基因表達(dá)調(diào)控 第三課 mRNA水平的研究9-29

1、 mRNA分析技術(shù)分析技術(shù)基因表達(dá)基因表達(dá)基因表達(dá)的變化可以兩個(gè)水平進(jìn)行分析：基因表達(dá)的變化可以兩個(gè)水平進(jìn)行分析：mRNA 水平水平 和蛋白質(zhì)水平和蛋白質(zhì)水平mRNA表達(dá)變化的檢測方法：表達(dá)變化的檢測方法：Northern blot, RT-PCR(半定量半定量PCR), Real-time PCR (定量定量PCR), 熒光原熒光原位雜交等、位雜交等、基因芯片、高通量測序基因芯片、高通量測序等等mRNA 表達(dá)變化的機(jī)制的研究方法方法有：表達(dá)變化的機(jī)制的研究方法方法有：啟動(dòng)子活性分啟動(dòng)子活性分析（轉(zhuǎn)錄水平分析）、析（轉(zhuǎn)錄水平分析）、mRNA轉(zhuǎn)錄效率分析（轉(zhuǎn)錄效率分析（Nuclear run o

2、n）、）、mRNA穩(wěn)定性檢測（轉(zhuǎn)錄后水平）穩(wěn)定性檢測（轉(zhuǎn)錄后水平）一、一、RNA研究策略和方法研究策略和方法RT-PCR, Real-time PCR，Northern blot, RNA酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)酶保護(hù)實(shí)驗(yàn), 差異篩選，差異篩選，基因芯片基因芯片Total RNA：rRNA約占80-85，tRNA和核內(nèi)小分子RNA約占10%-15%，mRNA約占1%-5%，瓊脂糖凝膠電泳中只能看到：28S，18S，5S。RNA提取注意事項(xiàng)：提取注意事項(xiàng)：要注意RNase的污染，因RNA極易被RNase的降解，操作時(shí)應(yīng)盡量少說話，并在潔凈的環(huán)境中操作，主要防止手、唾液和空氣中RNase的污染；另一方面使用的所

3、有玻璃儀器、移液器、吸頭和離心管都用0.5%DEPC溶液處理過夜,然后高壓滅菌15分鐘.但對于滅菌的一次性使用的塑料制品基本上無RNase，可以不經(jīng)處理直接用于提取RNA，實(shí)驗(yàn)室用的普通玻璃器皿和塑料制品經(jīng)常有RNase污染，使用前必須180度干烤8小時(shí)或更長時(shí)間（玻璃器皿）或用氯仿沖洗（塑料制品）提取用試劑：提取用試劑：Trizol reagent（一）（一）RNA的提取的提取RNA濃度和純度檢測濃度和純度檢測A260/A280 表示質(zhì)量（一般在1.8-2.0），A260表示數(shù)量。RNA完整度檢測完整度檢測28S RNA大小一般為5 kb，18S RNA 大小一般為2 kb。28S RNA

4、的亮度一般是18S 的兩倍。RNA瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳（二）（二）RT-PCR（半定量（半定量PCR）RT-PCR相關(guān)試劑相關(guān)試劑反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄引物1防止防止RNA的降解，保持的降解，保持RNA的完整性。的完整性。2. 避免避免gDNA的污染，用的污染，用DNase處理。處理。3為了防止非特異性擴(kuò)增，必須設(shè)陰性對照。為了防止非特異性擴(kuò)增，必須設(shè)陰性對照。4內(nèi)參的設(shè)定：主要為了用于靶內(nèi)參的設(shè)定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參的定量。常用的內(nèi)參 有有GAPDH、-Actin等。其目的在于避免等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及定量誤差、加樣誤差以及各

5、各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。5. 稀釋稀釋cDNA，內(nèi)參循環(huán)數(shù)，內(nèi)參循環(huán)數(shù)20-26。6. 擴(kuò)增產(chǎn)物長度擴(kuò)增產(chǎn)物長度300-500 bp。注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：（三）（三）Real-time PCR 實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量PCRu在在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號的變化反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號的變化實(shí)時(shí)檢測實(shí)時(shí)檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進(jìn)行定量分析。值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進(jìn)行定量分析。引

6、物設(shè)計(jì)原則引物設(shè)計(jì)原則在在NCBINCBI找到目的基因序列，以找到目的基因序列，以CDSCDS區(qū)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。區(qū)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。1.1.最好位于編碼區(qū)最好位于編碼區(qū)55端的端的300-400bp300-400bp區(qū)域內(nèi)，可以用區(qū)域內(nèi)，可以用DNAman,DNAman, Alignment Alignment 軟件看看結(jié)果。軟件看看結(jié)果。2.2.引物長度一般在引物長度一般在17-2517-25堿基之間堿基之間, ,上下游引物不能相差太大。上下游引物不能相差太大。3.G+C3.G+C含量在含量在40%-60%40%-60%之間，之間，45-5545-55最佳。最佳。4.4.引物自身不能有連續(xù)引物自身

7、不能有連續(xù)4 4個(gè)堿基的互補(bǔ)。個(gè)堿基的互補(bǔ)。5.5.引物之間不能有連續(xù)引物之間不能有連續(xù)4 4個(gè)堿基的互補(bǔ)。個(gè)堿基的互補(bǔ)。6.6.引物引物55端可以修飾。端可以修飾。7. 37. 3端不要以端不要以A A結(jié)尾，結(jié)尾，33端不可修飾，而且要避開端不可修飾，而且要避開AT,GC richAT,GC rich 的區(qū)域，避開的區(qū)域，避開T/C,A/GT/C,A/G連續(xù)結(jié)構(gòu)（連續(xù)結(jié)構(gòu)（2-32-3個(gè)）。個(gè)）。8. 8. 引物引物33端要避開密碼子的第端要避開密碼子的第3 3位。位。9.9. 熒光定量產(chǎn)物長度熒光定量產(chǎn)物長度80-150bp80-150bp最好，最長是最好，最長是300bp.300bp.1

8、0.10. 最好跨內(nèi)含子。最好跨內(nèi)含子。11.11.引物與非特異性擴(kuò)增序列的同源性最好小于引物與非特異性擴(kuò)增序列的同源性最好小于7070。12.TM12.TM值在值在55-6355-63度之間。度之間。uDNA 或或RNA 的絕對定量分析，包括病原微生物的絕對定量分析，包括病原微生物或病毒含量的檢測，轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)或病毒含量的檢測，轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測，的檢測，RNAi 基因失活率的檢測等。基因失活率的檢測等。u基因表達(dá)差異分析，例如比較基因表達(dá)差異分析，例如比較 經(jīng)過不同處理樣本經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異之間特定基因的表達(dá)差異 ( 如藥物處理、物理處如藥物處理

9、、物理處理、化學(xué)處理等理、化學(xué)處理等 ) ，特定基因在不同時(shí)相的表達(dá)，特定基因在不同時(shí)相的表達(dá)差異以及差異以及cDNA 芯片或差顯結(jié)果的確證。芯片或差顯結(jié)果的確證。u基因分型，例如基因分型，例如SNP檢測，甲基化檢測等。檢測，甲基化檢測等。Real-time PCR的應(yīng)用：的應(yīng)用：BAReal-time PCRRT PCR定量定量PCR引物設(shè)計(jì)軟件：引物設(shè)計(jì)軟件：Primer u將待檢的將待檢的RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，繼樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，繼而按照同而按照同Southern blot相同的原理進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和相同的原理進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和用探針進(jìn)行雜交

10、檢測。用探針進(jìn)行雜交檢測。uNorthern blot主要用于檢測樣品中是否含有基主要用于檢測樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）及其含量。）及其含量。（四）（四）Northern blotNorthern blot 流程圖流程圖Northern blot優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：northern blot的靈敏度要好于基因芯片實(shí)驗(yàn)，而基因芯片優(yōu)勢在于的靈敏度要好于基因芯片實(shí)驗(yàn)，而基因芯片優(yōu)勢在于 它可在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)反映出幾千個(gè)基因表達(dá)量的變化；它可在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)反映出幾千個(gè)基因表達(dá)量的變化； 與定量與定量PCR的高靈敏度相比，的高靈敏度相比，northern blot較高的特異性可以

11、有效較高的特異性可以有效 的減少實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽性。的減少實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽性。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： Northern blot 實(shí)驗(yàn)中要防止實(shí)驗(yàn)中要防止RNA的降解，所有實(shí)驗(yàn)用品都需要經(jīng)的降解，所有實(shí)驗(yàn)用品都需要經(jīng) 過除去過除去RNA酶的過程，如高溫烘烤、酶的過程，如高溫烘烤、DEPC處理等。同時(shí)，處理等。同時(shí)， northern blot中很多實(shí)驗(yàn)用品如甲醛、中很多實(shí)驗(yàn)用品如甲醛、EB、DEPC、紫外燈等對人、紫外燈等對人 體都有一定的傷害。體都有一定的傷害。Northern blot 的優(yōu)勢在于它可檢測目的片段的大小、是否具有可變剪切出現(xiàn)、可允許探針的部分不配對性，雜交過后的膜經(jīng)過一定的處理除去探針后

12、還可保存很長時(shí)間再次雜交使用。（五）核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)（五）核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)（ribonuclease protection assay，RPA）是靈敏度和特異性很高的是靈敏度和特異性很高的mRNA定量分析方法定量分析方法 基本原理：基本原理： 將標(biāo)記的特異將標(biāo)記的特異RNA探針（探針（32P或生物素）與待測的或生物素）與待測的RNA樣品液相雜交，標(biāo)記的特異樣品液相雜交，標(biāo)記的特異RNA探針與目的探針與目的RNA結(jié)合，形成雙鏈結(jié)合，形成雙鏈RNA，免受，免受RNA酶的消化；酶的消化；而未結(jié)合的單鏈而未結(jié)合的單鏈RNA經(jīng)經(jīng)RNA酶酶A或或RNA酶酶T1消化消化形成寡核糖核酸。形成寡核糖核酸。R

13、PA基本程序：基本程序： 待測待測RNA的分離的分離 體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記RNA探針探針 待測待測RNA與探針與探針RNA進(jìn)行液相雜交進(jìn)行液相雜交 RNA酶消化酶消化 不同大小雜交片段凝膠電泳分離不同大小雜交片段凝膠電泳分離核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)原理示意圖核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)原理示意圖32P標(biāo)記的探針：雜交雙鏈進(jìn)行變性PAGE， 用放射自顯影或磷屏成像系統(tǒng)檢測探針的信號；生物素標(biāo)記的探針：雜交雙鏈經(jīng)過變性PAGE后，電轉(zhuǎn)移至尼龍膜，用鏈霉親和素辣根過氧化物酶和化學(xué)發(fā)光底物與膜上biotin標(biāo)記的探針結(jié)合，X射線膠片或化學(xué)發(fā)光圖像分析儀檢測雜交信號。RPA比比Northern Blot的優(yōu)勢：的優(yōu)

14、勢：1. 過量的探針與目的基因的雜交在液相環(huán)境完成，反應(yīng)過量的探針與目的基因的雜交在液相環(huán)境完成，反應(yīng)更加完全更加完全 2. RPA比比Northern Blot靈敏靈敏15-150倍倍，適合檢測各種表，適合檢測各種表達(dá)水平之基因達(dá)水平之基因 3. RPA通量高，通量高，同時(shí)檢測多個(gè)基因同時(shí)檢測多個(gè)基因，可評價(jià)他們在同一，可評價(jià)他們在同一情況下的差異表達(dá)情況下的差異表達(dá) 4. 一次一次RPA就能完成就能完成10 多次多次Northern Blot的工作，加的工作，加快研究速度快研究速度可對細(xì)胞或組織中原位表達(dá)的可對細(xì)胞或組織中原位表達(dá)的mRNA進(jìn)行區(qū)域定位進(jìn)行區(qū)域定位標(biāo)記探針特異性地與目標(biāo)靶標(biāo)

15、記探針特異性地與目標(biāo)靶mRNA序列雜交，檢測標(biāo)序列雜交，檢測標(biāo)記信號來確定基因在組織和細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的區(qū)位信息。記信號來確定基因在組織和細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的區(qū)位信息?？勺鳛槎糠治龅难a(bǔ)充?？勺鳛槎糠治龅难a(bǔ)充。（六）原位雜交（六）原位雜交（in situ hybridization，ISH）什么情況下選擇原位雜交？什么情況下選擇原位雜交？沒有合適的抗體，不宜做沒有合適的抗體，不宜做Western blot檢測；樣本量太少或比檢測；樣本量太少或比較復(fù)雜，不宜提取較復(fù)雜，不宜提取RNA或蛋白?；虻鞍?。原位雜交技術(shù)主要步驟：原位雜交技術(shù)主要步驟： 材料處理及細(xì)胞樣品的固定；材料處理及細(xì)胞樣品的固定； 樣品的制備

16、和預(yù)處理；樣品的制備和預(yù)處理； 探針的制備和預(yù)雜交；探針的制備和預(yù)雜交； 探針及樣品的變性；探針及樣品的變性； 雜交溫育；雜交溫育； 檢測雜交信號，進(jìn)行結(jié)果分析。檢測雜交信號，進(jìn)行結(jié)果分析。（七）差異表達(dá)基因篩選方法（七）差異表達(dá)基因篩選方法u 表達(dá)序列標(biāo)簽表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequencing tag，EST) 技術(shù)，技術(shù)，1991u 差異顯示差異顯示RT-PCR(different display reverse transcription PCR，DDRT-PCR)，1992 u 抑制性差減雜交抑制性差減雜交(suppression subtractive hybridi

17、sation，SSH)，1996 u 基因芯片基因芯片(gene chip or micrOarray)u 基因表達(dá)的系列分析基因表達(dá)的系列分析(serial analysis of gene expression，SAGE)，1995 u 基于高通量測序的數(shù)字基因表達(dá)譜基于高通量測序的數(shù)字基因表達(dá)譜(DGE)分析分析轉(zhuǎn)錄抑制劑：轉(zhuǎn)錄抑制劑：actinomycin D (ActD), 放線菌素D5,6-dichloro-1D-ribofuranosyl-benzimidazole (DRB),-amanitin (-Am)（八）（八）mRNA穩(wěn)定性分析穩(wěn)定性分析熒光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)熒光素酶

18、報(bào)告基因分析系統(tǒng)二、二、mRNA穩(wěn)定性調(diào)節(jié)的機(jī)制穩(wěn)定性調(diào)節(jié)的機(jī)制AU-rich elements (AREs) : AUUUA, 7-9% of cellular mRNAsThese elements are recognized by trans-acting factors, such as mRNA-binding proteins that bind directly or indirectly to the cis-acting elements and promote the deadenylation and degradation of the mRNA.AU-rich el

19、ement RNA-binding protein 1 (AUF1), tristetraprolin (TTP) ,KH-type splicing regulatory protein (KSRP)embryonic lethal abnormal vision (ELAV)-like protein 1 (HuR) and polyadenylate-binding protein-interacting protein 2 (PAIP2)（1）AU-rich sequences and mRNA binding proteins（2）Regulatory non-coding RNAm

20、iRNAs act by pairing to the mRNAs of protein-coding genes to direct their repression. lncRNAs show different mechanism of action, varying from chromatin remodeling, transcriptional responses and RNA processing.（3）Alternative polyadenylation (APA)APA consist of two steps, cleavage and polyadenylation of RNAs, which are maturation events that cut and add an oligo(dA) tail to the 3 end of the nascent transcript. This processing protects mRNAs from degradati