論文終稿-ADCC

1、哈爾濱醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文文 獻(xiàn) 綜 述遺傳性疾病（hereditary disease）簡(jiǎn)稱遺傳病，即遺傳物質(zhì)改變所導(dǎo)致的疾病。遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA，作為遺傳信息的載體，DNA分子中核苷酸的組成或序列變化可能使基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)的序列或結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能異常。多數(shù)變異對(duì)機(jī)體的功能或健康無(wú)影響，并使機(jī)體對(duì)環(huán)境變化產(chǎn)生更大的適應(yīng)能力，這種無(wú)害的突變稱為多態(tài)性（polymorphism）。但某些突變會(huì)影響機(jī)體的功能，并以一定的方式傳遞給后代，從而導(dǎo)致遺傳性疾病的發(fā)生。另外基因組的不穩(wěn)定性同樣也可能導(dǎo)致遺傳病。遺傳性疾病的研究是醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)的主要內(nèi)容，也是人類遺傳學(xué)的重要突破口。遺傳性

2、疾病的研究通常采用基因定位的方法尋找致病基因，并通過(guò)研究基因突變與疾病發(fā)生的相關(guān)性，來(lái)進(jìn)行遺傳病的診斷、篩查及相應(yīng)的治療。白內(nèi)障（cataract）是一種發(fā)病率高、嚴(yán)重危害人類生存質(zhì)量的疾病，對(duì)其研究歷史已達(dá)一個(gè)世紀(jì)之久。在先天性白內(nèi)障(congenital cataract)的分子遺傳學(xué)研究中，主要以家系研究為基礎(chǔ)，通過(guò)連鎖分析方法確定致病基因在染色體上的位置，并采用定位候選克隆策略，選取可能的候選基因進(jìn)行突變分析，以期對(duì)疾病的發(fā)病機(jī)理有更加深入和透徹的認(rèn)識(shí)。下面僅就遺傳性疾病、基因定位策略及其相關(guān)的遺傳學(xué)算法（主要為簡(jiǎn)單疾病研究中的連鎖分析）及遺傳性先天性白內(nèi)障的研究進(jìn)展做綜合論述。一 遺

3、傳性疾病從環(huán)境與機(jī)體統(tǒng)一的觀點(diǎn)看，人的健康決定于人的遺傳結(jié)構(gòu)與其周圍生活環(huán)境相互作用的平衡，遺傳物質(zhì)或環(huán)境因素的改變均可導(dǎo)致這種平衡的破壞而產(chǎn)生疾病，因此可以說(shuō)，任何疾病的發(fā)生都是遺傳因素與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。據(jù)此可將疾病大致分為以下三類： 遺傳因素起主導(dǎo)作用的疾??； 環(huán)境因素起主要作用的疾??； 遺傳因素與環(huán)境因素都很重要，遺傳因素提供了產(chǎn)生疾病的必要的遺傳背景，環(huán)境因素促使疾病表現(xiàn)出相應(yīng)的癥狀和體征。 遺傳性疾病的特點(diǎn)遺傳性疾病通常具有先天性、終生性和家族性的特點(diǎn)。突變?nèi)舭l(fā)生在配子形成（gametogenesis）期，則雙親并沒(méi)有這類缺陷，而這個(gè)患病個(gè)體成為起始突變者，若患病個(gè)體存活下去

4、并能夠延續(xù)后代，他（她）就可能成為后代子孫患病的祖先，此現(xiàn)象稱建立者效應(yīng)（founder effect）。但有些基因突變或染色體畸變具有致死性或明顯降低生殖力，以致這種缺陷不能傳遞到后代。遺傳性疾病常表現(xiàn)為先天性（如遺傳性先天性白內(nèi)障）且終生患病，但先天性疾?。╟ongenital disease）并不都是遺傳病。在胎兒發(fā)育過(guò)程中，由于環(huán)境因素或母體條件的影響，可出現(xiàn)非遺傳性先天性疾病。而有些遺傳性疾病表現(xiàn)為晚發(fā)，尤其是那些由遺傳和環(huán)境條件共同支配表現(xiàn)型的遺傳性疾病，某些致病基因的作用僅在個(gè)體達(dá)到一定發(fā)育階段后才表現(xiàn)出來(lái)，遺傳性疾病通常表現(xiàn)為家族性，主要是因?yàn)橥患蚁抵械某蓡T可能共同具有某一致

5、病基因。但同一家系的成員長(zhǎng)期處于相似的生活條件和環(huán)境中，使得那些受環(huán)境因素影響較大的非遺傳性疾病有時(shí)也具有家族性。同時(shí)一些遺傳性疾?。[性遺傳病）僅在基因型為純合狀態(tài)下才表現(xiàn)出來(lái)，發(fā)病概率小，因而相似于散發(fā)性疾病。遺傳性疾病的發(fā)病中存在著異質(zhì)性現(xiàn)象，臨床上完全相同或極為相似的癥候群可以由兩種或更多的基因突變所導(dǎo)致，如家族性腦海綿狀血管瘤（Cerebral cavernous malformation, CCM，OMIM#116860）等?？傮w說(shuō)來(lái)，遺傳性疾病具有以下幾個(gè)特征： 垂直傳遞（vertical transmission）遺傳病不同于水平傳遞的傳染病，而是具有上代傳遞給下代的特點(diǎn)。但不

6、是每個(gè)遺傳病的家系中都能觀察到這一現(xiàn)象。因?yàn)橛械幕颊呤鞘状瓮蛔儺a(chǎn)生的病例，即為患病家系中患者的“始祖”；有些遺傳病特別是染色體異常的患者，由于活不到生育年齡或不育，以致在家系中觀察不到垂直傳遞的現(xiàn)象。 遺傳物質(zhì)的突變或染色體畸變。 不是任何細(xì)胞的遺傳物質(zhì)改變都可以傳給下一代，只有生殖細(xì)胞或受精卵的遺傳物質(zhì)發(fā)生改變才可以傳給下一代。腫瘤是一種體細(xì)胞遺傳病，這種病變一般不能傳給下一代。 患者在親代和子代中以一定數(shù)量出現(xiàn)，即患者與正常家庭成員之間有一定的比例關(guān)系。 在有親緣關(guān)系的個(gè)體之間的婚配（近親婚配）所生育的子代中遺傳病發(fā)病率高于一般群體，且該病不延伸至無(wú)親緣關(guān)系的個(gè)體。 單卵雙生比異卵雙生患病

7、的機(jī)會(huì)大得多。 遺傳性病的分類依遺傳物質(zhì)改變的不同，目前普遍將遺傳性疾病分為五類：?jiǎn)位蚣膊』蚍Q簡(jiǎn)單疾?。╩onogenic or simple disorder）、多基因疾病或稱復(fù)雜疾?。╬olygenic or complex disorder）、染色體病（chromosomal disease）、線粒體遺傳?。╩itochondrial disease）和體細(xì)胞遺傳?。ò┌Y）。1 單基因疾病單基因疾病(monogenic disease)是指受一對(duì)主基因異常的影響而發(fā)生的疾病，它的遺傳符合孟德爾定律，也稱孟德爾式遺傳的疾?。∕endelian disease）。目前，人類單基因遺傳的性狀

8、有6,000多種。依傳遞方式不同，又可分為常染色體顯性遺傳病、常染色體隱性遺傳病、X連鎖(顯性和隱性) 遺傳病和Y連鎖遺傳病。 常染色體顯性（autosomal dominant, AD）遺傳病常染色體顯性遺傳病是指如果其致病基因位于常染色體上，以顯性的方式遺傳，即雜合時(shí)即可發(fā)病。如并指I型、軟骨發(fā)育不全和成骨不全癥I型。常染色體顯性遺傳病系譜圖有以下特征： 除新突變外每一患者的雙親中必有一患者； 患者的子女或同胞中患者與非患者的機(jī)會(huì)各為一半； 性狀的傳遞與性別無(wú)關(guān)，即男性與女性患者都可以將遺傳性狀傳遞給兒子或女兒，且患病機(jī)會(huì)均等； 患者的正常子女所生育的后代全部正常； 如該病不損害患者的生存

9、和生育，該性狀便呈垂直傳遞。常染色體顯性的遺傳方式包括完全顯性(complete dominance)、不完全顯性(incomplete dominance)或半顯性(semidominance)、共顯性（codominance）、從性顯性(sex-influenced dominance)、延遲顯性(delayed dominance)和不規(guī)則顯性(irregular dominance)。目前已知人類大約有3,000余種遺傳性狀（包括遺傳?。┦前闯Ｈ旧w顯性遺傳方式傳遞的。 常染色體隱性(autosomal recessive, AR)遺傳病如果一種疾病其致病基因位于常染色體上，傳遞方式是

10、隱性的，即雜合時(shí)并不發(fā)病，而是由攜帶者攜帶著致病基因向后代傳遞，直至隱性純合時(shí)才發(fā)病，以這種方式遺傳的疾病就稱為常染色體隱性遺傳病。這類異常已被認(rèn)識(shí)到1,730種，如白化病。常染色體隱性遺傳病的系譜有如下特點(diǎn)： 患者雙親無(wú)病而肯定是攜帶者； 患者同胞中1/4將會(huì)患病而且男女患病機(jī)會(huì)均等； 患者子女一般并不發(fā)病，所以看不到連續(xù)傳遞，常為散發(fā)的病例； 在近親婚配的情況下，子女中發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高。在致病基因頻率低的常染色體隱性遺傳病中，發(fā)病往往由近親婚配后所導(dǎo)致。 X連鎖遺傳病有些簡(jiǎn)單遺傳病的致病基因位于X染色體上，在上下代之間隨著X染色體傳遞，稱為X連鎖遺傳(X-linkage inheritance

11、)。這類異常已被認(rèn)識(shí)412種。包括X連鎖顯性(X-1inkage dominant, XD)和X連鎖隱性 (X-1inkage recessive, XR) 遺傳。X連鎖遺傳中基因傳遞的方式不同于常染色體遺傳，其存在著交叉遺傳 (criss-cross inheritance) 的現(xiàn)象。也即是男性的X連鎖基因只能是從母系傳來(lái)，并只傳遞給他的女兒。 X連鎖顯性遺傳病若是疾病的致病基因位于X染色體上，雜合時(shí)即可發(fā)病，稱為X連鎖顯性遺傳病，如遺傳性腎病。X連鎖顯性遺傳病系譜特征如下：A. 家系中女性患者多于男性患者；B. 患者雙親一方患??；如果雙親都無(wú)病，則該患者為起始突變者；C. 由于交叉遺傳，男

12、性患者的女兒全將發(fā)病兒子則正常的；女性患者的子女各有1/2發(fā)?。籇. 連續(xù)傳遞即?？梢娺B續(xù)幾代中都有發(fā)病患者。 X連鎖隱性遺傳病若某種遺傳病的致病基因位于X染色體上，雜合時(shí)并不發(fā)病、直至純合時(shí)發(fā)病，稱為X連鎖隱性遺傳病，如假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良和甲型血友病。在這類遺傳病中，男性只有一條X染色體，稱為半合子(hemizygote)，因?yàn)閅染色體上無(wú)等位基因，所以男性也會(huì)表現(xiàn)出相應(yīng)的疾病。X連鎖隱性遺傳病系譜特征如下： A. 家系中男性患者遠(yuǎn)多于女性患者，在一些致病基因頻率低的疾病中，很少看到女性患者；B. 雙親無(wú)病時(shí)，兒子有l(wèi)/2風(fēng)險(xiǎn)患?。慌畠簞t無(wú)患病風(fēng)險(xiǎn)；C. 由于交叉遺傳，患者的兄弟、姨表兄弟、

13、舅父、外甥存在患病風(fēng)險(xiǎn)；D. 因?yàn)橐恍R病有致死效應(yīng)，所以很少看到有男性中連續(xù)傳遞，多見經(jīng)女性攜帶者傳遞。 Y連鎖遺傳病某些疾病的致病基因位于Y染色體上，隨Y染色體而傳遞，從男性傳給男性，稱為Y連鎖遺傳（Y-linkage inheritance）或全男性遺傳（holandric inheritance），這類異常已被認(rèn)識(shí)19種，如無(wú)精子因子。2 多基因疾病除了單基因遺傳病外，臨床上還可見到另外一些在人群中發(fā)病率較高（1%）、常表現(xiàn)為家族性聚集傾向的性狀或疾病。常見性狀如身高、智商等，常見疾病如糖尿病、特發(fā)性高血壓、唇裂、腭裂和精神分裂癥等。這些遺傳性狀或遺傳病不決定于一對(duì)主基因，其遺傳基礎(chǔ)

14、是多對(duì)基因，這些基因?qū)υ撨z傳性狀或遺傳病形成的作用是微小的，且效應(yīng)大小不一，經(jīng)積累、疊加或互補(bǔ)后可以形成明顯的表型，稱為微效基因（minor gene）、加性基因(additive gene)或修飾基因（modifier gene）。近些年研究表明，多基因疾病的遺傳基礎(chǔ)中除微效基因外，也有一些主基因的參與，并受環(huán)境因素的影響，所以這類疾病稱為多基因遺傳(ploygenic inheritance)病或稱多因子遺傳(multifactorial inheritance)病，又稱復(fù)雜疾病(complex disorder)。遺傳基礎(chǔ)和環(huán)境因素共同作用決定人體是否易于患病稱易感性（susceptib

15、ility），在群體多基因遺傳病中呈正態(tài)分布，當(dāng)達(dá)到一個(gè)限度即閾值（threshold）后個(gè)體即表現(xiàn)發(fā)病。多基因病的遺傳常見如下特點(diǎn)： 發(fā)病有家族性聚集傾向，患者親屬發(fā)病率高于群體發(fā)病率，但繪成系譜后不符合任何一種單基因遺傳方式，同胞中發(fā)病率遠(yuǎn)低于1/2或1/4，即不符合AD、AR、XD或XR； 患者雙親、同胞、子女的親緣系數(shù)相同，均為1/2，有相同的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。這與AR病不同，AR病患者雙親和子女般并不發(fā)病，而肯定是攜帶者，患者同胞的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)為1/4； 隨著親屬級(jí)別的降低，患者親屬的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)迅速降低，群體發(fā)病率愈低的病種中，這種特征愈明顯，這與AD病中親屬級(jí)別每降低一級(jí)，發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低1/2的情

16、況也是不同的； 近親婚配時(shí)，子女的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)也增高，但不如AR病那樣顯著； 發(fā)病率有種族(或民族)差異，這表明不同種族(或民族)的基因庫(kù)是不同的。3 線粒體遺傳病在有性生殖中，受精方式的約束決定了線粒體病的母系遺傳現(xiàn)象。曾有一些學(xué)者提出某些疾病可能屬細(xì)胞質(zhì)遺傳，直到1987年Wallace等通過(guò)對(duì)線粒體DNA突變和Leber病的關(guān)系進(jìn)行研究后，才明確提出線粒體DNA突變可引起人類的疾病。短短的十幾年，這一領(lǐng)域的發(fā)展十分迅速?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)人類100余種疾病與線粒體DNA突變有關(guān)，如線粒體心肌病、帕金森等。4 染色體病染色體病是先天性染色體數(shù)目異?；蚪Y(jié)構(gòu)畸變而引起的疾病。數(shù)目異常包括整倍體（如三倍體、四

17、倍體）和非整倍體（如亞二倍體，超二倍體）數(shù)目異常，結(jié)構(gòu)畸變包括缺失、重復(fù)、倒位、易位等斷裂、連接和環(huán)狀染色體等。染色體的行為對(duì)基因組穩(wěn)定性有著十分重要的作用，因此當(dāng)出現(xiàn)數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常時(shí)常引起多種疾病或綜合征，對(duì)機(jī)體危害極為嚴(yán)重，甚至可能致死。臨床上常見的染色體遺傳病有Klinefelter綜合征、Turner綜合征、Downs綜合征等。5 體細(xì)胞遺傳病體細(xì)胞中遺傳物質(zhì)改變導(dǎo)致的疾病稱為體細(xì)胞遺傳病。體細(xì)胞中遺傳物質(zhì)的改變，一般不向后代傳遞。在各種腫瘤的發(fā)病中都涉及到了特定組織中染色體和癌基因或抑癌基因的變化，所以是體細(xì)胞遺傳病。 遺傳性疾病的研究方法遺傳性疾病研究最主要的方法是以家系研究為基礎(chǔ)

18、的連鎖分析（linkage analysis）和以群體研究為基礎(chǔ)的連鎖不平衡分析(linkage disequilibrium analysis，又稱等位基因關(guān)聯(lián)分析，allelic association)，兩者都是利用分布于人類基因組內(nèi)高度多態(tài)的遺傳標(biāo)記（genetic marker）來(lái)尋找致病基因所在的染色體區(qū)域。遺傳圖譜（genetic map）又稱連鎖圖譜(linkage map)或遺傳連鎖圖譜(genetic linkage map)，是指人類基因組內(nèi)基因以及專一的多態(tài)性遺傳標(biāo)記相對(duì)位置的圖譜。多態(tài)性遺傳標(biāo)記是建立遺傳圖譜的要素，也正是由于遺傳標(biāo)記的發(fā)展，使得遺傳圖譜的研究經(jīng)歷了從

19、經(jīng)典的基因連鎖圖譜到現(xiàn)代的DNA標(biāo)記連鎖圖譜的過(guò)程。在經(jīng)典遺傳學(xué)中，重組體在群體中出現(xiàn)的機(jī)率（即重組率）可以反映同一條染色體上兩個(gè)座位間的相對(duì)距離和位置關(guān)系。因此經(jīng)典的遺傳圖譜主要研究多樣性基因所構(gòu)成的連鎖群（linkage group）以及連鎖群中各基因的線性關(guān)系，它可以顯示一個(gè)連鎖群內(nèi)等位基因的順序，但不能告訴人們某個(gè)基因的具體位置，更不能克隆這一基因。經(jīng)典的遺傳圖譜只是停留在遺傳學(xué)的表象階段，其實(shí)際利用價(jià)值不大?，F(xiàn)代遺傳圖譜概念最早由Botstein提出，其精髓在于將單純的表型研究深入到DNA分子的本質(zhì)上去，即表型多樣性對(duì)應(yīng)于DNA分子的多樣性。1 遺傳標(biāo)記及其相關(guān)參數(shù) 遺傳標(biāo)記目前為止

20、遺傳標(biāo)記共經(jīng)歷了三代的發(fā)展，伴隨著遺傳標(biāo)記的發(fā)展，人類也開始逐步了解基因組的結(jié)構(gòu)與功能。 第一代遺傳標(biāo)記第一代標(biāo)記是一類經(jīng)典的遺傳標(biāo)記。最初主要是利用蛋白質(zhì)或免疫學(xué)的標(biāo)記，如ABO血型位點(diǎn)標(biāo)記、HLA位點(diǎn)標(biāo)記等。但是由于已知的多態(tài)的蛋白質(zhì)很少，等位基因的數(shù)目有限且無(wú)法獲得足夠的信息量和檢測(cè)技術(shù)的繁瑣等因素，限制了人類基因組的遺傳分析工作，這促使人們?cè)O(shè)法從DNA上尋找標(biāo)記。70年代中后期建立起來(lái)的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP）是第一代多態(tài)性DNA標(biāo)記。這類標(biāo)記在整個(gè)基因組中確定的位點(diǎn)數(shù)目可達(dá)105以上。RFLP

21、主要研究對(duì)象是各種形式的序列水平上的DNA限制性多態(tài)性，包括單堿基改變、插入或缺失突變、長(zhǎng)度重復(fù)多態(tài)性等引起酶切位點(diǎn)的獲得或丟失，經(jīng)限制性內(nèi)切酶特異性切割后，由于DNA一個(gè)“點(diǎn)”上變異所造成的“能切”與“不能切”的兩種狀況可產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的片段（即等位片段，allele），再通過(guò)凝膠電泳來(lái)顯示這一長(zhǎng)度的多態(tài)性，并從片段多態(tài)性的信息與疾病表型間的關(guān)系進(jìn)行連鎖分析，找到致病基因。這一方法最成功應(yīng)用是在發(fā)病率較高、病情嚴(yán)重的Huntington舞蹈癥基因的定位。雖然RFLP遍布于整個(gè)基因組，但有其局限性，即由于酶切只能產(chǎn)生23個(gè)片段，可提供的信息量有限，有時(shí)還需要用放射性同位素標(biāo)記的DNA片段為探針檢

22、測(cè)RFLP，因而又存在著工作環(huán)境和費(fèi)用等問(wèn)題。 第二代遺傳標(biāo)記第二代遺傳標(biāo)記即大量可變數(shù)量串聯(lián)重復(fù)（variable number tandem repeat, VNTR），比第一代標(biāo)記物有很大的優(yōu)越性，包括微衛(wèi)星（microsatellite）和小衛(wèi)星（minisatellite）等。微衛(wèi)星標(biāo)記系統(tǒng)也稱簡(jiǎn)短串聯(lián)重復(fù)（short tandem repeat, STR），于1989年被發(fā)現(xiàn)和建立，重復(fù)單位為2-6個(gè)核苷酸，其最突出的優(yōu)點(diǎn)是：在基因組中分布較廣，數(shù)目多；由于CA等簡(jiǎn)短重復(fù)不受進(jìn)化上的選擇，以至于在同一位點(diǎn)中數(shù)目變化很大，具有高度多態(tài)性，提供的信息量相對(duì)很大；符合孟德爾遺傳規(guī)律。這樣

23、就可以為連鎖分析提供足夠多的遺傳信息，又加之利用PCR及電泳進(jìn)行檢測(cè)的手段相對(duì)容易，可以實(shí)現(xiàn)操作自動(dòng)化，使得這一系統(tǒng)成為目前在基因定位的研究中應(yīng)用最多的標(biāo)記系統(tǒng)，并用做大規(guī)?；蚪M掃描方法的基礎(chǔ)。微衛(wèi)星系統(tǒng)使人類基因組的遺傳制圖與連鎖分析發(fā)生了革命性的變化，在一定程度上推動(dòng)了許多復(fù)雜的多基因遺傳病的研究。1996年初，法國(guó)Gnthon實(shí)驗(yàn)室與美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院幾個(gè)中心合作，建立了有5,264個(gè)以STR為主體的遺傳標(biāo)記，兩個(gè)標(biāo)記之間的平均距離為0.7cM，即兩個(gè)位點(diǎn)之間有0.7的幾率進(jìn)行遺傳重組(1)。 第三代遺傳標(biāo)記隨著基因組研究的發(fā)展，1996年美國(guó)麻省理工學(xué)院（MIT）的人類基因組研究中心

24、負(fù)責(zé)人Lander ES又提出了一類新的稱作SNP（Single Nucleotide Polymorphism, SNP）的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)(2)，即單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記，也稱第三代遺傳標(biāo)記系統(tǒng)。人類群體中有很大的遺傳多樣性，而在大多數(shù)基因位點(diǎn)上都會(huì)有若干個(gè)等位型（alleles）；對(duì)每一個(gè)核苷酸來(lái)說(shuō)，其突變率大約為10-9左右，這就意味著每一個(gè)核苷酸在任何一代人群中大約每1109個(gè)個(gè)體就會(huì)發(fā)生一次變異。由這種方式產(chǎn)生的單堿基變異就形成許多雙等位型標(biāo)記（biallelic maker），這種標(biāo)記平均約每1,000個(gè)堿基對(duì)就會(huì)有一個(gè)，在人類基因組中可達(dá)3106個(gè)。因此34個(gè)相鄰的這種標(biāo)記構(gòu)成的單倍型

25、（haplotype）就可以有816種，相當(dāng)于一個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記形成的多態(tài)性，目前已知約有60,000個(gè)SNP位于基因外顯子區(qū)域，即85%的基因外顯子相距5kb就有1個(gè)已發(fā)現(xiàn)的SNP。這種標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用摒棄了遺傳標(biāo)記分析技術(shù)的“瓶頸”凝膠電泳，同時(shí)數(shù)目多、覆蓋密度大，為DNA芯片或微陣列技術(shù)應(yīng)用于遺傳作圖提供了基礎(chǔ)，因此在基因定位研究中就有著其它標(biāo)記不可比擬的優(yōu)越性(3)。 多態(tài)性標(biāo)記的相關(guān)參數(shù)能夠成為DNA標(biāo)記的多態(tài)性位點(diǎn)必須具有足夠的信息度（informativeness）。衡量信息度的參數(shù)主要有多態(tài)信息含量（polymorphic information content, PIC）和雜合度

26、（heterozygosity）。標(biāo)記的多態(tài)信息含量是家系中推斷得到的信息提供者的期望分?jǐn)?shù)，理論上PIC應(yīng)在01之間，PIC等于0時(shí)意味這一標(biāo)記位點(diǎn)的等位片段只有一個(gè)，等于1時(shí)表示其等位片段無(wú)限多，一般認(rèn)為PIC大于0.7的標(biāo)記是高信息度的。雜合度是指隨機(jī)選擇的某個(gè)個(gè)體在某一標(biāo)記位點(diǎn)上同時(shí)有兩個(gè)雜合的等位片段的可能性。PIC一般要比雜合度低，因此可以作為某些特殊交配條件下雜合度的校正量。標(biāo)記系統(tǒng)的信息度對(duì)于遺傳病的基因定位是非常關(guān)鍵的，往往直接影響多態(tài)性標(biāo)記連鎖圖譜的構(gòu)建。目前典型的基因組掃描使用微衛(wèi)星標(biāo)記密度在10cM左右，雜合度大多在0.65-0.8之間，如Genthon的遺傳圖譜的終分辨

27、率為0.7。一般說(shuō)來(lái)，在相同PIC值要求下，SNP圖譜的密度應(yīng)為微衛(wèi)星圖譜的2.25-2.5倍。這樣，在相同的信息提取效果下，使用10cM間隔的微衛(wèi)星圖譜即300個(gè)左右的微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行的初期連鎖分析，與4cM分辨率的約750個(gè)SNP圖譜差不多，但顯然后者對(duì)基因定位的范圍更窄。提高某個(gè)位點(diǎn)信息度和雜合度的方法是確定該位點(diǎn)相鄰近區(qū)域的其他多態(tài)性位點(diǎn)，一定范圍內(nèi)多態(tài)性位點(diǎn)連鎖相所構(gòu)成的單倍型就可以做為一個(gè)整體的標(biāo)記位點(diǎn)去看待。2 基因定位與克隆建立起表型與基因型之間的關(guān)系是遺傳學(xué)的基本目標(biāo)，人類遺傳學(xué)主要分析引起個(gè)體間表型差異的遺傳機(jī)制，醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)則主要研究導(dǎo)致疾病發(fā)生的遺傳機(jī)制。然而，尋找決定表型

28、或疾病性狀的基因是非常困難的，因?yàn)闊o(wú)法象對(duì)待其它生物一樣對(duì)人體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)。雖然孟德爾的遺傳規(guī)律很早就已經(jīng)用于植物以及動(dòng)物的育種工作，但在1980年提出使用遺傳多態(tài)性標(biāo)記來(lái)進(jìn)行全基因組連鎖分析之前，人們甚至是對(duì)于簡(jiǎn)單的孟德爾遺傳病也沒(méi)有一個(gè)可以普遍使用尋找致病基因的方法。人類基因組計(jì)劃開展后，人們對(duì)自身基因組有了進(jìn)一步的了解，隨著遺傳圖譜、物理圖譜、序列圖譜和基因圖譜的發(fā)展和完善，以及與此相應(yīng)發(fā)展起來(lái)的技術(shù)和算法為人們提供了研究表型和基因型的紐帶，使人們認(rèn)識(shí)到越來(lái)越多的疾病的直接病因及其發(fā)病機(jī)制?；蚨ㄎ?gene mapping)就是利用不同的方法將基因確定到染色體的實(shí)際位置上。在基因定位的

29、歷史上，1911年Wilson人類將紅綠色盲基因首次定位到X染色體上，開創(chuàng)了基因定位的先河。基于技術(shù)及方法的局限性，1968年前利用家系連鎖分析定位的基因都局限于X染色體， 1968 年Donahue利用系譜分析將Duffy血型基因定位于1號(hào)染色體上，這是人類首次將基因定位于常染色體上。1970年代以來(lái)，各種生物技術(shù)迅速興起，特別是體細(xì)胞雜交、重組DNA、分子雜交和PCR等技術(shù)的出現(xiàn)和應(yīng)用，使得基因定位的方法愈益先進(jìn)。隨著人類基因組計(jì)劃的正式啟動(dòng)，基因定位更是迅猛發(fā)展，其成果是導(dǎo)致克隆了越來(lái)越多的致病基因，提高了對(duì)疾病產(chǎn)生的病因?qū)W認(rèn)識(shí)，并開拓了先進(jìn)的基因診斷和基因治療技術(shù)?；蚨ㄎ挥畜w細(xì)胞雜交

30、（somatic cell hybridization）、雜種細(xì)胞克隆嵌板(panel of clonal hybrids)、原位雜交（in situ hybridization, ISH）、熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)、放射雜種(radiation gybrid)、同線同源定位、連鎖分析(linkage analysis)等方法。無(wú)論是哪種方法，都是試圖建立基因和疾病表型之間的某種可能聯(lián)系。其中連鎖分析既是最傳統(tǒng)又是與現(xiàn)代生物技術(shù)結(jié)合有新發(fā)展的重要基因定位方法。人類的各種遺傳病有6,000多種，許多遺傳病導(dǎo)致的表型與正常表型

31、相比形成了遺傳病的多樣性。利用表型多樣性與多態(tài)性的DNA標(biāo)記間的連鎖分析，我們就可以將該致病基因定位于染色體的某一位置乃至某個(gè)標(biāo)記附近，再通過(guò)各種其他手段，就有可能克隆到該基因，從而為揭示遺傳病的致病機(jī)理及進(jìn)一步遺傳咨詢和治療奠定基礎(chǔ)。目前用于克隆的方法主要有4種： 定位克?。╬ositional cloning）定位克隆是伴隨著人類基因組計(jì)劃而發(fā)展起來(lái)的基因克隆的新策略，是通過(guò)疾病表型來(lái)觀察致病基因與多態(tài)性標(biāo)記之間的連鎖關(guān)系，而將基因定位并進(jìn)一步分離和克隆的策略。其起點(diǎn)是定位，即建立表型（包括疾?。┡c基因組中的某一區(qū)域之間的聯(lián)系，然后應(yīng)用“物理圖譜”的物理標(biāo)記來(lái)將經(jīng)典遺傳學(xué)標(biāo)記轉(zhuǎn)變?yōu)椤拔锢順?biāo)

32、記所代表的明確的基因組區(qū)域，再以相關(guān)區(qū)域的“鄰接克隆群”來(lái)篩選可表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因，即建立該區(qū)域的轉(zhuǎn)錄圖，然后比較患者與正常人這些結(jié)構(gòu)基因的區(qū)別以確定與疾病相關(guān)的改變，最后確定疾病相關(guān)基因。定位克隆抓住了“表型”與“基因”之間的實(shí)質(zhì)性聯(lián)系，而摒棄了在這兩者間發(fā)生的多途徑、多因子參與、漫長(zhǎng)而復(fù)雜的生理生化過(guò)程。 功能克隆（functional cloning）人類的性狀（包括疾?。┒寂c蛋白質(zhì)功能有關(guān)。功能克隆便是從蛋白質(zhì)功能著手的基因分離策略，是利用基因的產(chǎn)物蛋白質(zhì)或RNA推知相應(yīng)基因的序列。功能克隆技術(shù)成熟、方法直接、費(fèi)用較低，且不依賴于基因組信息。在許多研究中，由于對(duì)疾病癥狀的生理生化及有關(guān)蛋白

33、質(zhì)了解甚少，因此功能克隆較為適用。其缺點(diǎn)是得不到每一基因的具體功能，也不易與人類遺傳性疾病取得從表型到遺傳型的一致性。鐮狀細(xì)胞貧血病的基因鑒定就是功能克隆的典型例子。 候選克?。╟andidate cloning）候選克隆策略是隨著人類基因組計(jì)劃的進(jìn)展，已定位克隆的基因越來(lái)越多的情況下派生出來(lái)的一種新的捷徑。它是根據(jù)與遺傳疾病可能相關(guān)的生理特征，去進(jìn)一步確定與這些生理特征相關(guān)的候選基因，再在這些候選基因上尋找與疾病表型可能相關(guān)的數(shù)據(jù)，以此確定致病基因的方法。候選克隆策略主要是對(duì)一些多基因或表型復(fù)雜的疾病較為適用，但其風(fēng)險(xiǎn)較大，而且受到許多尚未克隆的可能相關(guān)候選基因的限制。 定位候選克?。╬os

34、itional candidate cloning）定位候選克隆是定位克隆與其他幾種克隆手段的交叉和結(jié)合，是基于家系基礎(chǔ)上的遺傳性疾病研究最常用的方法，也是目前最有前途和發(fā)展前景的克隆策略。它是通過(guò)遺傳圖譜與連鎖分析先將致病基因定位于染色體的某一適當(dāng)狹窄的區(qū)域，再對(duì)該區(qū)域中分布的基因位點(diǎn)一一進(jìn)行篩選和確認(rèn)從而找到與遺傳病相關(guān)的基因。其基本步驟如下： 搜集有價(jià)值的遺傳病家系并進(jìn)行詳細(xì)的資料整理。對(duì)遺傳病家系要進(jìn)行認(rèn)真細(xì)致的資料整理工作，并采集家系成員外周血進(jìn)行DNA提取。一個(gè)較大、多世代個(gè)體、親緣關(guān)系肯定的大家系，能在一定程度上排除座位異質(zhì)性；而詳盡確鑿的臨床診斷不但能確定疾病的類型，還能排除家

35、系的臨床異質(zhì)性，這些都為后續(xù)研究提供了良好的工作基礎(chǔ)； 應(yīng)用連鎖分析的方法對(duì)疾病的遺傳位點(diǎn)進(jìn)行定位。選擇足夠數(shù)量和適當(dāng)密度的多態(tài)性遺傳標(biāo)記對(duì)家系中成員的DNA進(jìn)行基因掃描，可分初步掃描和精細(xì)掃描兩步進(jìn)行，力求將致病基因精細(xì)定位至染色體適當(dāng)狹窄區(qū)域； 用多個(gè)遺傳標(biāo)記的基因分型組成家系成員的單倍型，根據(jù)單倍型重組情況盡可能縮小連鎖區(qū)域； 在已確定的染色體區(qū)域內(nèi)，利用人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的數(shù)據(jù)，尋找與疾病的生理、生化及功能相關(guān)的候選基因； 對(duì)候選基因進(jìn)行突變分析，尋找能夠引起蛋白質(zhì)產(chǎn)物序列或結(jié)構(gòu)改變、并引起功能障礙的病理性突變或其他改變，如單堿基改變、插入、缺失突變等，并確認(rèn)與疾病發(fā)生相關(guān)的突變；

36、 對(duì)致病基因的突變進(jìn)行功能研究，進(jìn)一步確認(rèn)其在疾病發(fā)病中的作用。從二十世紀(jì)八十年代晚期定位候選策略取得成功后，已經(jīng)成功確定了幾百個(gè)遺傳病的基因，最成功的例子是囊性纖維化(CF)基因的定位與克隆。囊性纖維化是一種嚴(yán)重的常染色體隱性遺傳病，以前關(guān)于該基因的mRNA和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)無(wú)任何資料。人們利用定位克隆策略將該基因定位于7q，并借助DNA標(biāo)記進(jìn)行遺傳分析將這一區(qū)域進(jìn)一步縮小，通過(guò)“染色體步移”和“染色體跳躍”技術(shù)找到了致病基因，并將由基因結(jié)構(gòu)推測(cè)得到的氨基酸序列和已知功能的蛋白質(zhì)序列相比較獲得了有關(guān)基因功能的信息。這就為研究突變引起的基因功能改變開辟了廣闊的領(lǐng)域，并使人們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到基因突變與疾病

37、嚴(yán)重程度和病程變異之間的相互關(guān)系Vogel-Motulsky,1999。目前，由于人類基因組計(jì)劃的不斷完善，人類染色體上的大部分基因序列已知。隨著分子方法在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)諸多領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，不借助于任何已知的單基因性狀或疾病，而直接分析正?；虻姆椒ㄔ絹?lái)越普遍。3 連鎖分析 連鎖（linkage）是一種遺傳現(xiàn)象，指當(dāng)同一染色體上某些位點(diǎn)由于相距很近，在減數(shù)分裂過(guò)程中發(fā)生交換的機(jī)率較小，因此具有較大的機(jī)會(huì)連在一起從親代傳到子代。連鎖分析（linkage analysis）既是最早、較傳統(tǒng)的，又是與現(xiàn)代生物技術(shù)相結(jié)合有新發(fā)展的重要基因定位方法。隨著對(duì)多種疾病研究的深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到以連鎖圖譜為工具

38、進(jìn)行基因定位，進(jìn)而采用基因克隆策略可以獲得從表型到基因型的直接聯(lián)系，具有不可比擬的優(yōu)點(diǎn)。利用連鎖的原理研究致病基因與遺傳標(biāo)記的關(guān)系，也就是根據(jù)基因座位的重組率來(lái)計(jì)算兩座位之間的遺傳距離。由于基因在染色體上呈直線排列，不同基因相互連鎖成連鎖群（linkage group），因此可以通過(guò)被定位的基因與同一染色體上另一基因或遺傳標(biāo)記相連鎖的特點(diǎn)進(jìn)行基因定位。 連鎖分析的原理生殖細(xì)胞中一對(duì)同源染色體上存在的兩個(gè)相鄰基因座位，在減數(shù)分裂時(shí)可以發(fā)生交換，距離越遠(yuǎn)發(fā)生交換的機(jī)會(huì)越多，越有可能出現(xiàn)基因重組。重組率與成熟分離過(guò)程中遺傳物質(zhì)的交換密切相關(guān)，染色體上位點(diǎn)之間的距離越遠(yuǎn)，發(fā)生重組的可能性就越大；距離越

39、近，則重組的可能性就越小。確定位點(diǎn)之間遺傳距離通常借助統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來(lái)進(jìn)行。經(jīng)典方法是計(jì)算位點(diǎn)間的重組分?jǐn)?shù)（recombination fraction）或稱重組率（recombination rate），通常用q 表示，即兩個(gè)配對(duì)的基因間所有組合事件中發(fā)生重組的比率或發(fā)生交換的配子數(shù)占總配子數(shù)量的百分比率。1910年摩爾根提出同一染色體上兩個(gè)位點(diǎn)間在100次減數(shù)分裂中發(fā)生1次重組的機(jī)會(huì)時(shí)，即q 等于1時(shí)定義兩位點(diǎn)間的相對(duì)距離為1厘摩（centimorgan, cM），這一相對(duì)距離稱為遺傳距離（genetic distance）。嚴(yán)格地說(shuō)，重組率并不等同于遺傳距離，僅僅在表示同一染色體上兩座位之間

40、關(guān)系時(shí)，重組率才等于遺傳距離。重組率q 介于0-50%，如果等于50%就意味著完全隨機(jī)組合而失去意義，也就是兩個(gè)不連鎖（位于不同染色體上或位于同一染色體上但相距甚遠(yuǎn)）基因的重組率，其遺傳效應(yīng)類似于位于不同染色體上的座位的“自由組合”。在遺傳圖譜上相距較遠(yuǎn)的兩個(gè)基因座之間，由于二次重組的存在，重組值會(huì)變小，但不會(huì)超過(guò)50%。同一染色體上座位之間的遺傳學(xué)距離是可以累加的，人類基因組的遺傳大小為3,600cM。 連鎖分析的研究方法連鎖分析通常采用家系分析的方法，通過(guò)研究遺傳標(biāo)記與致病基因位點(diǎn)在家系中的共分離現(xiàn)象來(lái)研究二者連鎖與否，從而確定致病基因位點(diǎn)。傳統(tǒng)的連鎖分析方法包括經(jīng)典的優(yōu)勢(shì)對(duì)數(shù)分?jǐn)?shù)法和多點(diǎn)

41、連鎖定位法等，一般要提供諸如外顯率、擬表型率及遺傳模式等參數(shù)。為了克服傳統(tǒng)連鎖分析方法需要一定參數(shù)的缺點(diǎn)，在等位基因共享的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)許多非參數(shù)連鎖分析法，常用有受累同胞對(duì)（affected sib-pair, ASP）和受累家系成員（affected pedigree member, APM）法。其理論基礎(chǔ)是來(lái)源于同一祖先的致病基因由受累的親屬共占(identical by descent, IBD)的幾率要大于隨機(jī)分配的幾率。等位基因共占的分析方法較連鎖分析方法檢測(cè)樣本和DNA標(biāo)記所需更多，僅是對(duì)家系要求降低，不需要完整的家系資料，兄弟、叔侄等配對(duì)資料也適用，因此可以作為傳統(tǒng)連鎖分析方法

42、的補(bǔ)充。 優(yōu)勢(shì)對(duì)數(shù)分析法(logarithm of odds score, likelihood of odds score, Lods)連鎖分析中最常用和公認(rèn)有效的是Morton 于1955年首次提出后經(jīng)改進(jìn)的Lod值法。它是指在給定q值的前提下，兩個(gè)遺傳位點(diǎn)連鎖的概率相對(duì)于不連鎖的概率比值的常用對(duì)數(shù)值，常用Z表示，q即發(fā)生交換的配子占總配子的數(shù)量比。公式為：Z(q)=log10 L(q)/L(1/2) ( 0q0.5)若Z(q)-2則可以排除連鎖；-2Z(q)1或Z(q)1，提示連鎖；Z(q)2，支持連鎖；Z(q)3，表明在給定q值的條件下連鎖的可能性比不連鎖的可能性等于或大于一千倍，提示

43、連鎖有極顯著意義，可定義為連鎖；對(duì)于X連鎖來(lái)說(shuō)，LOD值或Z(q)2時(shí)，即可定義為連鎖。重組率的判斷為：q0.10為緊密連鎖（遺傳距離小于10cM；0.10q0.45表示兩位點(diǎn)不在同一條染色體上。Lod值法是一種參數(shù)方法，進(jìn)行分析時(shí)要給出疾病的遺傳模式、疾病的基因頻率、外顯率、擬表型率等，這些參數(shù)須通過(guò)于臨床、流行病學(xué)資料來(lái)獲取。應(yīng)用Lod值法對(duì)分析的家系有一些要求，雙親或單親(即其中一個(gè)親代)必須是雙雜合子(即所分析的兩個(gè)性狀均處于雜合狀態(tài)的個(gè)體)。這樣，人們便能通過(guò)兩雜合性狀在其子代中的連鎖和互換情況進(jìn)行Lod值估算。Lod值法是一種序貫概率比檢驗(yàn)法，其優(yōu)點(diǎn)是：可用于分析較易獲得的二代小家

44、系資料，可以將不同的家系的資料合并處理；可用于雙重雜合子的連鎖相及親代基因型未知的情況；所需樣本量較小，一旦根據(jù)計(jì)算結(jié)果能作結(jié)論即可停止調(diào)查；估計(jì)基因重組率結(jié)果可靠。 多點(diǎn)連鎖定位法(multpoint linkage mapping)多點(diǎn)連鎖定位法可將一致病基因定位于遺傳標(biāo)記的框架內(nèi)。在分析兩個(gè)以上基因座數(shù)據(jù)時(shí)，多點(diǎn)連鎖分析是有用的。分析多基因座可建立一套基因座染色體的次序，為此應(yīng)用三點(diǎn)雜交(three-point cross)法，比在一系列的兩點(diǎn)交換分析估計(jì)A、B和C三個(gè)基因之間的重組值更為有效。這類多點(diǎn)定位作圖的優(yōu)點(diǎn)有助于克服標(biāo)記的有限信息。在一家系中某些減數(shù)分裂可對(duì)標(biāo)記A提供信息，而另

45、一些對(duì)A無(wú)信息，但對(duì)鄰近的標(biāo)記B可提供信息，只有同時(shí)用標(biāo)記A、B進(jìn)行疾病基因連鎖分析才能提供信息?，F(xiàn)在已有提供很高信息的微衛(wèi)星標(biāo)記，這樣就可以構(gòu)建一個(gè)有次序的多點(diǎn)標(biāo)記框架來(lái)確定某一致病基因的位置。 受累同胞對(duì)分析法（affected sib-pair, ASP）該法由Penrose于1935年提出。應(yīng)用ASP法檢出連鎖關(guān)系，并不依賴于遺傳模式，而是依賴于受累的患病同胞對(duì)是否共享等位基因。ASP法適用于分析具有2個(gè)或以上患病同胞和他們父母組成的小家系，主要對(duì)患病同胞中共有的遺傳標(biāo)記和易感主基因相連鎖的單倍型進(jìn)行分析，如果兩個(gè)位點(diǎn)不連鎖，就會(huì)符合孟德爾的獨(dú)立分配定律，此時(shí)1/4的受累同胞對(duì)共享父源

46、和母源遺傳標(biāo)記的0個(gè)等位基因，1/2的受累同胞對(duì)共享等位基因中的1個(gè)等位基因，1/4的受累同胞對(duì)共享2個(gè)等位基因。如果遺傳標(biāo)記與致病基因連鎖的，受累同胞對(duì)共享等位基因就會(huì)偏離這一比例。共有1個(gè)或者2個(gè)等位基因患病同胞對(duì)的比例會(huì)升高，共有0個(gè)等位基因的患病同胞對(duì)的比例則會(huì)降低。ASP法已經(jīng)有許多統(tǒng)計(jì)分析方法比較成熟，如Suarez法、Green法、IBS法等， I型糖尿病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎就采用該方法進(jìn)行分析的。對(duì)于發(fā)病晚而難于獲得幾個(gè)世代遺傳標(biāo)記和發(fā)病狀態(tài)的數(shù)據(jù)者，Lod值法就無(wú)能為力，而ASP法仍可獲得明確結(jié)果。即使在疾病存在異質(zhì)性時(shí)，ASP法仍具有較強(qiáng)的檢驗(yàn)連鎖能力。 受累家系成員法（aff

47、ected pedigree member, APM）受累家系成員連鎖分析作為IBD的一種，是ASP法的一個(gè)推廣，是通過(guò)任何兩個(gè)有血緣關(guān)系受累親屬標(biāo)記位點(diǎn)的分布來(lái)檢驗(yàn)DNA標(biāo)記與致病基因的分離是否獨(dú)立，從而推斷兩者是否連鎖的一種統(tǒng)計(jì)方法。從理論上講APM法不如ASP法，但仍具有以下優(yōu)點(diǎn)：數(shù)據(jù)來(lái)源較廣、標(biāo)記表型的檢測(cè)工作量小，數(shù)據(jù)處理簡(jiǎn)捷；不需準(zhǔn)確設(shè)定疾病的遺傳模型，適用于不符合孟德爾遺傳方式的復(fù)雜疾病的連鎖定位分析；可用于較難獲得多代標(biāo)記基因型與發(fā)病狀態(tài)數(shù)據(jù)的遲發(fā)性遺傳病及發(fā)病后易易死的疾病。該方法已成功地運(yùn)用于乳腺癌、Alzheimer等疾病的基因定位分析。APM法的缺點(diǎn)是不能提供致病基因位

48、點(diǎn)與連鎖標(biāo)記位點(diǎn)之間的距離；需提供各標(biāo)記等位基因的群體基因頻率數(shù)據(jù)；基因頻率的準(zhǔn)確性對(duì)檢驗(yàn)效能有很強(qiáng)影響；另外，標(biāo)記位點(diǎn)的多態(tài)性程度也會(huì)影響APM的計(jì)算。 連鎖分析的軟件進(jìn)行連鎖分析主要借助于各種各樣的計(jì)算機(jī)軟件，常用的有LINKAGE軟件包、GENEHUNTER以及用于構(gòu)建連鎖圖的MULTIMAP、CRI-MAP和MAPMARKER等。LINKAGE軟件包是比較經(jīng)典的連鎖分析軟件，適合于大家系的連鎖分析，其中每個(gè)個(gè)體只用少量遺傳標(biāo)記即可進(jìn)行分析。GENEHUNTER由于計(jì)算機(jī)運(yùn)行速率的限制，一般只適用于不超過(guò)20人的小家系，每個(gè)個(gè)體須用大量遺傳標(biāo)記進(jìn)行分析，除了可用于單基因疾病的連鎖分析外，

49、GENEHUNTER還可以進(jìn)行非參數(shù)分析。 連鎖分析的應(yīng)用及其發(fā)展連鎖分析技術(shù)出現(xiàn)之前，人們只能通過(guò)表型對(duì)遺傳病的進(jìn)行深入研究。因此“經(jīng)典”的遺傳學(xué)分析不得不遵循這樣一條途徑：以表型為起點(diǎn)，由器官、組織、細(xì)胞、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)逐層深入，直到獲取基因及其突變的有關(guān)信息。生化遺傳學(xué)的發(fā)展使人們可以從基因產(chǎn)物的水平（如酶缺陷）通過(guò)遺傳密碼將氨基酸的改變與DNA的變異聯(lián)系起來(lái)。但是這種方法的局限性在于，對(duì)某種疾病研究的初期不可能對(duì)病因有很深入的認(rèn)識(shí)，而生化指標(biāo)并不能準(zhǔn)確無(wú)誤地指向某一缺陷，因此很難將疾病的表型與特定的遺傳缺陷聯(lián)系起來(lái)。簡(jiǎn)單疾病的致病基因定位最成功的方法是連鎖分析，它采用家系樣品，尋找家系內(nèi)遺

50、傳標(biāo)記與疾病在傳遞中的分離情況。由于物理位置接近的位點(diǎn)比相距更遠(yuǎn)的位點(diǎn)在減數(shù)分裂重組中更難分離開，因此與疾病狀態(tài)共分離的遺傳標(biāo)記事實(shí)上提示了致病基因在染色體上的大致位置。連鎖分析的優(yōu)點(diǎn)在于不依賴于對(duì)疾病病理和生理生化異常的了解。對(duì)于很多單基因疾病，只要提供足夠的家系及流行病學(xué)資料、適當(dāng)可提供多態(tài)性信息的DNA標(biāo)記、有效的統(tǒng)計(jì)方法和分析軟件，便可以利用連鎖分析方法將致病基因進(jìn)行定位，從而為定位克隆策略提供了基礎(chǔ)。另一方面，連鎖分析也可以應(yīng)用于疾病診斷，即使致病基因尚未被克隆，也可通過(guò)遺傳標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析，將致病基因定位于染色體特定區(qū)域并以此來(lái)進(jìn)行位置候選基因克隆。連鎖分析對(duì)致病基因進(jìn)行定位，應(yīng)選

51、擇足夠數(shù)量的覆蓋整個(gè)人類基因組的多態(tài)性遺傳標(biāo)記。通常我們選擇ABI公司提供的經(jīng)優(yōu)化的、成套的微衛(wèi)星標(biāo)記，對(duì)家系中成員的樣本進(jìn)行全基因組的初步掃描，經(jīng)連鎖分析提示與疾病發(fā)生相關(guān)的染色體區(qū)域，進(jìn)一步利用法國(guó)Gnthon實(shí)驗(yàn)室提供的高密度遺傳標(biāo)記對(duì)致病基因進(jìn)行精細(xì)定位。對(duì)多個(gè)遺傳標(biāo)記的基因分型排列每個(gè)家系成員的單倍型，根據(jù)單倍型的重組情況確定致病基因在染色體上的精細(xì)區(qū)域，盡可能縮小連鎖區(qū)域。通過(guò)單倍型在減數(shù)分裂過(guò)程中的重組現(xiàn)象可以把與疾病表型連鎖的單倍型區(qū)域縮小到較小的范圍。在定位區(qū)域內(nèi)部或者附近利用人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的數(shù)據(jù)尋找與疾病的生理生化功能相關(guān)的候選基因選擇可疑基因作為候選基因，然后對(duì)其

52、進(jìn)行DNA序列分析，查找突變并對(duì)其進(jìn)行功能研究。傳統(tǒng)的連鎖分析在單基因遺傳病的基因定位中做出了很大的貢獻(xiàn)，但仍存在著一定的局限：首先，連鎖分析的分辨率常是以厘摩(cM)為單位，在人類基因組中這意味著幾百甚至上千個(gè)基因；其次，即使家系分析定位到了基因水平，找到的突變也很可能只是在特定家系中呈孟德爾方式傳遞，而對(duì)群體范圍的復(fù)雜疾病表型并沒(méi)多大幫助。另外復(fù)雜疾病外顯率很低，這意味著需要大量的可用信息才能檢測(cè)到關(guān)聯(lián)，而符合統(tǒng)計(jì)效力的大家系幾乎不可能找到。在簡(jiǎn)單疾病基因定位的最后階段，人們也常使用連鎖不平衡分析，因?yàn)樗萌后w來(lái)進(jìn)行研究，有效地利用了過(guò)去歷史上許多世代發(fā)生的重組事件的影響，因此能進(jìn)行基因

53、的精細(xì)定位。由于連鎖分析和連鎖不平衡分析各自的優(yōu)缺，在復(fù)雜疾病的研究中人們常采用結(jié)合這兩種方法的“兩步法遺傳分析”來(lái)定位基因。這種方法先使用家系樣品和較為疏散的遺傳標(biāo)記，通過(guò)連鎖分析定位大的候選區(qū)域；再使用家系樣品或基于群體的樣品對(duì)連鎖提示的區(qū)域進(jìn)行高密度遺傳標(biāo)記的連鎖不平衡分析來(lái)精細(xì)定位，現(xiàn)在已經(jīng)有很多這方面的成功范例。隨著人們對(duì)遺傳性疾病的研究深入，連鎖分析的算法及軟件有了諸多改進(jìn)，并且在復(fù)雜性疾病的基因定位中也起到了一定作用。二 遺傳性先天性白內(nèi)障 圖1 眼球水平切面圖 晶狀體的生理構(gòu)造眼是視覺(jué)器官，包括眼球、視路和眼附屬器。眼球由眼球壁和內(nèi)容物組成，如圖1。眼球壁由外向內(nèi)依次為纖維膜（

54、包括角膜和鞏膜）、血管膜（包括虹膜、睫狀體和脈絡(luò)膜）和視網(wǎng)膜。眼內(nèi)容物包括房水、晶狀體和玻璃體，通常與角膜一起統(tǒng)稱為眼的屈光裝置，透明且具有一定的屈光指數(shù)，以保證光線通過(guò)。圖2 晶體剖面圖晶狀體（lens）也稱晶體，是眼屈光裝置的重要組成部分，具有獨(dú)特的屈光通透和折射功能，在視力調(diào)節(jié)中起重要作用。當(dāng)看近物時(shí)，睫狀肌收縮，睫狀體向前方移動(dòng)，睫狀小帶放松，晶狀體借彈性而變厚，屈光增強(qiáng)；反之，在看遠(yuǎn)物時(shí)，睫狀肌舒張使睫狀小帶拉緊，晶狀體變薄。晶狀體還可濾去部分紫外線，對(duì)視網(wǎng)膜有保護(hù)作用。晶體發(fā)生病變時(shí)容易混濁產(chǎn)生白內(nèi)障，從而引起視覺(jué)障礙。晶狀體為具有彈性的雙凸透明體，本身無(wú)血管和神經(jīng)，其營(yíng)養(yǎng)由房水和

55、玻璃體供給。晶狀體形似雙凸透鏡（如表2），分為前后兩面，前面的曲度較小，中心點(diǎn)為前極；后面的曲度較大，中心點(diǎn)為后極；兩面相接的邊緣為赤道。前后極間的直線叫晶體軸，軸的長(zhǎng)度即晶體厚度為45mm，晶體直徑為9-10mm。晶體的組織結(jié)構(gòu)為： 包圍整個(gè)晶體的囊； 位于前囊下的上皮細(xì)胞； 晶體細(xì)胞（晶體纖維）； 晶體懸韌帶。 晶體囊 （lens capsule）晶體囊是一層富有彈性和韌性的均質(zhì)性透明薄膜，包繞著晶體上皮及晶體細(xì)胞，是晶體上皮細(xì)胞的分泌產(chǎn)物。晶體囊為上皮細(xì)胞的基底膜，囊與上皮緊密相連，兩者之間沒(méi)有任何間隙。上皮細(xì)胞代謝旺盛區(qū)（生發(fā)區(qū)）即赤道部的前囊及赤道部囊最厚；后囊為胚胎上皮細(xì)胞的產(chǎn)物，

56、出生以后后囊下已無(wú)上皮細(xì)胞，不再增厚，所以后囊最薄。 晶體上皮 （lens epithelium）晶體上皮位于前囊及赤道部囊下，新生晶體細(xì)胞表面為單層上皮細(xì)胞，后囊下沒(méi)有上皮（胚胎發(fā)育過(guò)程中后部上皮已形成原始晶體細(xì)胞）。晶體上皮分為中央部（前極部）、赤道部及介于兩者之間的中間部，中央部為靜止區(qū)，中間及赤道部為生發(fā)區(qū)，其中赤道部上皮細(xì)胞不斷增生形成新的晶體細(xì)胞，三區(qū)的上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)相似。上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體，較小的線粒體，高爾基體、微管與微絲。上皮細(xì)胞逐漸向赤道部移行，細(xì)胞核呈圓形及橢圓形，并逐漸伸長(zhǎng)，核膜界限清楚。 晶體細(xì)胞（lens celles）細(xì)胞為單層立方上皮，長(zhǎng)

57、約8-10mm的六棱柱體，構(gòu)成晶狀體的實(shí)質(zhì)，是晶體代謝、合成及運(yùn)轉(zhuǎn)過(guò)程的中心。赤道部細(xì)胞逐漸變長(zhǎng)、脫核，排列規(guī)則，傳統(tǒng)上稱為晶體纖維（lens fibers）。晶體纖維的增加在赤道部終生不停，新生的纖維柔軟位于晶體外圍構(gòu)成晶體皮質(zhì)；舊的纖維被推向中心部脫水硬化形成晶體核。成人晶體按其形成的年齡不同而分為許多區(qū)，形成幾個(gè)密度不同的核，如圖3。 圖3 成年人晶體分區(qū)A：胚胎核； B：胎兒核； C：嬰兒核； D：成年核；E：皮質(zhì)；F：晶體上皮細(xì)胞；G：囊膜 胚胎核：位于晶體最中央的透明區(qū)，由胎生1-3個(gè)月產(chǎn)生的原始晶狀體纖維組成。 胎兒核：位于胚胎核之外，由胎生3-8個(gè)月形成的晶體纖維構(gòu)成。 嬰兒核

58、：自出生前數(shù)周到青春期形成的晶體纖維組成，位于胎兒核之外的薄層。 成人核：由青春期之后形成的晶體纖維組成。 皮質(zhì)：位于前后囊下、上皮下最新形成的晶體纖維總稱皮質(zhì)。成人眼晶體約有2,100-2,300個(gè)晶體細(xì)胞。表層的細(xì)胞比深層長(zhǎng)，最年輕的細(xì)胞位于囊下。晶體細(xì)胞有規(guī)則地排列成行，縱貫整個(gè)皮質(zhì)，終止于囊下不同深度的前皮質(zhì)縫與后皮質(zhì)縫即Y字縫。電鏡顯示：在赤道部形成的新的晶體細(xì)胞具有細(xì)胞核及見于上皮細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器。隨著新細(xì)胞的形成，老的晶體細(xì)胞向皮質(zhì)內(nèi)移位，細(xì)胞器逐漸減少以至消失，細(xì)胞核逐漸消失。深部皮質(zhì)的晶體細(xì)胞僅有細(xì)胞膜，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有均勻一致的細(xì)胞顆粒，偶爾可見殘留的細(xì)胞核。隨年齡增長(zhǎng)，晶體核不斷增大變硬，同時(shí)由于新纖維不斷形成，晶體皮質(zhì)亦增大。晶狀體的彈性逐漸減弱乃至消失，使晶狀體變扁，調(diào)節(jié)聚焦的能力減弱，形成老花眼，當(dāng)晶狀體混