動物細(xì)胞工程

1、第二節(jié)第二節(jié) 動物細(xì)胞工程動物細(xì)胞工程動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞融合動物細(xì)胞融合單克隆抗體制備單克隆抗體制備體細(xì)胞克隆體細(xì)胞克隆細(xì)胞核移植細(xì)胞核移植動物動物細(xì)胞細(xì)胞工程工程技術(shù)技術(shù)一、動物細(xì)胞培養(yǎng)一、動物細(xì)胞培養(yǎng)（一）概念（一）概念 從動物機體中從動物機體中取出取出相關(guān)組織，將它相關(guān)組織，將它分散分散成成單個細(xì)胞，放在適當(dāng)?shù)膯蝹€細(xì)胞，放在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基培養(yǎng)基中，使之生長和中，使之生長和增殖的技術(shù)。增殖的技術(shù)。動物動物組織塊組織塊剪碎剪碎胰蛋白酶胰蛋白酶單個單個細(xì)胞細(xì)胞加培養(yǎng)液加培養(yǎng)液制成制成細(xì)胞細(xì)胞懸浮液懸浮液1050代細(xì)胞代細(xì)胞（二）過程（二）過程貼壁細(xì)胞貼壁細(xì)胞原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)脫離、分

2、瓶脫離、分瓶傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng) 少部分細(xì)胞突破細(xì)少部分細(xì)胞突破細(xì)胞壽限，獲得不死性胞壽限，獲得不死性細(xì)胞群細(xì)胞群 用胰蛋白酶分散細(xì)胞，說明細(xì)胞間的物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)。用胰蛋白酶分散細(xì)胞，說明細(xì)胞間的物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)。胃蛋白酶作用的適宜胃蛋白酶作用的適宜pHpH約為約為2 2，當(dāng)，當(dāng)pHpH大于大于6 6時，胃蛋白酶就會時，胃蛋白酶就會失去活性。胰蛋白酶作用的適宜環(huán)境失去活性。胰蛋白酶作用的適宜環(huán)境pHpH為為7.27.28.48.4。多數(shù)動。多數(shù)動物細(xì)胞培養(yǎng)的適宜物細(xì)胞培養(yǎng)的適宜pHpH為為7.27.27.47.4，胃蛋白酶在此環(huán)境中沒有，胃蛋白酶在此環(huán)境中沒有活性，而胰蛋白酶在此環(huán)境中活性較高，

3、因此胰蛋白酶適宜活性，而胰蛋白酶在此環(huán)境中活性較高，因此胰蛋白酶適宜用于細(xì)胞培養(yǎng)時的細(xì)胞分散過程。用于細(xì)胞培養(yǎng)時的細(xì)胞分散過程。 胰蛋白酶除了可以分解細(xì)胞間的蛋白外，長時間胰蛋白酶除了可以分解細(xì)胞間的蛋白外，長時間的作用也會分解細(xì)胞膜蛋白，對細(xì)胞有損傷作用，因的作用也會分解細(xì)胞膜蛋白，對細(xì)胞有損傷作用，因此必須控制好胰蛋白酶的作用時間。此必須控制好胰蛋白酶的作用時間。 （三）動物細(xì)胞培養(yǎng)的條件（三）動物細(xì)胞培養(yǎng)的條件1. 無菌、無毒的環(huán)境無菌、無毒的環(huán)境添加一定量的抗生素，定期更換培養(yǎng)液。添加一定量的抗生素，定期更換培養(yǎng)液。2. 營養(yǎng)物質(zhì)營養(yǎng)物質(zhì) 糖、氨基酸、促生長因子、無機鹽、微量糖、氨基酸

4、、促生長因子、無機鹽、微量元素以及動物或人血清等。元素以及動物或人血清等。u 合成培養(yǎng)基：將細(xì)胞所需的各種營養(yǎng)物質(zhì)按其合成培養(yǎng)基：將細(xì)胞所需的各種營養(yǎng)物質(zhì)按其種類和所需數(shù)量嚴(yán)格配制而成的培養(yǎng)基。種類和所需數(shù)量嚴(yán)格配制而成的培養(yǎng)基。 血清中含有蛋白質(zhì)、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中血清中含有蛋白質(zhì)、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中蛋白質(zhì)主要為白蛋白和球蛋白。有些氨基酸是必需氨基蛋白質(zhì)主要為白蛋白和球蛋白。有些氨基酸是必需氨基酸，必須由培養(yǎng)液提供。血清激素有胰島素、生長激素酸，必須由培養(yǎng)液提供。血清激素有胰島素、生長激素等及多種生長因子；血清還含有多種未知的促細(xì)胞生長等及多種生長因子；血清還含有多種未知

5、的促細(xì)胞生長因子及其他活性物質(zhì)，能促進細(xì)胞的生長、增殖和貼附。因子及其他活性物質(zhì)，能促進細(xì)胞的生長、增殖和貼附。因此，細(xì)胞培養(yǎng)時，要保證細(xì)胞能夠順利生長和增殖，因此，細(xì)胞培養(yǎng)時，要保證細(xì)胞能夠順利生長和增殖，一般需添加一般需添加10%10%20%20%的血清。的血清。 3. 溫度和溫度和pH溫度溫度pH4. 氣體環(huán)境氣體環(huán)境與體內(nèi)相近與體內(nèi)相近 36.50.57.27.4O2CO2細(xì)胞代謝所必需細(xì)胞代謝所必需維持維持pHu CO2培養(yǎng)箱（培養(yǎng)箱（95% 空氣空氣5% CO2 ）大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)蛋白質(zhì)生物制品（病毒疫苗、干大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)蛋白質(zhì)生物制品（病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體）擾素、單克隆抗體

6、）獲得大量自體的皮膚細(xì)胞，解決燒傷病人的植皮獲得大量自體的皮膚細(xì)胞，解決燒傷病人的植皮問題問題檢測有毒物質(zhì)，判斷某種物質(zhì)的細(xì)胞毒性檢測有毒物質(zhì)，判斷某種物質(zhì)的細(xì)胞毒性篩選抗癌藥物，為治療和預(yù)防癌癥及其他疾病提篩選抗癌藥物，為治療和預(yù)防癌癥及其他疾病提供理論依據(jù)供理論依據(jù)（四）動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用（四）動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用二、動物細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動物二、動物細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動物 不能，高度分化的植物細(xì)胞仍保持著全能性，而不能，高度分化的植物細(xì)胞仍保持著全能性，而動物細(xì)胞的全能性會隨細(xì)胞分化程度的提高逐漸受動物細(xì)胞的全能性會隨細(xì)胞分化程度的提高逐漸受到限制，分化潛能逐漸變?nèi)?。所以目前還

7、不能利用到限制，分化潛能逐漸變?nèi)酢Ｋ阅壳斑€不能利用類似植物組織培養(yǎng)的方法獲得完整的動物體。類似植物組織培養(yǎng)的方法獲得完整的動物體。（一）概念（一）概念 動物細(xì)胞核移植技術(shù)是將動物的一個細(xì)胞動物細(xì)胞核移植技術(shù)是將動物的一個細(xì)胞的細(xì)胞核，移入到一個已經(jīng)的細(xì)胞核，移入到一個已經(jīng)去掉細(xì)胞核的卵母去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞細(xì)胞中，使其重組并發(fā)育成一個新的胚胎，該中，使其重組并發(fā)育成一個新的胚胎，該胚胎最終發(fā)育成完整的動物個體。胚胎最終發(fā)育成完整的動物個體。u 利用核移植技術(shù)得到的動物稱為克隆動物。利用核移植技術(shù)得到的動物稱為克隆動物。（二）哺乳動物核移植的類型（二）哺乳動物核移植的類型 胚胎細(xì)胞核移植胚胎細(xì)

8、胞核移植 體細(xì)胞核移植體細(xì)胞核移植容易容易困難困難（三）體細(xì)胞核移植的過程（三）體細(xì)胞核移植的過程（以高產(chǎn)奶牛為例）（以高產(chǎn)奶牛為例）體細(xì)胞體細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)取出核取出核甲牛甲牛乙牛乙牛M卵卵母細(xì)胞母細(xì)胞去除核去除核去核卵去核卵母細(xì)胞母細(xì)胞重組重組卵細(xì)胞卵細(xì)胞核植入核植入卵裂卵裂早期早期胚胎胚胎代孕母牛丙代孕母牛丙移植移植體細(xì)胞群體細(xì)胞群克隆?？寺∨＜?xì)胞核移植細(xì)胞核移植胚胎移植胚胎移植物理或化學(xué)方法激活物理或化學(xué)方法激活u 受體細(xì)胞為減數(shù)分裂第二次分裂中期（受體細(xì)胞為減數(shù)分裂第二次分裂中期（MM）的卵母細(xì)胞。的卵母細(xì)胞。u 重組細(xì)胞需通過物理或化學(xué)方法激活，從而完重組細(xì)胞需通過物理或化學(xué)方法激活，

9、從而完成細(xì)胞分裂和發(fā)育進程。成細(xì)胞分裂和發(fā)育進程。u 體細(xì)胞核移植的技術(shù)操作過程主要包括核供體體細(xì)胞核移植的技術(shù)操作過程主要包括核供體細(xì)胞和核受體細(xì)胞的處理和制備、核移植、構(gòu)建細(xì)胞和核受體細(xì)胞的處理和制備、核移植、構(gòu)建重組胚胎、胚胎移植等步驟。重組胚胎、胚胎移植等步驟。 為使核移植的胚胎或動物的遺傳物質(zhì)來自有為使核移植的胚胎或動物的遺傳物質(zhì)來自有重要利用價值的動物提供的體細(xì)胞，在供體細(xì)重要利用價值的動物提供的體細(xì)胞，在供體細(xì)胞的細(xì)胞核移至受體細(xì)胞之前，必須將受體細(xì)胞的細(xì)胞核移至受體細(xì)胞之前，必須將受體細(xì)胞核去掉或?qū)⑵淦茐?。胞核去掉或?qū)⑵淦茐摹?培養(yǎng)的動物細(xì)胞一般當(dāng)傳代至培養(yǎng)的動物細(xì)胞一般當(dāng)傳代

10、至1050代左右時，代左右時，部分細(xì)胞核型可能會發(fā)生變化，其細(xì)胞遺傳物質(zhì)部分細(xì)胞核型可能會發(fā)生變化，其細(xì)胞遺傳物質(zhì)也可能會發(fā)生突變，而也可能會發(fā)生突變，而10代以內(nèi)的細(xì)胞一般能保代以內(nèi)的細(xì)胞一般能保持正常的二倍體核型。因此，在體細(xì)胞核移植中，持正常的二倍體核型。因此，在體細(xì)胞核移植中，為了保證供體細(xì)胞正常的遺傳基礎(chǔ)，通常采用傳為了保證供體細(xì)胞正常的遺傳基礎(chǔ)，通常采用傳代代10代以內(nèi)的細(xì)胞。代以內(nèi)的細(xì)胞。 克隆動物克隆動物DNA主要來自于供體細(xì)胞核，但其主要來自于供體細(xì)胞核，但其核外還有少量的核外還有少量的DNA，即線粒體中的，即線粒體中的DNA是來是來自于受體卵母細(xì)胞。所以用體細(xì)胞核移植方法自

11、于受體卵母細(xì)胞。所以用體細(xì)胞核移植方法克隆的動物并不是供核動物完全相同的復(fù)制?？寺〉膭游锊⒉皇枪┖藙游锿耆嗤膹?fù)制。（四）體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景（四）體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景1.1.加速家畜遺傳改良進程，促進優(yōu)良畜群繁育；加速家畜遺傳改良進程，促進優(yōu)良畜群繁育；2.2.保護瀕危物種，增加存活數(shù)量；保護瀕危物種，增加存活數(shù)量；3.3.克隆轉(zhuǎn)基因動物，作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)醫(yī)用克隆轉(zhuǎn)基因動物，作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)醫(yī)用蛋白；蛋白；4.4.克隆轉(zhuǎn)基因動物可以作為異種移植的供體，可克隆轉(zhuǎn)基因動物可以作為異種移植的供體，可以用于組織器官的移植；以用于組織器官的移植；5.5.對克隆動物的研究可使人們更

12、深入地了解胚胎對克隆動物的研究可使人們更深入地了解胚胎發(fā)育及衰老過程；發(fā)育及衰老過程；6.6.利用克隆動物做疾病模型，可使人們更好地追利用克隆動物做疾病模型，可使人們更好地追蹤研究疾病的發(fā)展過程和治療疾??；蹤研究疾病的發(fā)展過程和治療疾??；7.7.人的核移植胚胎干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化，形成相應(yīng)人的核移植胚胎干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化，形成相應(yīng)的組織、器官后，可用于組織器官的移植。的組織、器官后，可用于組織器官的移植。（五）體細(xì)胞核移植技術(shù)存在的問題（五）體細(xì)胞核移植技術(shù)存在的問題1. .克隆動物存活率低，遺傳缺陷多等；克隆動物存活率低，遺傳缺陷多等；2. .克隆動物食品的安全性問題?？寺游锸称返陌踩詥栴}。l

13、 過程過程 去壁去壁 融合融合 組織培養(yǎng)組織培養(yǎng)l 優(yōu)點：克服了遠(yuǎn)緣雜交不親和性的障礙優(yōu)點：克服了遠(yuǎn)緣雜交不親和性的障礙 。三、動物細(xì)胞融合和單克隆抗體三、動物細(xì)胞融合和單克隆抗體（一）動物細(xì)胞融合技術(shù)（一）動物細(xì)胞融合技術(shù) 動物細(xì)胞融合也稱細(xì)胞雜交，指動物細(xì)胞融合也稱細(xì)胞雜交，指兩個或多兩個或多個動物細(xì)胞結(jié)合個動物細(xì)胞結(jié)合形成一個細(xì)胞的過程。形成一個細(xì)胞的過程。u融合后形成的具有兩個或多個細(xì)胞遺傳信融合后形成的具有兩個或多個細(xì)胞遺傳信息的息的單核細(xì)胞單核細(xì)胞，稱為雜交細(xì)胞。，稱為雜交細(xì)胞。1、概念、概念2、過程、過程不同不同DNADNA的兩個細(xì)胞的兩個細(xì)胞滅活病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合滅活病毒誘導(dǎo)細(xì)胞

14、融合（先質(zhì)后核）（先質(zhì)后核）融合后的雜交細(xì)胞融合后的雜交細(xì)胞進行有絲分裂進行有絲分裂 病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細(xì)胞上病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細(xì)胞上的糖蛋白發(fā)生作用，使細(xì)胞相互凝聚，細(xì)胞膜上的的糖蛋白發(fā)生作用，使細(xì)胞相互凝聚，細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞發(fā)生融合。胞發(fā)生融合。 不滅活的病毒會感染細(xì)胞，不能誘導(dǎo)細(xì)胞融合。不滅活的病毒會感染細(xì)胞，不能誘導(dǎo)細(xì)胞融合。3、意義和應(yīng)用、意義和應(yīng)用p 意義：突破了有性雜交方法的局限，使遠(yuǎn)緣雜意義：突破了有性雜交方法的局限，使遠(yuǎn)緣雜交（種間、屬間、科間、動植物之間）成為

15、可能。交（種間、屬間、科間、動植物之間）成為可能。p 應(yīng)用：用于研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤應(yīng)用：用于研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和生物新品種培育等，特別是利用雜交瘤技術(shù)制和生物新品種培育等，特別是利用雜交瘤技術(shù)制造單克隆抗體。造單克隆抗體。物理、化學(xué)方法物理、化學(xué)方法（同左）（同左）滅活病毒處理滅活病毒處理物理法物理法( (離心、振離心、振動、電刺激動、電刺激) )化學(xué)法化學(xué)法( (聚乙二醇聚乙二醇) )誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)方法使細(xì)胞分散后誘使細(xì)胞分散后誘導(dǎo)細(xì)胞融合導(dǎo)細(xì)胞融合去除細(xì)胞壁后誘去除細(xì)胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合導(dǎo)原生質(zhì)體融合方方 法法細(xì)胞膜的流動性細(xì)胞膜的流動性細(xì)胞膜的流動性細(xì)胞膜的流動性植物

16、細(xì)胞全能性植物細(xì)胞全能性原原 理理動物細(xì)胞融合動物細(xì)胞融合植物體細(xì)胞雜交植物體細(xì)胞雜交比較項目比較項目植物、動物細(xì)胞融合的比較植物、動物細(xì)胞融合的比較（二）單克隆抗體技術(shù)（二）單克隆抗體技術(shù)l 每一個每一個B B淋巴細(xì)胞只合成和分泌一種特異性抗體。淋巴細(xì)胞只合成和分泌一種特異性抗體。產(chǎn)量低、純度低、抗體特異性差。產(chǎn)量低、純度低、抗體特異性差。單個單個B淋巴細(xì)胞進行無性繁殖，即通過淋巴細(xì)胞進行無性繁殖，即通過克隆形成細(xì)胞群。克隆形成細(xì)胞群。1、單克隆抗體的概念、單克隆抗體的概念 由單個由單個B B淋巴細(xì)胞克隆形成的細(xì)胞群產(chǎn)淋巴細(xì)胞克隆形成的細(xì)胞群產(chǎn)生的化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強的抗體就是生的化學(xué)性質(zhì)

17、單一、特異性強的抗體就是單克隆抗體。單克隆抗體。lB B淋巴細(xì)胞：能產(chǎn)生抗體，體外培養(yǎng)不能無限增值。淋巴細(xì)胞：能產(chǎn)生抗體，體外培養(yǎng)不能無限增值。l骨髓瘤細(xì)胞：體外培養(yǎng)可無限傳代，不能產(chǎn)生抗體。骨髓瘤細(xì)胞：體外培養(yǎng)可無限傳代，不能產(chǎn)生抗體。2、單克隆抗體的制備、單克隆抗體的制備1975 英國英國 米爾斯坦和柯勒米爾斯坦和柯勒 雜交瘤技術(shù)雜交瘤技術(shù)2、單克隆抗體的制備、單克隆抗體的制備骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞抗原抗原小鼠小鼠B淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)體外培養(yǎng)體內(nèi)培養(yǎng)體內(nèi)培養(yǎng)單克隆抗體單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞融合融合 篩選篩選產(chǎn)生特定產(chǎn)生特定抗體抗體的雜交瘤細(xì)胞的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng) 篩選篩選3、單

18、克隆抗體的應(yīng)用、單克隆抗體的應(yīng)用特異性強、靈敏度高、可大量制備。特異性強、靈敏度高、可大量制備。人類在預(yù)防與診療傳染性疾病過程中，經(jīng)常使用疫苗和抗體。已知人類在預(yù)防與診療傳染性疾病過程中，經(jīng)常使用疫苗和抗體。已知某傳染性疾病的病原體為某傳染性疾病的病原體為RNARNA病毒，該病毒表面的病毒，該病毒表面的A A蛋白為主要抗原，蛋白為主要抗原，其疫苗生產(chǎn)和抗體制備的流程之一如圖：其疫苗生產(chǎn)和抗體制備的流程之一如圖：請回答：請回答：(1)(1)過程過程代表的是代表的是_。(2)(2)過程過程構(gòu)建構(gòu)建A A基因表達載體時，必須使用基因表達載體時，必須使用_和和_兩種兩種工具酶。工具酶。人類在預(yù)防與診療傳染性疾病過程中，經(jīng)常使用疫苗和抗體。已知人類在預(yù)防與診療傳染性疾病過程中，經(jīng)常使用疫苗和抗體。已知某傳染性疾病的病原體為某傳染性疾病的病原體為RNARNA病毒，該病毒表面