生物藥物分析與檢測：第六章 生物檢定法

1、標題 第六章 生物檢定法生物檢定：利用藥物對生物體（整體動物、離體組織、微生物等）的作用以測定其效價或生物活性的一種方法。整體和離體測定in vivo: 直接反映藥品對生物的綜合作用，但需要動物，供試品量多，耗時長；In vitro: 不一定能反映供試品在整體的作用，但個體差異小，實驗時間短，精密度和靈敏度高，能在一定程度上保留藥理作用特性。生物檢定的應(yīng)用范圍1、藥物的效價測定；2、體內(nèi)微量生理活性物質(zhì)的測定；3、中藥質(zhì)量的控制；4、某些有害雜質(zhì)的限度檢查。第一節(jié) 胰島素生物檢定法胰島素是治療糖尿病的特效藥，其特有優(yōu)勢:1、控制血糖能力最強；2、毒副作用小，胰島素為正常激素，無任何毒性，不損傷

2、肝腎。 但因為口服生物利用度低，臨床上常用其針劑。這給患者帶來了諸多不便，此外長期注射還會產(chǎn)生許多不良反應(yīng)。但目前有關(guān)胰島素非注射給藥普遍存在的問題是(1):膜障，胰島素分子易聚集；（2）：酶解，被胃腸道中的蛋白水解酶降解。 許多蛋白質(zhì)，如酶蛋白、激素蛋白等，它們在體內(nèi)常以無活性的前體存在，在一定情況下經(jīng)體內(nèi)的蛋白酶水解，切去部分肽段后，才變成有活性的蛋白質(zhì)。 前體胰島素（84 aa） A鏈（21aa） B鏈（30aa） C鏈（33aa） 活性胰島素胰島素的結(jié)構(gòu)B鏈A鏈A、B鏈胰島素不穩(wěn)定難吸收研究背景胰島素胰島素六聚體研究背景長期以來，胰島素的效價采用生物測定法，不過，2010年版藥典中，胰

3、島素的含量采用HPLC法，生物測定法則用于胰島素的生物活性檢測效價（potency)測定是生物檢定的主要內(nèi)容，它以藥理為基礎(chǔ)，生物統(tǒng)計為工具，運用特定的實驗設(shè)計，利用生物體在一定條件下比較供試品與標準品或?qū)φ掌匪a(chǎn)生的特定反應(yīng)（可測量、量化的生理指標或生物藥效或毒力）的一種定量方法，因而被稱為定量毒理學(xué)。檢定方法取健康無傷、同一來源、同一性別、出生日期相近的成年小鼠，體重相差不得超過3g，按體重隨機分成4組，每組不少于10只,逐只編號, 各組小鼠分別自皮下注入一種濃度的標準品或供試品稀釋液，每鼠0.20.3ml，但各鼠的注射體積（ml）應(yīng)相等。注射后40分鐘，按給藥順序分別自眼靜脈叢采血，用適

4、宜的方法，如葡萄糖氧化酶過氧化酶法測定血糖值。第一次給藥后間隔至少3小時,按雙交叉設(shè)計，對每組的各鼠進行第二次給藥，并測定給藥后40分鐘的血糖值。照生物檢定統(tǒng)計法(附錄)中量反應(yīng)平行線測定雙交叉設(shè)計法計算效價及實驗誤差。2010年版的藥典已經(jīng)簡化了程序。1、實驗動物減半；2、取消雙交叉實驗。注意：1、實驗常用劑量：低劑量組使血糖降低20%-30%，高劑量組血糖值不能低于2.8。2、動物質(zhì)量的選擇。3、環(huán)境的因素。第二節(jié) 肝素生物檢定法藥理作用：(1)抗凝作用，體內(nèi)、體外均有效；機制：加速抗凝血酶(AT)對多種凝血因子（、等含絲氨酸殘基的蛋白酶）的滅活。(2)其它：降脂作用；抗炎作用；抑制血管平

5、滑肌增生等。肝素體內(nèi)過程：口服不吸收，常靜脈滴注給藥。臨床應(yīng)用：(1)血栓栓塞性疾?。悍乐寡ㄐ纬?；(2)心血管手術(shù)、心導(dǎo)管、血液透析血液標本等抗凝。不良反應(yīng)：(1)自發(fā)性出血；(2)過敏反應(yīng)；(3)孕婦使用易致早產(chǎn)。低分子量肝素low-moleucular-weight heparins,LMWHs抗凝作用及應(yīng)用與肝素相似。血小板減少較少。安全，一般不必監(jiān)測抗凝活性。維持時間長，每日一次。促t-PA釋放，有助血栓溶解。制劑：依諾肝素enoxaparin 替他肝素tedelparin肝素鈉作為天然抗凝血物質(zhì)受到世界各國的重視. 也是我國主要的出口藥物之一。人們發(fā)現(xiàn)肝素鈉不但有抗凝、抗血栓形成和

6、調(diào)節(jié)血脂的作用, 還具有抗炎、抗過敏、抗病毒、抗癌等功能。肝素鈉效價測定采用羊血漿法 . 即將肝素鈉標準品和供試品加入檸檬酸羊血漿中, 鈣化一定時間后觀察兩者的凝固程度, 如標準品和供試品配成相同的濃度又得到相同的凝固程度, 則說明兩者效價相同, 以此來對比測定未知樣品的效價.取管徑均勻、潔凈干燥的小試管20 支, 分別加入血漿0. 5 mL, 置( 375) 恒溫水浴中預(yù)熱5 min10 min后, 依次每管加入一種濃度( 質(zhì)量百分濃度) 的標準品或供試品稀釋液( 1 % 、0. 5 %、0. 2 %) 及氯化鈣溶液( 每種濃度3 管, 各濃度的試管支數(shù)相等) , 加入氯化鈣溶液后, 立即混

7、勻, 并開始計算時間, 注意觀察并計算各管凝結(jié)時間. 將各管凝結(jié)時間換成對數(shù)參照生物檢定統(tǒng)計法( 中國藥典附錄XIV) 中的量反應(yīng)平行線測定法計算效價及實驗誤差.第三節(jié) 抗生素的微生物檢定法抗生素定義是由微生物分泌的化合物，其稀溶液具有抑制或殺滅細菌的能力。家里使用的消毒的東西也能殺滅生命體但只能叫消毒劑，這種消毒劑不能用在人體里面，只能用在體外的環(huán)境消毒使用?？股厥悄茉谌梭w里面使用的，毒性比較低安全性比較高的藥物。抗生素的作用就是殺滅感染我們體內(nèi)的微生物：病毒、細菌青霉素的發(fā)現(xiàn)者是英國細菌學(xué)家弗萊明。1928年的一天，弗萊明在他的一間簡陋的實驗室里研究導(dǎo)致人體發(fā)熱的葡萄球菌。由于蓋子沒有蓋

8、好，他發(fā)覺培養(yǎng)細菌用的瓊脂上附了一層青霉菌。這是從樓上的一位研究青霉菌的學(xué)者的窗口飄落進來的。使弗萊明感到驚訝的是，在青霉菌的近旁，葡萄球菌忽然不見了。這個偶然的發(fā)現(xiàn)深深吸引了他，他設(shè)法培養(yǎng)這種霉菌進行多次試驗，證明青霉素可以在幾小時內(nèi)將葡萄球菌全部殺死。弗萊明據(jù)此發(fā)明了葡萄球菌的克星青霉素。 圖中央是青霉菌，周圍是致病細菌。距青霉素最遠的細菌個大、色濃，活力十足；距青霉菌較近的細菌個較小、色較淺，活力較差；而最接近青霉菌的細菌個最小、色發(fā)白，顯然已經(jīng)死亡 二戰(zhàn)中，為了拯救戰(zhàn)場上的大批傷員，急需大批青霉素，美國政府甚至不惜動用軍用飛機，從世界各地采集含青霉菌的土壤以篩選分泌青霉菌種。青霉素終于

9、在1943年問世，自此，青霉素被廣泛應(yīng)用，創(chuàng)造了一個綠色的醫(yī)學(xué)奇跡，他擊敗了戰(zhàn)時最可怕的殺手傷口感染。1944年，青霉素因治好了英國首相丘吉爾的肺炎而聞名于世。青霉素對人類最顯著的貢獻是在第二次世界大戰(zhàn)規(guī)模最大的登陸戰(zhàn)諾曼底戰(zhàn)役中，它救治了無數(shù)迎著德軍炮火登陸而負傷的盟軍士兵。 如果說，原子彈是第二次世界大戰(zhàn)中殺傷力量最強的武器，那么，青霉素就是從這個戰(zhàn)場拯救生命最多的藥物。難怪有人把原子彈、雷達和青霉素并列為第二次世界大戰(zhàn)期間的三大科學(xué)發(fā)明。為了表彰這一造福人類的貢獻，弗萊明、錢恩、弗洛里于1945年，共同獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎。 抗生素的危害是什么 抗生素產(chǎn)生很多不良反應(yīng)，這是大家屢見不

10、鮮的。比如小孩使用了慶大霉素、丁胺卡那霉素出現(xiàn)了耳聾，以后會成為聾啞兒童，成人使用可能會有腎臟的問題。還有紅霉素里面的四環(huán)素，大量使用會造成肝臟的損害，小孩使用會影響牙齒和骨骼的發(fā)育問題。 是藥三分毒，抗生素也不例外。研究表明，每種抗生素對人體均有不同程度的傷害。鏈霉素、卡那霉素可引起眩暈、耳鳴、耳聾；慶大霉素、卡那霉素、萬古霉素可損害腎臟；紅霉素、林可霉素、強力霉素可引起厭食、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等胃腸道反應(yīng)；氯霉素可引起白細胞減少甚至再生障礙性貧血。鏈霉素、氯霉素、紅霉素、先鋒霉素會抑制免疫功能，削弱機體抵抗力。抗生素可使病菌產(chǎn)生耐藥性！抗生素使用以后微生物可以針對它產(chǎn)生耐藥性，是細菌保

11、護自己的措施。如果我們?yōu)E用抗生素，環(huán)境中存在的這些致病微生物都是耐藥的，那人體生病感染的都是耐藥菌，很難有有效的藥物治療，最后受到損害的是我們?nèi)祟愖约?。?jù)統(tǒng)計，我國每年有8萬人直接或間接死于濫用抗生素，因此造成的肌體損傷以及病菌耐藥性更是無法估量，濫用抗生素使我們?yōu)閼?zhàn)勝疾病付出的代價越來越高使用抗生素的錯誤認識抗菌素越貴越好。不少人認為，抗菌素的價格越貴越好，越及時治病。要知道藥不是普通商品，“便宜沒好貨”的規(guī)律不適用于藥品。只要使用得當(dāng)，幾分錢一片的藥也能達到藥到病除的療效。隨意濫用。最典型的例子就是許多人用抗菌素治療感冒。雖然抗菌素能抗細菌和某些微生物，但不抗病毒，感冒大多是病毒感染，如果

12、隨便亂用抗菌素，只會增加其副作用，并使機體產(chǎn)生耐藥性。無規(guī)律服藥。一些人患病后，病情較重時能按時按量服藥，一旦病情緩解，服藥便隨心所欲?？咕氐乃幮в匈囉谄溆行У难帩舛?，如達不到有效的血藥濃度，不但不能徹底殺滅細菌，反而會使細菌產(chǎn)生耐藥性。多多益善。有人認為吃抗菌素越多越好，只要是抗菌素就能消炎，甚至把幾種抗菌素一起服用。對于確屬細菌感染的疾病，只能根據(jù)引起疾病的不同菌種選擇相應(yīng)的藥物。 （一）概述 效價測定技術(shù)方法： 1、物理、化學(xué)法：簡便、快速，本身純度不高，采用該法會引起偏差，因此只有在純度較高情況下可采用 2、微生物法：原理和臨床應(yīng)用的要求相一致，直接反映出抗生素的療效，且靈敏度較高

13、，需用量較小，因此被廣泛使用。管碟法：是利用抗生素在含敏感試驗菌的瓊脂培養(yǎng)基中的球面擴散滲透作用，從而形成一定的抑菌圈。通過瓊脂培養(yǎng)基，可觀察并測量出抑菌圈的大小。在一定的抗生素濃度范圍內(nèi)，對數(shù)劑量(濃度)與抑菌圈的表面積或直徑成正比。（二）抑菌圈的形成 1、抑菌圈： 將不銹鋼小管(俗稱為牛津杯)放置在含敏感試驗菌的瓊脂培養(yǎng)基上，將抗生素溶液注入小鋼管中，抗生素分子隨溶劑向培養(yǎng)基內(nèi)呈球面狀放射狀擴散。同時將培養(yǎng)基置入適宜試驗菌生長的培養(yǎng)箱中，瓊脂培養(yǎng)基中的試驗菌開始生長?？股胤肿釉诃傊囵B(yǎng)基中的濃度，隨離開小鋼管的距離增大而降低，離小鋼管愈遠，瓊脂培養(yǎng)基中抗生素分子愈少，相應(yīng)的抗生素濃度愈低

14、。當(dāng)抗生素分子擴散到一定時間，在小鋼管周圍形成一個能有效的抑制試驗菌生長的范圍，也就是通常所說的抑菌圈。 2、影響抑菌圈大小的因素： 抑菌圈的半徑(大小)與最小抑菌濃度C，瓊脂層厚度H，抗生素在瓊脂內(nèi)擴散系數(shù)D，抗生素在小鋼管中的量M，以及抗生素的擴散時間T有關(guān)：這些因素的改變，常會影響抑菌圈的大小和清晰度。 按設(shè)計原理不同分:管碟法一劑量法（標準曲線法）二劑量法（22法）三劑量法（33法） 日常使用多采用二劑量法，對于有爭議結(jié)果，必須使用三劑量法測定的結(jié)果仲裁。3、管碟法常用的三種方法：抗生素的效價和單位 抗生素的含量用效價和單位表示。該詞有時不加區(qū)別統(tǒng)稱為效價單位。 效價（otency）：

15、指檢品的實際單位數(shù)與其標示量的比值。常表示為效價的百分數(shù)。效價是從比較檢品與標準品的生物活性而得。 單位（unit,u）：是衡量抗生素有效成分的具體尺度?？股匦r檢定管碟法操作流程:標準品的稱量 標準品的稀釋標準品溶液 供試品的稱量 供試品的稀釋供試品溶液 緩沖液的制備 培養(yǎng)基的制備 底層20 ml菌層5ml 平板的制備 凝固后 凝固后 菌液的制備 加菌液 加小鋼管-可靠性測驗，計算結(jié)果 測量抑菌圈培 養(yǎng) 加陶瓦園蓋二劑量法 二劑量法的原理與測定方法： 該法系將抗生素的標準及檢品各稀釋成一定比例(2:1或4:1)的二種劑量，即高劑量和低劑量。在同一培養(yǎng)基平皿上進行對比，根據(jù)它們所產(chǎn)生的抑菌圈

16、大小計算檢品的效價。 二、操作方法基本要點： 高劑量抗生素溶液所形成的抑菌圈直徑在2024 mm，個別抗生素的抑菌圈可在1824 mm； 高、低劑量所形成的抑菌圈之差最好大于2 mm，有些抗生素的差數(shù)可較?。?高、低劑量之比一般用2:1，當(dāng)高、低劑量所致的抑菌圈差別較小時，可用高低劑量之比為4:1的比率。 操作步驟： 1. 稱量 2. 稀釋 3. 雙碟的制備 4. 放置鋼管 5. 滴加抗生素溶液 6. 抑菌圈測量圖46：鋼管放置器（北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)開發(fā)） 返回抗生素多為結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多組分物質(zhì)，異構(gòu)體多，且不穩(wěn)定。容易產(chǎn)生降解雜志，故各國藥典均以為生物鑒定法為主要含量測定法。標準品的稱

17、量標準品返回 試驗用菌液、緩沖液、培養(yǎng)基、 標準品與供試品溶液的制備 制備過程返回雙碟的制備 制備底層制備菌層放置小鋼管返回 滴加藥液到小鋼管內(nèi) 返回 在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至規(guī)定時間 （蓋上陶瓷蓋）返回測量抑菌圈測量過程（活動）方法一測量儀器方法二測量過程（活動）返回計算結(jié)果返回影響效價測定的因素實驗菌種培養(yǎng)基雙碟的制備培養(yǎng)溫度和時間抗生素污染標準品直線的斜率和截距二、濁度法濁度法是利用抗生素在液體培養(yǎng)基中對試驗菌生長的抑制作用，通過測定培養(yǎng)后細菌濁度值的大小，比較標準品和供試品對試驗菌生長抑制的程度，測定供試品效價的一種方法。第四節(jié) 生化藥物的效力撿定動物保護力試驗定義：將制品對動物進行自動（或被動）免疫后，用活