分子生物學(xué)：第九章 DNA的結(jié)構(gòu)與功能

1、第九章 DNA的結(jié)構(gòu)與功能 第一節(jié) DNA和氫鍵 How are they formed? a hydrogen bond is formed when a charged part of a molecule having polar covalent bonds forms an electrostatic (charge, as in positive attracted to negative) interaction with a substance of opposite charge. Molecules that have nonpolar covalent bonds don

2、ot form hydrogen bonds. DNA中的氫鍵 由于氫鍵的存在，DNA形成雙鏈配對(duì)。蛋白質(zhì)分子可與組成DNA的核苷酸中暴露出來(lái)的原子進(jìn)行特異的相互作用，識(shí)別特異的核苷酸序列并與之結(jié)合，而不破壞雙鏈DNA分子的堿基對(duì)。通過(guò)這種相互作用，調(diào)控蛋白質(zhì)可以對(duì)特異的基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。其他分子與DNA也發(fā)生類似的相互作用。 在DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，一個(gè)氫鍵斷裂而另一個(gè)氫鍵生成的現(xiàn)象大量存在。DNA變性方式有多種，其中二類是：溫度升高，氫鍵中的電子吸收能量，發(fā)生了躍遷，原有的氫鍵被破壞；鹽濃度降低，意味著溶液內(nèi)電子數(shù)目減少，鹽有能力來(lái)奪取DNA 氫鍵內(nèi)的電子，造成DNA內(nèi)的氫鍵斷裂。 拓

3、撲異構(gòu)酶松弛或插入超螺旋的過(guò)程，就是DNA 中氫鍵被破壞、電子波函數(shù)被改寫(xiě)的過(guò)程。 一些錯(cuò)誤的氫鍵具有相當(dāng)?shù)逆I能，可以得到保留。這些保留下來(lái)的錯(cuò)誤以及修復(fù)過(guò)程中發(fā)生的錯(cuò)誤，是基因突變產(chǎn)生的原因之一。 利用氫鍵理論對(duì)一些具體問(wèn)題的解釋 卵中的DNA只有處于特定位置，才有足夠的空間與其他調(diào)控組分發(fā)生氫鍵的破壞和生成，容納發(fā)生躍遷的電子；否則，DNA中的某些信息就會(huì)不正常表達(dá)，使卵不能正常發(fā)育。 電子空間分布決定理論 電子在空間分布的不同狀態(tài)，決定了DNA的解鏈復(fù)制和轉(zhuǎn)錄等過(guò)程的產(chǎn)生，以及這些過(guò)程的高精確性。第二節(jié) 與DNA相關(guān)的單分子操作技術(shù)單分子操作技術(shù)單分子操作技術(shù)是指應(yīng)用一定的實(shí)驗(yàn)儀器和方法

4、,對(duì)單個(gè)分子進(jìn)行的操作,它包括原子力顯微鏡(Atomic Force Microscopy , AFM)技術(shù)、光鑷(Optical tweezers)技術(shù)、單分子光譜(single molecule spectroscopy, SMS)技術(shù)等。 應(yīng)用單分子操作技術(shù),可研究核酸的各種性質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)施加一定的外部機(jī)械限制(力和/或扭矩)，去測(cè)量分子的長(zhǎng)度、力、角度、扭矩隨時(shí)間的變化。實(shí)驗(yàn)一般在溶液中進(jìn)行,通過(guò)測(cè)量在生物化學(xué)過(guò)程中產(chǎn)生的力，以及研究作為外加機(jī)械負(fù)荷而發(fā)生的相應(yīng)反應(yīng)等,可得到核酸的折疊動(dòng)力學(xué)和彈性性質(zhì)等相關(guān)信息。原子力顯微鏡技術(shù)AFM系統(tǒng)主要由以下幾部分組成：（1）帶針尖的力敏感元件；（

5、2）力敏感元件運(yùn)動(dòng)檢測(cè)裝置；（3）監(jiān)控力敏感元件運(yùn)動(dòng)的反饋回路；（4）掃描系統(tǒng)（一般使用壓電陶瓷），其作用是使樣品進(jìn)行掃描運(yùn)動(dòng)；（5）圖象采集及顯示；（6）圖象處理系統(tǒng)。其中關(guān)鍵的是前兩部分。AFM的工作原理 如圖1所示。將一個(gè)對(duì)微弱力極敏感的微懸臂一端固定，另一端有一微小的針尖，針尖與樣品表面輕輕接觸。使針尖在樣品的表面上掃描，由于針尖尖端原子與樣品表面原子間存在極微弱的排斥力（10-810-6N），如果控制這種力在掃描過(guò)程中保持恒定，則微懸臂將在垂直于樣品表面的方向上起伏運(yùn)動(dòng)，利用隧道電流檢測(cè)法或光學(xué)檢測(cè)方法，測(cè)定微懸臂對(duì)應(yīng)于掃描各點(diǎn)的位置變化，從而可以獲得樣品表面形貌的信息。幾種細(xì)胞的A

6、FM圖象 光鑷技術(shù) 光鑷即單光束梯度力光阱，是由一束高度匯聚的激光形成的三維勢(shì)阱，利用光的力學(xué)效應(yīng)，可以捕獲進(jìn)而操控微小粒子（亞微米到數(shù)十微米大?。?。由于它使用無(wú)形的光束來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)微粒非機(jī)械接觸的捕獲，不會(huì)產(chǎn)生機(jī)械損傷，又由于光鑷的所有機(jī)械部件離捕獲對(duì)象的距離都遠(yuǎn)大于捕獲對(duì)象的尺度，是“遙控”的操作，因而幾乎不影響粒子的周圍環(huán)境。加之生物微粒對(duì)光穿透性等特點(diǎn)，光鑷技術(shù)特別適用于活體生物微粒。 系統(tǒng)將激光技術(shù)，數(shù)字技術(shù)與顯微成像系統(tǒng)結(jié)合，用激光作用微觀物體，并將其捕獲，變化過(guò)程通過(guò)顯微成像系統(tǒng)再經(jīng)CCD圖像采集系統(tǒng)輸入電腦。由電腦對(duì)微觀過(guò)程進(jìn)行后期處理。 激光光鑷對(duì)酵母菌細(xì)胞的捕獲和操作 單分子光

7、譜技術(shù) 單分子光譜技術(shù)是將熒光基團(tuán)標(biāo)記在生物大分子上,標(biāo)記在生物大分子上的熒光基團(tuán)發(fā)生各種特性變化,通過(guò)光譜分析等,就能夠得到有關(guān)分子間相互作用、酶活性、反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、構(gòu)象動(dòng)力學(xué)、分子運(yùn)動(dòng)自由度以及在化學(xué)和靜電環(huán)境下活性改變的信息。 單分子操作技術(shù)在核酸研究中的應(yīng)用 單分子操作技術(shù)已經(jīng)越來(lái)越多地應(yīng)用到核酸研究當(dāng)中,并且取得了重要的進(jìn)展。這些研究包括:DNA 的解鏈與修飾、DNA 凝聚、蛋白質(zhì)-DNA 相互作用、復(fù)制和轉(zhuǎn)錄等。 單分子酶學(xué) 與DNA、蛋白質(zhì)-DNA 相互作用有關(guān)的酶學(xué)過(guò)程也能利用單分子操作技術(shù)進(jìn)行研究,如用一個(gè)解鏈的實(shí)驗(yàn)裝置來(lái)研究DNA-蛋白質(zhì)的相互作用,酶結(jié)合到雙鏈DNA 上可以

8、短暫地阻止DNA 雙鏈開(kāi)口叉(the opening fork) 移動(dòng)。一旦開(kāi)口叉移動(dòng)到結(jié)合蛋白的位置,力將會(huì)增加直到積聚到足夠的彈性能量移去蛋白。因此,蛋白誘導(dǎo)的序列依賴的力信號(hào)峰的出現(xiàn)就給出了酶結(jié)合到DNA 上的位置,而峰值就提供了蛋白質(zhì)-DNA 復(fù)合物穩(wěn)定性的相關(guān)信息。單分子操作技術(shù)的進(jìn)步 進(jìn)一步改進(jìn)單分子操作的實(shí)驗(yàn)技術(shù),特別是精確度、分子體系控制程度、表面連接方法等。另外,探索與其它實(shí)驗(yàn)技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，如聯(lián)合使用微流體技術(shù)、光鑷技術(shù)、單分子熒光技術(shù)。 分子梳 (molecular combing) 一般采用溶液或表面方法對(duì)DNA 分子的群體行為進(jìn)行研究,但得到的是統(tǒng)計(jì)規(guī)律。要了解水溶液

9、中DNA 單分子的行為，需特殊的研究手段。 在端乙烯基硅烷化的基底表面,DNA 可以被移動(dòng)的氣-液界面均勻拉直。把這一現(xiàn)象稱為“分子梳”。 DNA 單分子的行為 大多數(shù)的DNA 是線形分子,拉直后可以顯著提高分辨率。如T4 DNA 在溶液中形成的線團(tuán)直徑約為3.5m ,拉直后可以到55 甚至80m?，F(xiàn)有的拉直方法有:原子力顯微鏡微懸臂法、光鉗/ 阱法、磁鉗/ 阱法、旋轉(zhuǎn)法、液流法、吹氣法等。 原子力顯微鏡微懸臂法、光阱法、磁阱法和旋轉(zhuǎn)法需要在DNA 的一端或兩端修飾并固定,需要復(fù)雜的儀器,而且只能對(duì)一個(gè)DNA 分子進(jìn)行操縱。 分子梳原理 DNA 末端與基底表面的特異性結(jié)合是“分子梳”技術(shù)的關(guān)鍵

10、。 在不同基底表面,DNA 末端和表面的特異性結(jié)合機(jī)理是不同的。 為了提高DNA 末端與基底結(jié)合的特異性,還可以在DNA 末端修飾半抗原(如地高辛) ,在基底表面修飾相應(yīng)的抗體。 最初的“分子梳”是將數(shù)微升DNA 溶液滴在基底上,再蓋上蓋玻片,在表面張力作用下,會(huì)產(chǎn)生彎月形“氣-液”界面,隨著溶液的揮發(fā),彎月面緩慢移動(dòng),將DNA 分子拉直。這被稱為“滴液分子梳”?！皠?dòng)態(tài)分子梳”是將基底浸入DNA 溶液中,再用機(jī)械裝置以恒定的速度將基底從溶液中拉出,從而拉直DNA。 分子梳的應(yīng)用 大多數(shù)DNA 分子是直徑為2 nm 的線形分子,可以作為測(cè)序的模板，可以作為構(gòu)建納米材料的模板，可以獲得限制性基因物

11、理圖譜。有關(guān)基因的光學(xué)圖譜也可以通過(guò)采用“分子梳”技術(shù)得到。 第四節(jié) 二維DNA晶體與DNA自組裝分子自組裝分子的自組裝不僅降低了合成所需要的能量,而且加大了識(shí)別的準(zhǔn)確性,從而保證了自組裝的重現(xiàn)度和精確度。自組裝可以分為兩大類: (1) 分子自發(fā)地聚集成特殊的聚集態(tài),例如膜、小泡、膠束、液晶和固體；(2) 通過(guò)設(shè)計(jì)結(jié)合位點(diǎn)，使分子排列聚集成復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。 生物納米技術(shù)的主要目的，是尋找一種合理、簡(jiǎn)便的方法來(lái)構(gòu)筑新的功能材料,例如具有獨(dú)特幾何形狀的納米器件及其衍生物,尤其是那些具有周期排列的物質(zhì)。自組裝具有宏觀結(jié)構(gòu)的納米材料需要滿足三個(gè)要求:(1) 可知的基元間的分子相互作用。(2) 可以預(yù)知的產(chǎn)

12、物結(jié)構(gòu)。(3) 基元結(jié)構(gòu)具有剛性?；贒NA 的納米結(jié)構(gòu)自組裝 基于DNA 的自組裝可以分為三種類型:以DNA 為模板的納米結(jié)構(gòu)自組裝、DNA 指導(dǎo)的納米結(jié)構(gòu)自組裝、以DNA 為框架材料的納米結(jié)構(gòu)自組裝。 DNA 指導(dǎo)的DNA - 蛋白質(zhì)復(fù)合的自組裝 四臂分枝DNA 及其自組裝 DNA 技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用 由三臂分枝DNA 和DX DNA 形成的幾何體和周期性框架結(jié)構(gòu) 構(gòu)成DNA 晶體的剛性分子 DNA 分子瓦將由多條DNA 寡核苷酸鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)組成的具有一定剛性的DNA 分子單元稱為DNA 分子瓦(DNA tile), 它是構(gòu)成DNA 晶體的建筑模塊 。DNA 分子瓦自組裝成的二維DNA

13、晶體 DNA 納米技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)是: (1) 能夠程序化設(shè)計(jì)合成精確到納米級(jí)的宏觀物質(zhì)；(2) 實(shí)現(xiàn)了在納米范圍內(nèi)精確控制材料的結(jié)構(gòu)；(3) 反應(yīng)原理簡(jiǎn)單,結(jié)果可靠。DNA 納米技術(shù)的一個(gè)重要載體就是二維DNA 晶體, 以其為模板，能夠?qū)⒕哂泄狻㈦?、磁等性質(zhì)的分子和納米粒子精確地自組裝構(gòu)成分子(納米)線路和器件。 由分子瓦自組裝成的二維DNA 晶體 因?yàn)镈NA 雙螺旋的結(jié)構(gòu)是已知的, 因此通過(guò)設(shè)計(jì)分子瓦中堿基的個(gè)數(shù)就能人工控制分子瓦的大小。DX 分子瓦約2 nm 4 nm13 nm 或2 nm 4 nm 16 nm 大小, 通過(guò)粘性末端相互匹配自組裝成為二維DNA 晶體(2 m 8m, 高度1

14、2 nm)。 二維DNA 晶體技術(shù)前景 Winfree 提出設(shè)計(jì)合適的二維DNA 晶體可以用來(lái)進(jìn)行DNA 計(jì)算；可以作為基底來(lái)組裝其他超分子或納米粒子,形成特殊的納米結(jié)構(gòu)或超分子器件；通過(guò)某些特定的設(shè)計(jì)可以使二維的DNA 晶體擴(kuò)展成三維的結(jié)構(gòu), 從而作為其他超分子客體的主體。二維DNA 晶體自組裝技術(shù)在分子功能和納米材料的控制合成上具有其獨(dú)特性:首先,構(gòu)成DNA 晶體的整個(gè)序列是可編程的；其次,能夠?qū)⒎稚⒌木哂胁煌狻㈦?、磁等性質(zhì)的分子和納米粒子單元按照Watson-Crick 的堿基配對(duì)原則, 直接從溶液中精確自組裝, 構(gòu)成分子(納米)線路和器件, 用來(lái)進(jìn)行邏輯運(yùn)算、二進(jìn)制數(shù)的存儲(chǔ)和制造DN

15、A 納米機(jī)器等。第五節(jié) 與DNA發(fā)生作用的各類小分子DNA與其靶向分子相互作用的模式雖然DNA 靶向化合物的數(shù)量非常之大, 但與DNA 的結(jié)合模式,歸納起來(lái)大致可分為非共價(jià)結(jié)合、共價(jià)結(jié)合和剪切作用三類。（一）非共價(jià)結(jié)合 (1) 靜電結(jié)合（表面結(jié)合）,即與DNA中的原子間形成吸引(2) 嵌插結(jié)合,即插入DNA雙鏈之間,與DNA中的堿基等基團(tuán)相互作用(3) 溝槽結(jié)合。即進(jìn)入DNA的大小溝中與某些基團(tuán)作用。（二）共價(jià)結(jié)合例如duocarmycin 及其衍生物,只能在DNA 小溝中對(duì)A T 富集區(qū)識(shí)別,分子中活潑的環(huán)丙烷與小溝內(nèi)特定堿基序列中A 的N 3 共價(jià)結(jié)合后,導(dǎo)致在該位點(diǎn)脫去嘌呤。 （三）剪切

16、作用研究了（，二甲基）乙胺，萘硫酰亞胺和（，二甲基）乙胺，萘酰亞胺對(duì)小牛胸腺的嵌入結(jié)合反應(yīng)，并求取了嵌入常數(shù)。它們可以把質(zhì)粒的超螺旋剪切為開(kāi)環(huán)。在紫外光作用下，這種能力會(huì)得到不同程度的提高。不同的DNA 靶向化合物 金屬配合物 （一）金屬卟啉 （二）順鉑（三）其它過(guò)渡金屬配合物 DNA 靶向抗生素 （一）多肽及蛋白質(zhì)類抗生素 （二）蒽環(huán)抗生素 （三）烯二炔抗生素類 （四） 乙撐亞胺型抗生素 第六節(jié) DNA作為遺傳信息載體之外的作用 DNA的生物催化功能 不少結(jié)構(gòu)特殊的DNA 分子具有多種生物催化功能。 這些DNA 分子被稱為脫氧核酶或酶性DNA 。DRz 的篩選一般認(rèn)為DRz 的篩選途徑有兩種

17、,一種是利用天然的DNA 分子在體外篩選出具有酶活性的DNA 分子,另一種是通過(guò)人工合成并在體外篩選出具有酶活性的小片段DNA 分子。 但是第一種途徑,在篩選的過(guò)程中具有一定的不準(zhǔn)確性,通常不被采用,而第二種途徑的篩選過(guò)程無(wú)以上缺點(diǎn),而且研究較多,是一種被普遍承認(rèn)的篩選途徑 體外選擇技術(shù)篩選具有裂解活性的DNA 分子 DRz 的分類及性質(zhì) 具有水解酶活性的DRz 具有N - 糖基化酶活性的DRz 具有轉(zhuǎn)移酶活性的DRz 具有合成酶活性的DRz具有氧化酶活性的DRz 具有激酶活性的DRz 可催化卟啉的金屬離子化的活性 DRz 的應(yīng)用在疾病治療上的應(yīng)用使用33 - mer 的脫氧寡核苷酸,設(shè)計(jì)了8

18、0 條針對(duì)HPV16 的E6/ E7 轉(zhuǎn)錄物的DRz 以及60條針對(duì)大鼠c - myc 基因的DRz。其他方面的應(yīng)用 DRz 最近還被用于DZYNA - PCR(DRz 熒光定量PCR) 中,以對(duì)核酸進(jìn)行定量檢測(cè)。用DRz 建立了一種新的尋找靶基因上有效位點(diǎn)的選擇系統(tǒng)；用DRz 對(duì)核酸進(jìn)行突變分析；將熒光標(biāo)記的DRz 作為同源基因探針對(duì)基因進(jìn)行分析。 DNA的免疫激活作用 特定的DNA 序列能產(chǎn)生對(duì)免疫系統(tǒng)非常廣泛的影響 某些細(xì)菌的基因組DNA(bDNA) 有可能通過(guò)其自身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)直接觸發(fā)機(jī)體的免疫防御機(jī)制。 鎖核酸 天然的寡核苷酸的生物穩(wěn)定性差,易被核酶降解,在實(shí)際應(yīng)用上有很大的缺陷。因此

19、,必須對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾。 鎖核酸(locked nucleic acid ,LNA) 是一種新穎的核苷酸衍生物 LNA 有很多優(yōu)點(diǎn):(1) 和DNA、RNA 互補(bǔ)的雙鏈有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性(Tm = + 3+ 8 )；(2) 具有抗3脫氧核苷酸酶降解的穩(wěn)定性；(3) LNA-DNA 雜交物能激活RNase H；(4) 水溶性好,自由穿入細(xì)胞膜,易被機(jī)體吸收；(5) 體內(nèi)無(wú)毒性作用；(6) 高效的自動(dòng)寡聚化作用,合成方法相對(duì)簡(jiǎn)單等?？梢?jiàn),LNA 具有強(qiáng)大的反義活性,是一種理想的反義物質(zhì),有很美好的應(yīng)用前景。 LNA 和DNA 的結(jié)構(gòu) DNAzyme 與LNAzyme 二級(jí)結(jié)構(gòu) 第七節(jié) DNA計(jì)算機(jī)

20、DNA計(jì)算機(jī)的運(yùn)算能力 四個(gè)變量32SAT的可能取值和序列 DNA 鏈 DNA 序列 wxyz 取值S0 CAACCCAA 0000S1 TCTCAGAG 0001S2 GAAGGCAT 0010S3 AGGAATGC 0011S4 ATCGAGCT 0100S5 TTGGACCA 0101S6 ACCATTGG 0110S7 GTTGGGTT 0111S8 CCAAGTTG 1000S9 CAGTTGAC 1001S10 TGGTTTGG 1010S11 GATCCGAT 1011S12 ATATCGCG 1100S13 GGTTCAAC 1101S14 AACCTGGT 1110S15 ACTGGTCA 1111D