肪酸的合成參與了脂肪酸的合成, ,進(jìn)而進(jìn)而影響脂肪酸的合成影響脂肪酸的合成. .當(dāng)磷脂合成量少到正常的當(dāng)磷脂合成量少到正常的1/21/2左右左右時(shí)時(shí), ,細(xì)胞變形細(xì)胞變形, ,GluGlu向膜外泄漏向膜外泄漏. .n控制關(guān)鍵控制關(guān)鍵: :使用該類(lèi)突變株必須限制發(fā)酵培養(yǎng)基中生使用該類(lèi)突變株必須限制發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素物素亞適量亞適量(5-10(5-10 g/L).g/L).在發(fā)酵初期在發(fā)酵初期(0-8(0-8小時(shí)小時(shí)), ),細(xì)胞正細(xì)胞正常生長(zhǎng)常生長(zhǎng), ,當(dāng)生物素耗盡

14、后當(dāng)生物素耗盡后, ,在菌的再次倍增時(shí)在菌的再次倍增時(shí), ,開(kāi)始出現(xiàn)開(kāi)始出現(xiàn)異常形態(tài)細(xì)胞異常形態(tài)細(xì)胞, ,即完成了細(xì)胞從生長(zhǎng)型到積累型轉(zhuǎn)換即完成了細(xì)胞從生長(zhǎng)型到積累型轉(zhuǎn)換. .突變株突變株 （2 2）油酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型）油酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型n作用機(jī)制作用機(jī)制: :油酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型喪失了合成油酸的能力油酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型喪失了合成油酸的能力, ,通過(guò)控制油酸使磷脂合成量減少到正常量的通過(guò)控制油酸使磷脂合成量減少到正常量的1/21/2左左右右. .n控制關(guān)鍵控制關(guān)鍵: :保證在培養(yǎng)基中油酸保證在培養(yǎng)基中油酸亞適量亞適量, ,完成細(xì)胞完成細(xì)胞從生長(zhǎng)型到生產(chǎn)型的轉(zhuǎn)換從生長(zhǎng)型到生產(chǎn)型的轉(zhuǎn)換. .其他其他 （3 3）添加表

15、面活性劑）添加表面活性劑n添加添加表面活性劑表面活性劑( (如吐溫如吐溫60)60)或或不飽和脂肪酸不飽和脂肪酸(C16-18),(C16-18),也能造成細(xì)胞滲漏也能造成細(xì)胞滲漏, ,積累谷氨酸積累谷氨酸. .n機(jī)理機(jī)理: :兩者在脂肪酸合成時(shí)兩者在脂肪酸合成時(shí)對(duì)生物素對(duì)生物素有有拮抗拮抗作用作用, ,導(dǎo)致導(dǎo)致磷脂磷脂合成不足合成不足, ,形成不完整的細(xì)胞膜形成不完整的細(xì)胞膜. .n關(guān)鍵關(guān)鍵: :控制好脂肪酸或表面活性劑的時(shí)間和濃度控制好脂肪酸或表面活性劑的時(shí)間和濃度, ,必須在藥劑加入后必須在藥劑加入后, ,在這些藥劑存在下進(jìn)行分裂在這些藥劑存在下進(jìn)行分裂, ,形成產(chǎn)酸型細(xì)胞形成產(chǎn)酸型細(xì)胞

16、. .其他 （4 4）添加青霉素）添加青霉素n機(jī)理機(jī)理: :青霉素抑制谷氨酸生產(chǎn)菌細(xì)胞壁后期的合青霉素抑制谷氨酸生產(chǎn)菌細(xì)胞壁后期的合成成, ,細(xì)胞膜在失去保護(hù)細(xì)胞膜在失去保護(hù), ,在滲透壓的作用下受損在滲透壓的作用下受損, ,向向外泄露谷氨酸外泄露谷氨酸. .n控制關(guān)鍵控制關(guān)鍵: :一般在進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的早期一般在進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的早期(3-6(3-6小小時(shí)時(shí)) )添加添加. .添加青霉素后倍增的菌體不能合成完整添加青霉素后倍增的菌體不能合成完整的細(xì)胞壁的細(xì)胞壁, ,完成細(xì)胞功能的轉(zhuǎn)換完成細(xì)胞功能的轉(zhuǎn)換. . 其他谷氨酸發(fā)酵強(qiáng)制控制工藝谷氨酸發(fā)酵強(qiáng)制控制工藝n為了穩(wěn)產(chǎn)為了穩(wěn)產(chǎn), ,克服培養(yǎng)基原料

17、中某些成分不易控制帶來(lái)克服培養(yǎng)基原料中某些成分不易控制帶來(lái)的影響的影響, ,在谷氨酸發(fā)酵時(shí)可采取在谷氨酸發(fā)酵時(shí)可采取“強(qiáng)制控制強(qiáng)制控制”的方法的方法, ,如如: :“高生物素高生物素 高吐溫高吐溫”或或“高生物素高生物素 高青霉素高青霉素”的的方法方法. .n控制方法控制方法: :在發(fā)酵培養(yǎng)基中預(yù)先配加一定量在發(fā)酵培養(yǎng)基中預(yù)先配加一定量( (過(guò)量過(guò)量) )的的純生物素純生物素, ,大大地削弱每批原料中生物素含量變化的大大地削弱每批原料中生物素含量變化的影響影響, ,高生物素、大接種量能促進(jìn)菌體迅速增殖高生物素、大接種量能促進(jìn)菌體迅速增殖. .再在再在菌體倍增的早期加入相對(duì)高的吐溫或青霉素菌體倍

18、增的早期加入相對(duì)高的吐溫或青霉素, ,形成產(chǎn)形成產(chǎn)酸型細(xì)胞酸型細(xì)胞. .固定其它條件固定其它條件, ,確保高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)。確保高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)。其他谷氨酸發(fā)酵谷氨酸發(fā)酵n1. 1.適應(yīng)期適應(yīng)期: :尿素分解出氨使尿素分解出氨使pHpH上升上升. .糖不利用糖不利用.2-4h.2-4h.措施措施: :接種量和發(fā)酵條件控制使接種量和發(fā)酵條件控制使適應(yīng)期縮短適應(yīng)期縮短. .n2.2.對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期: :糖耗快糖耗快, ,尿素大量分解使尿素大量分解使pHpH上升上升, ,氨被氨被利用利用pHpH又迅速下降又迅速下降. .溶氧急劇下降后維持在一定水平溶氧急劇下降后維持在一定水平. .菌體濃度迅速增大菌體濃度迅速

19、增大, ,菌體形態(tài)菌體形態(tài)為排列整齊的八字形為排列整齊的八字形. .不不產(chǎn)酸產(chǎn)酸.12h.12h.措施措施: :及時(shí)供給菌體生長(zhǎng)必須的氮源及調(diào)節(jié)及時(shí)供給菌體生長(zhǎng)必須的氮源及調(diào)節(jié)pH,pH,在在pH7.5-8.0pH7.5-8.0時(shí)流加尿素時(shí)流加尿素; ;維持溫度維持溫度30- 3230- 32谷氨酸發(fā)酵谷氨酸發(fā)酵n3.3.菌體生長(zhǎng)停止期菌體生長(zhǎng)停止期: :谷氨酸合成谷氨酸合成. .措施措施: :提供必須的氨及提供必須的氨及pHpH維持在維持在7.2-7.4.7.2-7.4.大量通大量通* * *, ,控制溫度控制溫度34-37 .34-37 .n4.4.發(fā)酵后期發(fā)酵后期: :菌體衰老菌體衰老,

20、 ,糖耗慢糖耗慢, ,殘?zhí)堑蜌執(zhí)堑? .措施措施: :營(yíng)養(yǎng)物耗盡酸濃度不增加時(shí)營(yíng)養(yǎng)物耗盡酸濃度不增加時(shí), ,及時(shí)放罐及時(shí)放罐. .發(fā)酵周期一般為發(fā)酵周期一般為30h.30h.* * * 某醋廠(chǎng)轉(zhuǎn)產(chǎn)用谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸，結(jié)果代謝產(chǎn)物沒(méi)有某醋廠(chǎng)轉(zhuǎn)產(chǎn)用谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸，結(jié)果代謝產(chǎn)物沒(méi)有谷氨酸而產(chǎn)生了乳酸及琥珀酸，其原因是：溶氧不足谷氨酸而產(chǎn)生了乳酸及琥珀酸，其原因是：溶氧不足谷氨酸發(fā)酵谷氨酸發(fā)酵n谷氨酸除用于制造味精外還可用于治療神經(jīng)衰弱及配制營(yíng)養(yǎng)注射液，應(yīng)用前景廣泛。二、谷氨酸發(fā)酵的生化過(guò)程n（1）是代謝控制發(fā)酵的典型代表n（2）是目前代謝控制發(fā)酵中，在理論與實(shí)踐上最成熟的n

21、整個(gè)過(guò)程可簡(jiǎn)單的分為2 個(gè)階段: 第1階段是菌體生長(zhǎng)階段;第2階段是產(chǎn)酸階段,谷氨酸得以大量積累。 三、合成谷氨酸的生化途徑生化途徑葡萄糖丙酮酸草酰乙酸檸檬酸琥珀酸透過(guò)細(xì)胞膜異檸檬酸- 酮戊二酸谷氨酸谷氨酸（一）、GA 的生物合成途徑n主要有：Glucose的酵解，EMP Glucose的有氧氧化，HMP 丙酮酸的有氧氧化，TCA循環(huán) 乙醛酸循環(huán)途徑，DCA循環(huán) CO2固定反應(yīng) -酮戊二酸（酮戊二酸（ -KGA）的還原氨基化 n 這6條途徑之間是相互聯(lián)系和相互制約的，如圖所示：C6H12O6HMP3-磷酸甘油醛丙酮酸乙酰輔酶ACO2草酰乙酸檸檬酸蘋(píng)果酸異檸檬酸延胡索酸琥珀酸NADPH-KGAN

22、ADPHNH4+谷氨酸乳酸GA GA 的生物合成途徑的生物合成途徑乙酰輔酶A乙醛酸循環(huán)乙醛酸循環(huán)乙醛酸EMPTCA谷氨酸谷氨酸CO2固定固定透透過(guò)過(guò)細(xì)細(xì)胞胞膜膜-KGA的還原氨基化的還原氨基化（二）、GA生物合成的內(nèi)在因素內(nèi)在因素n從上圖可以看出，菌體要在葡萄糖含量10%以上的培養(yǎng)基上，合成5%以上的谷氨酸，是一種不正常的現(xiàn)象，顯然GA產(chǎn)生菌必須具備以下條件：谷氨酸生產(chǎn)菌的生化特征谷氨酸生產(chǎn)菌的生化特征內(nèi)在因素內(nèi)在因素 n1 生物素缺陷型生物素缺陷型n谷氨酸產(chǎn)生菌大多數(shù)為生物素缺陷型,谷氨酸發(fā)酵時(shí),通過(guò)控制生物素亞適量(貧乏量) ,引起菌種代謝失調(diào), 使谷氨酸得到大量積累。n2 具有具有CO2

23、 固定反應(yīng)的酶系固定反應(yīng)的酶系n菌種能利用CO2 產(chǎn)生大量草酰乙酸, 有利于谷氨酸的大量積累。3.-KGA脫氫酶酶活性微弱或喪失脫氫酶酶活性微弱或喪失n這是菌體生成并積累-KGA的關(guān)鍵，從上圖可以看出，-KGA是菌體進(jìn)行TCA循環(huán)的中間性產(chǎn)物，很快在-KGA脫氫酶的作用下氧化脫羧生成琥珀酸輔酶A，在正常的微生物體內(nèi)他的濃度很低，也就是說(shuō)，由-KGA進(jìn)行還原氨基化生成GA的可能性很少。只有當(dāng)體內(nèi)體內(nèi)-KGA-KGA脫氫酶活性很低時(shí)，脫氫酶活性很低時(shí)，TCATCA循環(huán)才循環(huán)才能夠停止，能夠停止，-KGA-KGA才得以積累，為谷氨酸的才得以積累，為谷氨酸的生成奠定物質(zhì)基礎(chǔ)生成奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。4. GA

24、產(chǎn)生菌體內(nèi)的產(chǎn)生菌體內(nèi)的NADPH氧化能力欠氧化能力欠缺或喪失缺或喪失n（1）如上圖所示，NADPH是-KGA-KGA還原氨基還原氨基化化生成GA必須物質(zhì)，而且該還原氨基化所需要的NADPH是與檸檬酸氧化脫羧相偶聯(lián)相偶聯(lián) 的。n（2）由于NADPH的在氧化能力欠缺或喪失，使得體內(nèi)的NADPH有一定的積累，NADPH對(duì)于抑制-KGA的脫羧氧化有一定的意義。5. 產(chǎn)生菌體內(nèi)乙醛酸循環(huán)（產(chǎn)生菌體內(nèi)乙醛酸循環(huán)（DCA）的關(guān)鍵酶的關(guān)鍵酶異檸檬酸裂解酶異檸檬酸裂解酶n該酶是一種調(diào)節(jié)酶，或稱(chēng)為別構(gòu)酶別構(gòu)酶，其活性可以通過(guò)某種方式進(jìn)行調(diào)節(jié)，通過(guò)該酶酶活性的調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)DCA循環(huán)的封閉，。糖的代謝才能沿著- 酮戊

25、二酸的方向進(jìn)行, 從而有利于谷氨酸的積累。6.菌體有強(qiáng)烈的菌體有強(qiáng)烈的L-谷氨酸脫氫酶活性谷氨酸脫氫酶活性n-KGA + NH4+ +NADPH = GA + NADP (NADH :煙酰胺腺嘌呤二核苷酸；NADPH :煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸) nL-谷氨酸脫氫酶，實(shí)質(zhì)上GA產(chǎn)生菌體內(nèi)該酶的酶活性都很強(qiáng)， - 酮戊二酸易生成谷氨酸。n該反應(yīng)的關(guān)鍵是與異檸檬酸脫羧氧化相偶聯(lián)，反應(yīng)機(jī)制如下：n偶聯(lián)反應(yīng)偶聯(lián)反應(yīng) -KGA NADPH -KGA GA NADP 異檸檬酸L-谷氨酸脫氫酶谷氨酸脫氫酶異檸檬酸脫羧氧化異檸檬酸脫羧氧化（三）、（三）、GA 生物合成的生物合成的最理想途徑最理想途徑n1. 在

26、前述GA 合成所必需的條件的基礎(chǔ)上（，封閉乙醛酸循環(huán)）體系不存在CO2固定反應(yīng)，則有：n3/2 C6H12O6 + NH4+ C5H9NO4 + 4 CO2 n產(chǎn)率：147 /（180*3/2） = 54.4% 3/2GlucoseEMP丙酮酸丙酮酸+丙酮酸丙酮酸+丙酮酸丙酮酸CO2乙酰輔酶乙酰輔酶A+乙酰輔酶乙酰輔酶A+乙酰輔酶乙酰輔酶A檸檬酸（檸檬酸（DCA循環(huán)封閉）循環(huán)封閉）谷氨酸谷氨酸不存在CO2固定反應(yīng)草酰乙酸草酰乙酸n2.在前述GA 合成所必需的條件的基礎(chǔ)上（，封閉乙醛酸循環(huán)）存在CO2固定反應(yīng)，則有： nC6H12O6 + NH4+ C5H9NO4 + CO2 n產(chǎn)率：147 /

27、 180 = 81.7%GlucoseEMP丙酮酸丙酮酸+丙酮酸丙酮酸CO2CO2草酰乙酸草酰乙酸（草酰乙酸羧化酶）（草酰乙酸羧化酶）乙酰輔酶乙酰輔酶A+C4二羧酸二羧酸蘋(píng)果酸蘋(píng)果酸（蘋(píng)果酸合成酶）（蘋(píng)果酸合成酶）檸檬酸（檸檬酸（DCA循環(huán)封閉）循環(huán)封閉）谷氨酸谷氨酸存在CO2固定反應(yīng)可見(jiàn)，在GA的生物合成過(guò)程中，CO2固定反應(yīng)對(duì)于產(chǎn)率的提高有著多么重要的作用。CO2固定反應(yīng) n(1)磷酸丙酮酸羧化酶的作用下 磷酸丙酮酸 + CO2 + GTP = 草酰乙酸 + GDPn(2)蘋(píng)果酸酶的作用下 丙酮酸 + CO2 +NADH = 蘋(píng)果酸 + NADn 需要Mn+做催化劑，所以，在GA發(fā)酵過(guò)程中

28、需要向培養(yǎng)基中補(bǔ)充Mn+n實(shí)際上，發(fā)酵過(guò)程中不可能控制檸檬酸合成所需的C4二羧酸完全來(lái)自于CO2固定反應(yīng)，體系也不可能完全不存在CO2固定反應(yīng)，因此，GA 發(fā)酵的糖酸轉(zhuǎn)化率應(yīng)在：54.4%-81.7%。n目前，國(guó)內(nèi)的GA生產(chǎn)企業(yè)的糖酸轉(zhuǎn)化率通常都在50%以?xún)?nèi).（1）企業(yè)計(jì)算的糖酸轉(zhuǎn)化率是把GA 發(fā)酵前期菌體增殖時(shí)期消耗的葡萄糖計(jì)算在內(nèi)，而我們所計(jì)算的不包括這一部分葡萄糖，通常這一部分糖占總量的20%左右，當(dāng)然與企業(yè)的技術(shù)水平有關(guān)。（2）TCA 循環(huán)也不可能完全封閉；-KGA也不可能完全轉(zhuǎn)化為GA；生成的GA也不可能完全分泌的細(xì)胞外；發(fā)酵液中還存在一定的殘?zhí)?，通常?.5%-0.7%之間。 提高

29、GA的潛力n（1）強(qiáng)化強(qiáng)化COCO2 2固定反應(yīng)固定反應(yīng)，具體措施：Mn+ ，生物素. .n（2）控制溶氧濃度控制溶氧濃度是非常重要的n低的溶氧濃度，則丙酮酸向乳酸方向轉(zhuǎn)化n高的溶氧濃度，則NADPH 有被氧化的可能，（四）、生物素對(duì)GA發(fā)酵的影響n(yōu)GA 產(chǎn)生菌大都是生物素的營(yíng)養(yǎng)缺陷型，即：VH-n生物素生物素對(duì)發(fā)酵的影響是全面的，在發(fā)酵對(duì)發(fā)酵的影響是全面的，在發(fā)酵過(guò)程中要嚴(yán)格控制其濃度。過(guò)程中要嚴(yán)格控制其濃度。 1. 生物素對(duì)糖代謝的影響1.VH對(duì)于糖酵解有促進(jìn)作用; 2.對(duì)丙酮酸的有氧氧化乙酰輔酶乙酰輔酶A A的生成也有促進(jìn)作用，n但兩者的促進(jìn)作用不一樣，對(duì)前者大一些n這樣培養(yǎng)基中如果有較

30、豐富的VH，就會(huì)打破糖酵解與丙酮酸氧化之間的平衡，導(dǎo)致丙酮酸的積累，丙酮酸積累則可能導(dǎo)致乳酸的形成，乳酸生成，則使得碳源利用率降低，而且?guī)?lái)的是發(fā)酵液的pH值下降。1. 生物素對(duì)糖代謝的影響n(yōu)另一方面，可以通過(guò)控制VH的濃度，以實(shí)現(xiàn)對(duì)于乙醛酸循環(huán)的封閉。封閉乙醛酸循環(huán)對(duì)于GA發(fā)酵的重要性如何封閉乙醛酸循環(huán)呢？nDCADCA循環(huán)（循環(huán)（乙醛酸循環(huán)）的關(guān)鍵酶是）的關(guān)鍵酶是異檸檬酸異檸檬酸裂解酶裂解酶，研究表明，該酶受以下幾個(gè)因素的，研究表明，該酶受以下幾個(gè)因素的影響：影響：n 為為醋酸誘導(dǎo)醋酸誘導(dǎo)n 受受琥珀酸阻遏琥珀酸阻遏，其活性受琥珀酸的抑制，其活性受琥珀酸的抑制. .（受到（受到Glucos

31、eGlucose的阻遏）的阻遏）如何封閉乙醛酸循環(huán)呢？n當(dāng)當(dāng)V VH H缺乏時(shí)：缺乏時(shí)：n（1 1）丙酮酸丙酮酸的有氧的有氧氧化氧化就會(huì)就會(huì)減弱減弱( (由于由于V VH H對(duì)對(duì)TCATCA循環(huán)的促進(jìn)作用循環(huán)的促進(jìn)作用) )，則：，則：乙酰輔酶乙酰輔酶A A的生成量就的生成量就會(huì)會(huì)少少，醋酸濃度降低醋酸濃度降低，它的誘導(dǎo)作用降低；，它的誘導(dǎo)作用降低；n（2 2）V VH H對(duì)對(duì)TCATCA循環(huán)的促進(jìn)作用的降低，使得其循環(huán)的促進(jìn)作用的降低，使得其中間產(chǎn)物中間產(chǎn)物琥珀酸琥珀酸的氧化速度降低，其濃度得到的氧化速度降低，其濃度得到積累積累，這樣它的阻遏和抑制作用加強(qiáng)；，這樣它的阻遏和抑制作用加強(qiáng)；n兩

32、者綜合的作用使得，異檸檬酸裂解酶的活性?xún)烧呔C合的作用使得，異檸檬酸裂解酶的活性喪失，喪失，DCADCA循環(huán)得到封閉。循環(huán)得到封閉。2. 生物素對(duì)氮代謝的影響n(yōu)由以上分析可知，當(dāng)當(dāng)V VH H缺乏時(shí)，異檸檬酸裂解酶的活性缺乏時(shí)，異檸檬酸裂解酶的活性減弱減弱。n當(dāng)當(dāng)V VH H豐富時(shí)，異檸檬酸裂解酶的活性必然加強(qiáng)豐富時(shí)，異檸檬酸裂解酶的活性必然加強(qiáng)，則DCA 循環(huán)（乙醛酸循環(huán)）正常進(jìn)行，DCA循環(huán)的進(jìn)行，一方面提供了大量的“中間性產(chǎn)物”，另一方面，菌體的能量水平得到提高。前者是菌體增殖的物質(zhì)基礎(chǔ)，后者則是菌體增殖的能量的保證。這樣的結(jié)果是，有利于菌體的增殖和生長(zhǎng)，則GA的生物合成就會(huì)受到影響，甚至

33、停止，這在生產(chǎn)上，就是通常我們說(shuō)的“只長(zhǎng)菌，只長(zhǎng)菌，不產(chǎn)酸不產(chǎn)酸”的現(xiàn)象。 以上分析說(shuō)明，以上分析說(shuō)明，GAGA發(fā)酵過(guò)程中，前期，菌發(fā)酵過(guò)程中，前期，菌體的增殖期，體的增殖期，一定量一定量的生物素是菌體增殖的生物素是菌體增殖所必需的所必需的；而；而在產(chǎn)物合成期，則要限制生在產(chǎn)物合成期，則要限制生物素的濃度，以保證產(chǎn)物的正常合成物素的濃度，以保證產(chǎn)物的正常合成。3. VH對(duì)菌體細(xì)胞膜通透性的影響3. VH對(duì)菌體細(xì)胞膜通透性的影響n(yōu)菌體進(jìn)入產(chǎn)物合成期時(shí)，有GA的產(chǎn)生，如果能夠大量的把產(chǎn)物及時(shí)的排泄到細(xì)胞膜外，可以解除解除GAGA對(duì)對(duì)L-L-谷氨酸脫氫酶活性的谷氨酸脫氫酶活性的抑制作用抑制作用，從而

34、使由GlucoseGA的高效率轉(zhuǎn)化，反之，如果?？梢?jiàn)，改善細(xì)胞膜通透性的重要性n如何進(jìn)行呢？n谷氨酸發(fā)酵采用的菌種都是VH-，而VH又是菌體細(xì)胞膜合成的必須物質(zhì)，因此，可以通過(guò)控制VH的濃度，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)菌體細(xì)胞膜通透性的調(diào)節(jié)。nVH對(duì)細(xì)胞膜合成的影響主要是通過(guò)對(duì)細(xì)胞膜的主要成分磷脂中的脂肪酸的生物合成來(lái)實(shí)現(xiàn)的，當(dāng)限制了菌體脂肪酸的合成時(shí)，細(xì)胞就會(huì)形成一個(gè)細(xì)胞膜不完整的菌體。生物體內(nèi)脂肪酸的合成途徑如下：n其中，將乙酰輔酶A羧化生成丙二酰輔酶A的酶是乙酰輔酶A羧化酶，該酶的輔酶是VH，VH在此反應(yīng)過(guò)程中起到傳遞CO2的作用。當(dāng)培養(yǎng)基中VH的濃度較低時(shí)，細(xì)胞膜的合成就會(huì)受影響。葡萄糖葡萄糖丙酮酸丙酮

35、酸+丙酮酸丙酮酸乙酰輔酶乙酰輔酶A乙酰輔酶乙酰輔酶乙酰輔酶乙酰輔酶A羧化酶羧化酶CO2丙二酰輔酶丙二酰輔酶AC4丙二酰輔酶丙二酰輔酶ACO2C6CO2培養(yǎng)基中生物素限量時(shí)，胞內(nèi)AA 92% 胞外培養(yǎng)基中生物素豐富時(shí)，胞內(nèi)AA 12% 胞外 （五）（五）GA發(fā)酵的發(fā)酵的外在因素外在因素nGA發(fā)酵是一個(gè)典型的代謝控制發(fā)酵，固然有其內(nèi)在的菌體特性。n但是正如任何事物發(fā)展的基本規(guī)律一樣，外在因素仍然有重要的作用，對(duì)于GA的發(fā)酵也是一樣。1.供氧濃度n過(guò)量：NADPH的再氧化能力會(huì)加強(qiáng)，使-KGA的還原氨基化受到影響，不利于GA 的生成。n供氧不足：積累大量的乳酸，使發(fā)酵液的pH值下降，不利于GA的產(chǎn)生

36、，同時(shí)，一部分葡萄糖轉(zhuǎn)成了乳酸，影響了糖酸轉(zhuǎn)化率，降低了產(chǎn)物的提出率。2. NH4+濃度n（1）影響到發(fā)酵液的pH值n（2）與產(chǎn)物的形成有關(guān)：nNH4+過(guò)量，菌體增殖階段會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)，產(chǎn)酸階段Glu會(huì)受谷氨酰胺合成酶作用轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺（谷氨酰胺（ GlnGln）nNH4+不足，不利于-KGA的還原氨基化， -酮戊二酸積累，引起反饋調(diào)節(jié)NH4+與產(chǎn)物的形成NH4+的供給方式： （1）液氨 （2）流加0.8%尿素3.磷酸鹽n過(guò)量：n（1）促進(jìn)EMP途徑，打破EMP與TCA之間的平衡，積累丙酮酸，產(chǎn)生乳酸等 n（2）產(chǎn)生并積累纈氨酸（ Val）Glucose丙酮酸丙酮酸+丙酮酸丙酮酸（焦磷酸硫胺素

37、，（焦磷酸硫胺素，TPP）活性乙醛活性乙醛-乙酰乳酸乙酰乳酸ValVal合成途徑合成途徑Val（1）可以抑制葡萄糖 丙酮酸，使GA的生物合成受到阻止 （2）消耗丙酮酸，降低了糖酸轉(zhuǎn)化率 （3）發(fā)酵液中的Val存在，嚴(yán)重的影響GA 的結(jié)晶、提取。發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵過(guò)程中,要嚴(yán)格控制要嚴(yán)格控制NH4+和和P的含量的含量環(huán)境條件環(huán)境條件 4. 發(fā)酵液的碳氮比發(fā)酵液的碳氮比n發(fā)酵液中糖含量與谷氨酸的發(fā)酵有密切的關(guān)系。在一定范圍內(nèi), 谷氨酸的產(chǎn)量隨糖含量的增加而增加, 但糖含量過(guò)高, 滲透壓過(guò)大, 對(duì)菌體生長(zhǎng)不利, 谷氨酸對(duì)糖的轉(zhuǎn)化率低。n發(fā)酵液中還原糖的含量一般應(yīng)控制在10 %13 % 。環(huán)境條件環(huán)境條件

38、 n氮源是合成菌體細(xì)胞蛋白質(zhì)、核酸和谷氨酸的氨基來(lái)源，大約85%的氮源被用于合成谷氨酸，另外15%用于合成菌體。n谷氨酸發(fā)酵需要的氮源比一般發(fā)酵工業(yè)多得多，一般發(fā)酵工業(yè)碳氮比為100：0.2-2.0，谷氨酸發(fā)酵的碳氮比為100：15-21。n在谷氨酸發(fā)酵過(guò)程中,應(yīng)正確控制碳氮比。一般在菌體生長(zhǎng)期碳氮比應(yīng)大一些(氮低）,在產(chǎn)酸期,碳氮比應(yīng)小些(氮高） 。在碳源和氮源的比為31時(shí)，谷氨酸棒狀桿菌會(huì)大量合成谷氨酸，但當(dāng)碳源和氮源的比為41時(shí)，谷氨酸棒狀桿菌只生長(zhǎng)而不合成谷氨酸。環(huán)境條件環(huán)境條件 5. 生物素生物素n谷氨酸產(chǎn)生菌是營(yíng)養(yǎng)缺陷型, 對(duì)生長(zhǎng)繁殖、代謝產(chǎn)物的影響非常明顯。n當(dāng)生物素過(guò)量時(shí)酵解途

39、徑中的丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗? 同時(shí)也使異檸檬酸轉(zhuǎn)變?yōu)殓晁?菌體生長(zhǎng)繁殖快,同時(shí)生物素又促進(jìn)菌體細(xì)胞膜通透性障礙物的生物合成, 使菌體不能及時(shí)將細(xì)胞內(nèi)的谷氨酸排出,谷氨酸合成途徑受阻,發(fā)酵液中由菌種細(xì)胞排出的谷氨酸僅能占氨基酸總量的12%;n生物素亞適量時(shí),菌體代謝失調(diào),細(xì)胞膜通透性增強(qiáng),細(xì)胞內(nèi)的谷氨酸能及時(shí)排出,有利于谷氨酸的積累, 發(fā)酵液內(nèi)由菌體細(xì)胞排除谷氨酸能達(dá)總氨基酸的92%左右。因此,要根據(jù)發(fā)酵時(shí)期來(lái)控制生物素的含量。環(huán)境條件環(huán)境條件 6. 發(fā)酵溫度發(fā)酵溫度n谷氨酸發(fā)酵前期應(yīng)采取菌體生長(zhǎng)最適溫度,即3032 。溫度過(guò)低, 菌體生長(zhǎng)繁殖慢;若溫度過(guò)高,菌體易衰老, 生產(chǎn)中表現(xiàn)為DO 值增長(zhǎng)

40、慢, 耗糖慢, pH值高, 最終發(fā)酵周期長(zhǎng),產(chǎn)酸少。n發(fā)酵中、后期菌體生長(zhǎng)基本停止, 為積累大量谷氨酸, 應(yīng)適當(dāng)提高發(fā)酵溫度,但溫度過(guò)高,酶易失活,谷氨酸生成受阻。環(huán)境條件環(huán)境條件 7. pH值值n1） pH值對(duì)谷氨酸產(chǎn)生菌生長(zhǎng)的影響n(yōu)谷氨酸產(chǎn)生菌象其它微生物一樣, 有最適生長(zhǎng)pH值范圍, 當(dāng)高于或低于這個(gè)值時(shí):(1) 菌體內(nèi)的酶受到抑制, 菌體新陳代謝受阻, 生長(zhǎng)停滯; (2) 菌體細(xì)胞膜所帶電荷發(fā)生改變, 從而改變細(xì)胞膜的滲透性, 影響菌體對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收和代謝產(chǎn)物的排出; (3) 影響培養(yǎng)基組分和中間代謝產(chǎn)物的離解, 從而影響菌體對(duì)這些物質(zhì)的利用。環(huán)境條件環(huán)境條件 n2） pH值對(duì)谷氨酸積累

41、的影響n(yōu)谷氨酸脫氫酶是合成谷氨酸的主要酶,它的最適pH為7.07.2 ,當(dāng)發(fā)酵液的pH值偏酸時(shí)(pH 5.0-5.8) ,谷氨酸脫氫酶受到抑制,代謝向著生成谷氨酰胺和乙酰谷氨酰胺的方向進(jìn)行。n在發(fā)酵后期由于耗用大量NH4+ ,pH值下降, 此時(shí)就要進(jìn)行pH值調(diào)節(jié),以保證發(fā)酵的正常進(jìn)行。環(huán)境條件環(huán)境條件 npH發(fā)生變化的主要原因是培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分的利用和代謝產(chǎn)物的積累。n如當(dāng)谷氨酸棒狀桿菌利用糖類(lèi)物質(zhì)不斷生成谷氨酸時(shí)，培養(yǎng)液的pH就會(huì)下降。而堿性物質(zhì)的消耗和氨的生成等則會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)液的pH上升。pH：前期pH（7.5-8.0），中后期pH7.0-7.6。通過(guò)采用流加尿素，氨水或液氨等辦法調(diào)節(jié)pH，

42、補(bǔ)充氮源。 環(huán)境條件環(huán)境條件 8. 通風(fēng)通風(fēng) （同1.供氧濃度）n通風(fēng)的實(shí)質(zhì)就是供氧并使菌體和培養(yǎng)基充分混合。谷氨酸產(chǎn)生菌為兼性好氧菌, 在有氧、無(wú)氧的條件下都能生長(zhǎng),只是其代謝產(chǎn)物不同。在谷氨酸發(fā)酵過(guò)程中,通風(fēng)必須適度。n風(fēng)量過(guò)大,氧氣充足,在長(zhǎng)菌階段表現(xiàn)為耗糖慢, 菌體生長(zhǎng)慢, pH值偏高, 產(chǎn)酸階段, 供氫體被氧化,谷氨酸合成受阻,積累 - 酮戊二酸; n風(fēng)量小, 供氧不足, 長(zhǎng)菌階段表現(xiàn)為菌體生長(zhǎng)快,在產(chǎn)酸階段,葡萄糖進(jìn)入菌體后, 進(jìn)行不完全氧化,產(chǎn)物由谷氨酸變?yōu)槿樗?。環(huán)境條件環(huán)境條件 9. 泡沫泡沫 谷氨酸發(fā)酵是好氣性發(fā)酵, 因通風(fēng)和攪拌產(chǎn)生泡沫是正常的, 但泡沫過(guò)多會(huì)帶來(lái)一系列問(wèn)題

43、: (1) 泡沫形成泡蓋時(shí), 代謝產(chǎn)生的氣體不能及時(shí)排出,妨礙菌體呼吸作用,影響菌體的正常代謝; (2) 泡沫過(guò)多, 發(fā)酵液會(huì)外溢,造成浪費(fèi)和污染; (3) 泡沫過(guò)多,易沖上罐頂,造成染菌。因此,在谷氨酸的發(fā)酵過(guò)程中控制好過(guò)多的泡沫是發(fā)酵成敗的關(guān)鍵。 谷氨酸產(chǎn)生菌的發(fā)酵條件與產(chǎn)物的關(guān)系控制因子發(fā)酵產(chǎn)品轉(zhuǎn)換氧氣乳酸或琥珀酸（通氣不足）谷氨酸（通氣充足）NH4+-酮戊二酸（缺乏）谷氨酸（適量）谷氨酰胺（過(guò)量）pHN-乙酰谷氨酰胺（酸性）谷氨酸（中性或微堿性）磷酸纈氨酸（高濃度）谷氨酸生物素乳酸或琥珀酸（豐富）谷氨酸（缺乏）n谷氨酸發(fā)酵過(guò)程中,生產(chǎn)菌種的特性、生長(zhǎng)素、發(fā)酵溫度、pH值、通風(fēng)和發(fā)酵產(chǎn)生

44、的泡沫都是影響谷氨酸積累的主要因素。在實(shí)際生產(chǎn)中,只有針對(duì)存在的問(wèn)題,嚴(yán)格控制工藝條件嚴(yán)格控制工藝條件,才能達(dá)到穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)的目的。 n假設(shè)人們想利用葡萄糖、谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)-酮戊二酸，請(qǐng)你利用現(xiàn)有知識(shí)，如何設(shè)計(jì)一個(gè)大量積累-酮戊二酸的方案? ? n菌種：對(duì)谷氨酸捧狀桿菌進(jìn)行誘變處理，選育不能合成谷氨酸脫氫酶的菌種n條件：氧（通風(fēng)）、NH4+、C/N；pH、磷酸鹽、溫度、生物素、 Mn+代謝的人工控制及其在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用代謝的人工控制及其在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用工業(yè)發(fā)酵的目的工業(yè)發(fā)酵的目的：大量積累人們所需要的微生物代大量積累人們所需要的微生物代謝產(chǎn)物。謝產(chǎn)物。代謝的人工控制代謝的人工控制：人為地

45、打破微生物的代謝控制體人為地打破微生物的代謝控制體系，使代謝朝著人們希望的方向進(jìn)行。系，使代謝朝著人們希望的方向進(jìn)行。人工控制代謝的手段人工控制代謝的手段： (1)(1)改變微生物遺傳特性改變微生物遺傳特性( (遺傳學(xué)方法）；遺傳學(xué)方法）； (2)(2)控制發(fā)酵條件（生物化學(xué)方法）；控制發(fā)酵條件（生物化學(xué)方法）； (3)(3)改變細(xì)胞膜透性；改變細(xì)胞膜透性；總結(jié)總結(jié) 1 營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的應(yīng)用營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的應(yīng)用 末端產(chǎn)物末端產(chǎn)物E對(duì)生長(zhǎng)乃是必需的，所以，應(yīng)在對(duì)生長(zhǎng)乃是必需的，所以，應(yīng)在培養(yǎng)基中限量供給培養(yǎng)基中限量供給E，使之足以維持菌株生長(zhǎng)，使之足以維持菌株生長(zhǎng)，但又不至于造成反饋調(diào)節(jié)（阻遏或

46、抑制），這但又不至于造成反饋調(diào)節(jié)（阻遏或抑制），這樣才能有利于菌株積累中間產(chǎn)物樣才能有利于菌株積累中間產(chǎn)物C 。（1）對(duì)于直線(xiàn)式代謝途徑：選育營(yíng)養(yǎng)缺陷性突）對(duì)于直線(xiàn)式代謝途徑：選育營(yíng)養(yǎng)缺陷性突變株只能積累中間代謝產(chǎn)物變株只能積累中間代謝產(chǎn)物 A a B b C c D d E (一一)遺傳學(xué)方法遺傳學(xué)方法(2) 分支代謝途徑：情況較復(fù)雜，可利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型克服協(xié)同、或累加抗反饋抑制，積累末端產(chǎn)物，亦可利用雙重缺陷發(fā)酵生產(chǎn)中間產(chǎn)物A B CDEFG分支途徑分支途徑賴(lài)氨酸發(fā)酵賴(lài)氨酸發(fā)酵: :谷氨酸棒桿菌的谷氨酸棒桿菌的HomHomHom：谷氨酸棒桿菌高絲氨酸脫氫酶編碼基因。：谷氨酸棒桿菌高絲氨酸脫氫

47、酶編碼基因。 （缺陷型或進(jìn)行基因（缺陷型或進(jìn)行基因敲除敲除 ） 2 抗反饋控制突變株的應(yīng)用抗反饋控制突變株的應(yīng)用抗反饋控制突變株抗反饋控制突變株是指對(duì)反饋抑制不敏是指對(duì)反饋抑制不敏感或?qū)ψ瓒粲锌剐?，或兩者兼有之的菌株。感或?qū)ψ瓒粲锌剐裕騼烧呒嬗兄木??？狗答伩刂仆蛔冎昕梢詮目狗答伩刂仆蛔冎昕梢詮慕K產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類(lèi)似物終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類(lèi)似物抗性突變株抗性突變株和和營(yíng)養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變株?duì)I養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變株中獲得。中獲得。目標(biāo)產(chǎn)物目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類(lèi)似物結(jié)構(gòu)類(lèi)似物賴(lài)氨酸賴(lài)氨酸S-S-（2 2氨基乙基）氨基乙基）-L-L半胱氨酸半胱氨酸-(AEC)-(AEC)蘇氨酸蘇氨酸 - -氨基氨基- - - -羥基戊酸（羥基

48、戊酸（AHV)AHV)異亮氨酸異亮氨酸乙硫氨酸乙硫氨酸精氨酸精氨酸D-D-精氨酸精氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸對(duì)氟苯丙氨酸對(duì)氟苯丙氨酸 3 選育組成型突變株和超產(chǎn)突變株選育組成型突變株和超產(chǎn)突變株 如果調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，以至產(chǎn)生無(wú)效的如果調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，以至產(chǎn)生無(wú)效的阻遏物而不能和操縱基因結(jié)合，或操縱基因突阻遏物而不能和操縱基因結(jié)合，或操縱基因突變，從而造成結(jié)構(gòu)基因不受控制的轉(zhuǎn)錄，酶的變，從而造成結(jié)構(gòu)基因不受控制的轉(zhuǎn)錄，酶的生成將不再需要誘導(dǎo)劑或不再被末端產(chǎn)物或分生成將不再需要誘導(dǎo)劑或不再被末端產(chǎn)物或分解代謝物阻遏，該突變株稱(chēng)為解代謝物阻遏，該突變株稱(chēng)為組成型突變株組成型突變株。 少數(shù)情況下，組成型

49、突變株可產(chǎn)生大量的、少數(shù)情況下，組成型突變株可產(chǎn)生大量的、比親本高得多的酶，這種突變株稱(chēng)為比親本高得多的酶，這種突變株稱(chēng)為超產(chǎn)突變超產(chǎn)突變株株。（二）生物化學(xué)方法（二）生物化學(xué)方法1. 1. 添加前體添加前體* *繞過(guò)反饋控制點(diǎn)：繞過(guò)反饋控制點(diǎn)：能使某種代謝產(chǎn)物大能使某種代謝產(chǎn)物大量產(chǎn)生量產(chǎn)生 DA B C E F(-)(-)(-)2. 2. 添加誘導(dǎo)劑：添加誘導(dǎo)劑：從提高誘導(dǎo)酶合成量來(lái)說(shuō)，最好的誘從提高誘導(dǎo)酶合成量來(lái)說(shuō)，最好的誘導(dǎo)劑往往不是該酶的底物，而是導(dǎo)劑往往不是該酶的底物，而是底物的衍生物底物的衍生物。3. 3. 發(fā)酵與分離過(guò)程耦合發(fā)酵與分離過(guò)程耦合。4. 4. 控制發(fā)酵的培養(yǎng)基成分控

50、制發(fā)酵的培養(yǎng)基成分。 *在微生物的生物合成過(guò)程中，有些化合物能直接被微生物利用構(gòu)成產(chǎn)物分在微生物的生物合成過(guò)程中，有些化合物能直接被微生物利用構(gòu)成產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)的一部分，而化合物本身的結(jié)構(gòu)沒(méi)有大的變化，這些物質(zhì)稱(chēng)為子結(jié)構(gòu)的一部分，而化合物本身的結(jié)構(gòu)沒(méi)有大的變化，這些物質(zhì)稱(chēng)為前體前體。 （三）控制細(xì)胞膜滲透性（三）控制細(xì)胞膜滲透性 使胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物迅速滲漏出去,解除末端產(chǎn)物的反饋抑制。 1. 用生理學(xué)手段 直接抑制膜的合成或使膜受缺損 如: 在Glu發(fā)酵中把生物素濃度控制在亞適量可大量分泌Glu； 控制生物素的含量可改變細(xì)胞膜的成分，進(jìn)而改變膜透性； 當(dāng)培養(yǎng)液中生物素含量較高時(shí)采用適量添加青霉素的

51、方法；（三）控制細(xì)胞膜滲透性（三）控制細(xì)胞膜滲透性2. 利用膜缺損突變株 油酸缺陷型、甘油缺陷型 如:用谷氨酸生產(chǎn)菌的油酸缺陷型，培養(yǎng)過(guò)程中，有限制地添加油酸，合成有缺損的膜，使細(xì)胞膜發(fā)生滲漏而提高谷氨酸產(chǎn)量。 甘油缺陷型菌株的細(xì)胞膜中磷脂含量比野生型菌株低，易造成谷氨酸大量滲漏。應(yīng)用甘油缺陷型菌株，就是在生物素或油酸過(guò)量的情況下，適量添加青霉素也可以獲得大量谷氨酸。發(fā)酵過(guò)程參數(shù)測(cè)定還原糖的測(cè)定谷氨酸的測(cè)定菌體形態(tài)觀(guān)察菌體濃度測(cè)定發(fā)酵過(guò)程參數(shù)的控制DO值pH溫度攪拌速度發(fā) 酵發(fā) 酵 液冷卻接種三角瓶培養(yǎng)固體斜面培養(yǎng)上罐實(shí)消培養(yǎng)基的配制谷氨酸發(fā)酵的工藝流程簡(jiǎn)圖谷氨酸發(fā)酵的工藝流程簡(jiǎn)圖谷氨酸發(fā)酵液

52、谷氨酸發(fā)酵液常溫等電法等電結(jié)晶沉降分離脫色中和結(jié)晶冷凍等電法上清液（母液）離子交換谷氨酸晶體谷氨酸晶體冷凍結(jié)晶濃縮結(jié)晶谷氨酸鈉晶體（味精）谷氨酸鈉晶體（味精）谷氨酸的分離與味精的制備谷氨酸的分離與味精的制備 四、谷氨酸發(fā)酵 1）谷氨酸生產(chǎn)菌n谷氨酸棒桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌、黃色短桿菌。n我國(guó)使用的生產(chǎn)菌株是北京棒桿菌AS1.299、北京棒桿菌D110、鈍齒棒桿菌AS1.542、棒桿菌S-914和黃色短桿菌T6-13等。 谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)菌株特點(diǎn) 在己報(bào)道的谷氨酸生產(chǎn)菌中，除芽孢桿菌外，雖然它們?cè)诜诸?lèi)學(xué)上屬于不同的屬種，但都有一些共同特點(diǎn)共同特點(diǎn): :1.革蘭氏陽(yáng)性2.菌體為球形、短桿至棒狀3.不

53、形成芽孢4.沒(méi)有鞭毛，不能運(yùn)動(dòng)5.需要生物素作為生長(zhǎng)因子6.在通氣條件下才能產(chǎn)生谷氨酸。2 2）生產(chǎn)原料生產(chǎn)原料發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸的原料有發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸的原料有n淀粉質(zhì)原料：玉米、小麥、甘薯、大米等。其中甘薯淀粉質(zhì)原料：玉米、小麥、甘薯、大米等。其中甘薯和淀粉最為常用；和淀粉最為常用；n大米進(jìn)行浸泡磨漿，再調(diào)成大米進(jìn)行浸泡磨漿，再調(diào)成15Bx，調(diào)，調(diào)pH6.0，加細(xì)菌，加細(xì)菌a-淀粉酶進(jìn)行液淀粉酶進(jìn)行液化，化，85 30min，加糖化酶，加糖化酶60 糖化糖化24h，過(guò)濾后可供配制培養(yǎng)基。，過(guò)濾后可供配制培養(yǎng)基。n糖蜜原料：甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜；糖蜜原料：甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜；n糖蜜原料：不宜直接用來(lái)

54、作為谷氨酸發(fā)酵的碳源，因含豐富的生物素。糖蜜原料：不宜直接用來(lái)作為谷氨酸發(fā)酵的碳源，因含豐富的生物素。n預(yù)處理方法：活性碳或樹(shù)脂吸附法和亞硝酸法吸附或破壞生物素。也預(yù)處理方法：活性碳或樹(shù)脂吸附法和亞硝酸法吸附或破壞生物素。也可以在發(fā)酵液中加入表面活性劑吐溫可以在發(fā)酵液中加入表面活性劑吐溫60或添加中青霉素。或添加中青霉素。 n氮源料：尿素或氨水。氮源料：尿素或氨水。3）工藝流程 味精生產(chǎn)全過(guò)程可分五個(gè)部分：1.原料的預(yù)處理及淀粉水解糖的制?。?.谷氨酸生產(chǎn)菌種子的擴(kuò)大培養(yǎng)；3.谷氨酸發(fā)酵；4.谷氨酸的提取與分離；5.由谷氨酸制成味精及味精成品加工 。 淀粉質(zhì)原料糖化中和、脫色、過(guò)濾培養(yǎng)基調(diào)配接

55、種發(fā)酵提取(等電點(diǎn)法、離子交換法等) 谷氨酸谷氨酸-Na脫色 過(guò)濾干燥成品菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)n味精生產(chǎn)的主要原材料為淀粉n輔助材料包括硫酸、液氨、碳酸鈉、活性碳、液堿、鹽、消泡劑、淀粉酶等n年產(chǎn)12萬(wàn)噸味精，主要原輔材料耗用如下表：項(xiàng)目單位：噸淀粉196,870液氨 31,108硫酸 35,000碳酸鈉 30,000活性碳 2,500液堿 40,000鹽 8,000消泡劑 77,960淀粉酶 11,6944）發(fā)酵生產(chǎn)工藝 培養(yǎng)基成分n碳源：碳源是構(gòu)成菌體和合成谷氨酸的碳架及能量的來(lái)源。n谷氨酸產(chǎn)生菌是異養(yǎng)微生物，只能從有機(jī)物中獲得碳素，細(xì)胞進(jìn)行合成反應(yīng)所需要能量也是從氧化分解有機(jī)物過(guò)程中得到的。n

56、實(shí)際生產(chǎn)中以糖質(zhì)原料為主。培養(yǎng)基中糖濃度對(duì)谷氨酸發(fā)酵有密切的關(guān)系。在一定的范圍內(nèi)，谷氨酸產(chǎn)量隨糖濃度的增加而增加。 n氮源：氮源是合成菌體蛋白質(zhì)、核酸及谷氨酸的原料。碳氮比對(duì)谷氨酸發(fā)酵有很大影響。大約85%的氮源被用于合成谷氨酸，另外15%用于合成菌體。n谷氨酸發(fā)酵需要的氮源比一般發(fā)酵工業(yè)多得多，一般發(fā)酵工業(yè)碳氮比為100：0.2-2.0，谷氨酸發(fā)酵的碳氮比為100：15-21。 n無(wú)機(jī)鹽：是微生物維持生命活動(dòng)不可缺少的物質(zhì)。n主要功能：構(gòu)成細(xì)胞的組成成分；作為酶的組成成分；激活或抑制酶的活力；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的氧化還原電位。起著調(diào)節(jié)微生物生命活動(dòng)的作用。發(fā)酵時(shí)

57、，使用的無(wú)機(jī)離子有K+、Mg2+、Fe2+、Mn2+等陽(yáng)離子和PO43-、SO42-、Cl等陰離子，其用量如下： n KH2PO4 0.05%0.2% K2HPO4 0.05%0.2% MgSO4.7H2O 0.005%0.1% FeSO4.7H2O 0.0005%0.01% MnSO4.4H2O 0.0005%0.005%n生物素：凡是微生物生命活動(dòng)不可缺少，而微生物自身又不能合成的微量有機(jī)物質(zhì)都稱(chēng)為生長(zhǎng)因子。生長(zhǎng)因子通常是指氨基酸、嘌呤、嘧啶和B族維生素的一種，生物素又叫維生素H或輔酶R。n糖質(zhì)為碳源的谷氨酸產(chǎn)生菌幾乎都是生物素缺陷型，這些細(xì)菌本身都不能合成生物素。生物素的作用是影響代謝途

58、徑；影響細(xì)胞的滲透性。n生長(zhǎng)因子含量的多少，與生產(chǎn)有著十分密切的關(guān)系。實(shí)際生產(chǎn)中通過(guò)添加玉米漿、麩皮水解液、糖蜜等作為生長(zhǎng)因子的來(lái)源，來(lái)滿(mǎn)足谷氨酸產(chǎn)生菌必須的生長(zhǎng)因子。 培養(yǎng)基 a斜面培養(yǎng)基n葡萄糖0.1%、牛肉膏1.0%、蛋白胨1.0%、氯化鈉0.5%、瓊脂2.0%、pH7.07.2n121滅菌30minn32培養(yǎng)18-24h(傳代和保藏斜面不加葡萄糖)。 b 一級(jí)種子、二級(jí)種子及發(fā)酵培養(yǎng)基n一級(jí)種子葡萄糖2.5%、尿素0.6%、KH2PO40.1%、MgSO4.7H2O0.04%、玉米漿2.3-3.0ml、pH7.0, 1000ml裝200-250ml振蕩，32 培養(yǎng)12h。n二級(jí)種子水解

59、糖3.0%、尿素0.6%、玉米漿0.5-0.6ml、K2HPO40.1-0.2%、MgSO4.7H2O0.04%、pH7.0,呈單個(gè)或八字排列?；罹鷶?shù)為108-109 /ml。n發(fā)酵培養(yǎng)基水解糖12-14%、尿素0.5-0.8%、玉米漿0.6ml、MgSO4.7H2O0.06%、KCl0.05%、Na2HPO40.17%、pH7.0 發(fā)酵條件的控制 a溫度n谷氨酸發(fā)酵谷氨酸發(fā)酵前期前期(0-12h)(0-12h)是菌體大量繁殖階段，在此階段菌是菌體大量繁殖階段，在此階段菌體利用培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)合成核酸、蛋白質(zhì)等，供菌體體利用培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)合成核酸、蛋白質(zhì)等，供菌體繁殖用，而控制這些合

60、成反應(yīng)的最適溫度均在繁殖用，而控制這些合成反應(yīng)的最適溫度均在30323032。n對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：糖耗快，尿素大量分解使對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：糖耗快，尿素大量分解使pHpH上升，氨被利用上升，氨被利用pHpH又迅速下降。溶氧急劇下降后維持在一定水平。菌體濃度迅又迅速下降。溶氧急劇下降后維持在一定水平。菌體濃度迅速增大，菌體形態(tài)為排列整齊的八字形。不產(chǎn)酸。速增大，菌體形態(tài)為排列整齊的八字形。不產(chǎn)酸。12h12h。n措施：及時(shí)供給菌體生長(zhǎng)必須的氮源及調(diào)節(jié)措施：及時(shí)供給菌體生長(zhǎng)必須的氮源及調(diào)節(jié)pHpH，在，在pH7.5-pH7.5-8.08.0時(shí)流加尿素；維持溫度時(shí)流加尿素；維持溫度30- 3230- 32n在發(fā)酵