分子生物學(xué)翻譯

1、 Protein Biosynthesis (Translation)蛋白質(zhì)的生物合成(翻譯)1 蛋白質(zhì)的生物合成過(guò)程就是將mRNA分子中由堿基序列組成的遺傳信息，通過(guò)遺傳密碼破譯的方式轉(zhuǎn)變成為蛋白質(zhì)中的氨基酸排列順序，因而稱(chēng)為翻譯（translation)。2DNA復(fù)制RNA轉(zhuǎn)錄翻譯蛋白質(zhì)多肽鏈靶向運(yùn)輸折疊遺傳信息的傳遞過(guò)程逆轉(zhuǎn)錄3如何證明三個(gè)堿基決定一個(gè)氨基酸？45 第一節(jié)蛋白質(zhì)合成體系Protein Biosynthesis System6 7 20種氨基酸作為原料 酶及蛋白因子，如IF、eIF等 ATP、GTP、無(wú)機(jī)離子參與蛋白質(zhì)生物合成的物質(zhì)包括： 三種RNA mRNA rRNA t

2、RNA8真核細(xì)胞內(nèi)RNA的種類(lèi)及功能細(xì)胞定位英文縮寫(xiě)分子大小及沉降系數(shù)功能 胞漿mRNA100010,000個(gè)核苷酸 蛋白質(zhì)合成模板 胞漿tRNA74-95個(gè)核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸與密碼子識(shí)別 胞漿rRNA28S，5400個(gè)核苷酸18S，2100個(gè)核苷酸5.8S，160個(gè)核苷酸5S， 120個(gè)核苷酸構(gòu)成核糖體 ，蛋白質(zhì)合成場(chǎng)所S：沉降系數(shù) （1S=10-13秒）堿基數(shù)量：bp, Kb, Mb9原核生物16S rRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)10 1961年，Nirenberg 證明了mRNA的模板作用。一、翻譯模板mRNA及遺傳密碼11細(xì)菌礬土顆粒輕輕研磨細(xì)菌液離心，去除細(xì)胞壁和膜提取液（DNA、mRNA、tRN

3、A、核糖體、酶、離子）DNA水解酶，20種氨基酸等蛋白質(zhì)12DNase蛋白質(zhì)合成量時(shí)間13 mRNA是遺傳信息的攜帶者遺傳學(xué)將編碼一個(gè)多肽的遺傳單位稱(chēng)為順?lè)醋樱╟istron）。原核細(xì)胞中數(shù)個(gè)結(jié)構(gòu)基因常串聯(lián)為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，轉(zhuǎn)錄生成的mRNA可編碼幾種功能相關(guān)的蛋白質(zhì)，為多順?lè)醋樱╬olycistron）。真核生物一個(gè)mRNA只編碼一種蛋白質(zhì)，為單順?lè)醋樱╯ingle cistron）。 145335YAZ乳糖操縱子模型53mRNA轉(zhuǎn)錄翻譯多順?lè)醋?516mRNA結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖17 mRNA上存在遺傳密碼mRNA分子上從5至3方向，由AUG開(kāi)始，每3個(gè)核苷酸為一組，決定肽鏈上某一個(gè)氨基酸或蛋白質(zhì)合成的

4、起始、終止信號(hào)，稱(chēng)為三聯(lián)體密碼（triplet codon）。18ORF從mRNA 5端起始密碼子AUG到3端終止密碼子之間的核苷酸序列，各個(gè)三聯(lián)體密碼連續(xù)排列編碼一條多肽鏈，稱(chēng)為開(kāi)放閱讀框架(open reading frame, ORF)。 19保溫蛋白質(zhì)合成停止poly U，ATP，GTP，氨基酸多聚苯丙氨酸（UUU是Phe的密碼子）同樣方法證明了CCC是Pro的密碼子，AAA是Lys的密碼子。提取液（DNA、mRNA、tRNA、核糖 體、酶、離子）遺傳密碼的破譯20遺傳密碼表密碼子的第一個(gè)字母密碼子的第二個(gè)字母21密碼總數(shù)：61個(gè)編碼20種氨基酸22 起始密碼（initiation c

5、oden ):第一個(gè)AUG AUG 意義：編碼甲硫氨酸， 原核生物為甲?；琢虬彼崽厥饷艽a： (special coden)UAA、 UAG 、 UGA（赭石） （琥珀）（乳白石）終止密碼（terminatiom coden）231. 連續(xù)性（commaless）遺傳密碼的特點(diǎn)編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列的各個(gè)三聯(lián)體密碼連續(xù)閱讀，密碼間既無(wú)間隔也無(wú)重疊。 24重疊密碼非重疊連續(xù)的密碼不連續(xù)的密碼25基因損傷引起mRNA閱讀框架內(nèi)的堿基發(fā)生插入或缺失，可能導(dǎo)致框移突變(frameshift mutation)。 26由于對(duì)mRNA外顯子的加工，造成mRNA與其DNA模板序列之間不匹配，使同一mRNA前體

6、翻譯出序列、功能不同的蛋白質(zhì)。這種基因表達(dá)的調(diào)節(jié)方式稱(chēng)為mRNA編輯（mRNA editing)。 mRNA編輯272. 簡(jiǎn)并性（degeneracy）遺傳密碼中，除色氨酸和甲硫氨酸僅有一個(gè)密碼子外，其余氨基酸有24個(gè)或多至6個(gè)密碼子為之編碼。28遺傳密碼的簡(jiǎn)并性29密碼子簡(jiǎn)并性的生物學(xué)意義：減少有害突變。 遺傳密碼的特異性主要取決于前兩位堿基。GCU ACUGCC ACCGCA ACAGCG ACG AlaThr30遺傳密碼的偏愛(ài)性（bias or preference)多數(shù)氨基酸有一個(gè)以上的密碼子但這些密碼子使用的頻率各不相同，稱(chēng)之遺傳密碼的偏愛(ài)性。密碼子使用的頻率與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的tRNA含

7、量有關(guān)313. 通用性（universal）蛋白質(zhì)生物合成的整套密碼，從原核生物到人類(lèi)都通用。 有少數(shù)例外，如動(dòng)物細(xì)胞的線粒體、植物細(xì)胞的葉綠體。密碼的通用性進(jìn)一步證明各種生物進(jìn)化自同一祖先。 324. 擺動(dòng)性（wobble）tRNA上反密碼子的第1位堿基與mRNA密碼子的第3位堿基配對(duì)時(shí)，可以在一定范圍內(nèi)變動(dòng)，即并不嚴(yán)格遵循堿基配對(duì)規(guī)律，這一現(xiàn)象稱(chēng)為擺動(dòng)性。33擺動(dòng)配對(duì)U34 35二、核蛋白體是多肽鏈合成的裝置 36核蛋白體的組成核蛋白體原核生物真核生物蛋白質(zhì)S值rRNA蛋白質(zhì)S值rRNA小亞基21種30S16S33種40S18S大亞基34種50S23S5S49種60S28S5.8S5S核蛋

8、白體70S80S3738原核生物核蛋白體結(jié)構(gòu)模式39 30S小亞基：有mRNA結(jié)合位點(diǎn)50S大亞基： E位：排出位（Exit site）轉(zhuǎn)肽酶活性大小亞基共同組成：A位：氨基酰位(aminoacyl site)P位：肽酰位(peptidyl site)40三、tRNA與氨基酸的活化反密碼環(huán)氨基酸臂tRNA在翻譯過(guò)程中起接合體（adaptor）作用，又是氨基酸的運(yùn)載體。4142tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖43氨基酸 + tRNA氨基酰- tRNAATP AMPPPi氨基酰-tRNA合成酶（一）氨基酰-tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase) 氨基酸的活化44第一步反應(yīng)氨基

9、酸ATPE 氨基酰-AMP-EAMP PPi 45第二步反應(yīng)氨基酰-AMP-E tRNA 氨基酰-tRNA AMP E46 47氨基酰-tRNA合成酶對(duì)氨基酸和tRNA都有高度特異性。氨基酰-tRNA合成酶具有校正活性(proof-reading activity) 。氨基酰-tRNA的表示方法：Ala-tRNAAla Ser-tRNASerMet-tRNAMet 48 氨基酸的活化形式：氨基酰tRNA氨基酸的活化部位：羧基氨基酸與tRNA連接方式：酯鍵氨基酸活化耗能：2個(gè)P49真核生物： Met-tRNAiMet原核生物： fMet-tRNAifMet（二）起始肽鏈合成的氨基酰-tRNA50

10、 fMet-tRNAifMet的生成：51 第二節(jié)蛋白質(zhì)生物合成過(guò)程The Process of Protein Biosynthesis52蛋白質(zhì)合成中mRNA模板的方向：5 3；蛋白質(zhì)的合成方向：N端 C端。蛋白質(zhì)合成過(guò)程：起始延長(zhǎng)終止53一、肽鏈合成起始指mRNA和起始氨基酰-tRNA分別與核蛋白體結(jié)合而形成翻譯起始復(fù)合物 (translational initiation complex)。參與起始過(guò)程的蛋白質(zhì)因子稱(chēng)起始因子（initiation factor，IF）。54參與起始過(guò)程的蛋白質(zhì)因子稱(chēng)起始因子（initiation factor，IF）。原核生物起始因子有三種：IF-1：

11、占據(jù)A位防止結(jié)合其他tRNA。IF-2：促進(jìn)起始tRNA與小亞基結(jié)合。IF-3：促進(jìn)大小亞基分離，提高P位對(duì)結(jié)合起始tRNA敏感性。55（一）原核生物翻譯起始復(fù)合物形成核蛋白體大小亞基分離；mRNA在小亞基定位結(jié)合；起始氨基酰-tRNA的結(jié)合； 核蛋白體大亞基結(jié)合。56IF-3IF-11. 核蛋白體大小亞基分離57AUG53IF-3IF-12. mRNA在小亞基定位結(jié)合58S-D序列：在原核生物mRNA起始密碼AUG上游，存在49個(gè)富含嘌呤堿的一致性序列，如-AGGAGG-，稱(chēng)為S-D序列。又稱(chēng)為核蛋白體結(jié)合位點(diǎn)（ribosomal binding site，RBS) 59S-D序列 60IF

12、-3IF-1IF-2GTPAUG533. 起始氨基酰tRNA與小亞基結(jié)合61IF-3IF-1IF-2GTPGDPPiAUG534. 核蛋白體大亞基結(jié)合62IF-3IF-1AUG53IF-2GTPIF-2-GTPGDPPi起始過(guò)程消耗1個(gè)GTP。63（二）真核生物翻譯起始復(fù)合物形成核蛋白體大小亞基分離；起始氨基酰-tRNA結(jié)合；mRNA在核蛋白體小亞基就位；核蛋白體大亞基結(jié)合。64真核生物翻譯起始因子 起始因子生物功能eIF-2促進(jìn)起始tRNA與小亞基結(jié)合eIF-2B, eIF-3促進(jìn)大小亞基分離eIF-4AeIF-4F復(fù)合物成分，有解螺旋酶活性，促進(jìn)mRNA結(jié)合小亞基eIF-4B促進(jìn)mRNA掃

13、描定位起始AUGeIF-4EeIF-4F復(fù)合物成分，結(jié)合mRNA 5帽子eIF-4GeIF-4F復(fù)合物成分，結(jié)合eIF-4E和PABeIF-5促進(jìn)各種起始因子從小亞基解離，進(jìn)而結(jié)合大亞基eIF-6促進(jìn)核蛋白體分離成大小亞基6566Met40SMetMet40S60SmRNAeIF-2B、eIF-3、 eIF-6 elF-3GDP+Pi各種elF釋放elF-5ATPADP+PielF4E, elF4G, elF4A, elF4B,PAB真核生物翻譯起始復(fù)合物形成過(guò)程Met-tRNAiMet-elF-2 -GTPMet60S67 真核生物翻譯起始的特點(diǎn)核蛋白體是80S；起始因子種類(lèi)多；起始tRNA

14、的Met不需甲?；?；mRNA的5帽子和3poly A尾結(jié)構(gòu)與mRNA在核蛋白體就位有關(guān)；起始tRNA先與核蛋白體小亞基結(jié)合，然后再結(jié)合mRNA68二、肽鏈的延長(zhǎng)指按照mRNA密碼序列的指導(dǎo)，依次添加氨基酸從N端向C端延伸肽鏈，直到合成終止的過(guò)程。 69肽鏈的延長(zhǎng)是在核蛋白體上連續(xù)性循環(huán)式進(jìn)行，又稱(chēng)為核蛋白體循環(huán)（ribosomal cycle)，每次循環(huán)增加一個(gè)氨基酸，分為以下三步：進(jìn)位（entrance）成肽（peptide bond formation）轉(zhuǎn)位（translocation）70原核延長(zhǎng)因子生物功能對(duì)應(yīng)真核延長(zhǎng)因子EF-Tu促進(jìn)氨基酰-tRNA進(jìn)入A位，結(jié)合分解GTPEF-1-

15、EF-Ts調(diào)節(jié)亞基EF-1-EFG有轉(zhuǎn)位酶活性，促進(jìn)mRNA-肽酰-tRNA由A位前移到P位，促進(jìn)卸載tRNA釋放EF-2肽鏈合成的延長(zhǎng)因子 71（一）進(jìn)位指根據(jù)mRNA下一組遺傳密碼指導(dǎo)，使相應(yīng)氨基酰-tRNA進(jìn)入核蛋白體A位。 72延長(zhǎng)因子EF-T催化進(jìn)位（原核生物） 7374TuTsGTPGDPAUG53TuTsGTP75（二）成肽是由轉(zhuǎn)肽酶（transpeptidase）催化的肽鍵形成過(guò)程。76（三）轉(zhuǎn)位延長(zhǎng)因子EF-G有轉(zhuǎn)位酶（translocase ）活性，可結(jié)合并水解1分子GTP，促進(jìn)核蛋白體向mRNA的3側(cè)移動(dòng)。7778fMetAUG53fMetTuGTP79進(jìn)位轉(zhuǎn)位成肽80真

16、核生物肽鏈合成的延長(zhǎng)過(guò)程與原核基本相似，但有不同的反應(yīng)體系和延長(zhǎng)因子。另外，真核細(xì)胞核蛋白體沒(méi)有E位，轉(zhuǎn)位時(shí)卸載的tRNA直接從P位脫落。（四）真核生物延長(zhǎng)過(guò)程81 三、肽鏈合成的終止當(dāng)mRNA上終止密碼出現(xiàn)后，多肽鏈合成停止，肽鏈從肽酰-tRNA中釋出，mRNA、核蛋白體等分離，這些過(guò)程稱(chēng)為肽鏈合成終止。 82終止相關(guān)的蛋白因子稱(chēng)為釋放因子 (release factor, RF) 識(shí)別終止密碼，如RF-1特異識(shí)別UAA、UAG；而RF-2可識(shí)別UAA、UGA。誘導(dǎo)轉(zhuǎn)肽酶改變?yōu)轷ッ富钚裕闺逆湉暮说鞍左w上釋放。 釋放因子的功能原核生物釋放因子：RF-1，RF-2，RF-3 真核生物釋放因子：

17、eRF 83原核肽鏈合成終止過(guò)程 84UAG53RFCOO-85 原核生物蛋白質(zhì)合成的能量計(jì)算氨基酸活化：2個(gè)PATP起始： 1個(gè)GTP延長(zhǎng)： 2個(gè)GTP終止： 1個(gè)GTP結(jié)論：每合成一個(gè)肽鍵至少消耗4個(gè)P。86原核生物與真核生物蛋白質(zhì)合成過(guò)程的異同相同點(diǎn)：遺傳密碼：相同蛋白質(zhì)合成方向：沿mRNA 5 3方向翻譯，肽 鏈合成方向是N C氨基酸活化：氨基酸需要先活化成氨基酰-tRNA 后參與蛋白質(zhì)的合成能量消耗：都需要消耗大量ATP多聚核蛋白體：都存在，使蛋白合成快速高效87原核生物與真核生物蛋白質(zhì)合成過(guò)程的異同 原核生物 真核生物 模板： mRNA不需要加工，半衰期短， mRNA需要加工，半衰

18、期長(zhǎng) 1-3分鐘 數(shù)小時(shí)-十幾小時(shí)轉(zhuǎn)錄與翻譯： 偶聯(lián) 不偶聯(lián)翻譯過(guò)程：起始：SD序列，fMet-tRNAifmet 5-CBP，Met-tRNAiMet， IF eIF 延長(zhǎng)：EF eEF 終止：RFs eRF翻譯產(chǎn)物：由多順?lè)醋觤RNA翻譯成多個(gè) 由單順?lè)醋觤RNA翻譯成一 多肽鏈 條多肽鏈不同點(diǎn)：88 多聚核蛋白體 （polysome)一個(gè)mRNA分子可同時(shí)有多個(gè)核蛋白體在進(jìn)行同一種蛋白質(zhì)的合成，這種mRNA和多個(gè)核蛋白體的聚合物稱(chēng)為多聚核蛋白體。89電鏡下的多聚核蛋白體現(xiàn)象目 錄90mRNA核糖體DNA53 PABCD多聚核蛋白體產(chǎn)生91Directed by Gabriel Weiss

19、. One of the strangest, fun, and perhaps most unforgettable films in the science genre was this, produced by University of California at San Diego chemistry professor Kent Wilson, and choreographed by Weiss future wife and 1969 Americas Junior Miss, Jackie Benington. After a short description of the

20、 interaction between “stars” 30s Ribosome, mRNA, and Initiator Factor One by Stanfords Nobel Prize-winning Paul Berg, the camera moves to an open field at Stanford University, where 200 students, fortified by complimentary wine, begin a Bacchanalian dance replicating the process of protein formation

21、 by RNA molecules that carry the DNA code. Benington kept some degree of order by making sure that each string of processes was led by a student in the advanced modern dance program at he university, but clearly the dancers are barely controlled, spurred on the by a free-music band of musicians, who

22、, clearly inspired by their philosophical and geographical proximity to the Haight-Ashbury and the Merry Pranksters La Honda, perform a raucous piece called the Protein Jive Sutra. The film is, in addition to being a superior example of affective filmmaking, a landmark film defining the early 1970s

23、San Francisco Bay Area art, performance, and alternative lifestyles culture. Director Gabriel Weiss, a multifaceted individual who eventually became a doctor of internal medicine and led a twenty-piece jazz band, stated thirty years later that perhaps the most satisfying element about the film is ho

24、w well the biological model presented in the film held up over the ensuing years.92Protein Synthesis: an Epic on the Cellular Level (1971)93四.蛋白質(zhì)生物合成的調(diào)節(jié)（一）閱讀框架的漂移、重疊和5AUG 的作用1.基因重疊調(diào)節(jié)： 同一DNA序列以不同的框架閱讀方式編碼不同種類(lèi)的蛋白質(zhì)94病毒基因組中重疊基因95 BA基因重疊A蛋白質(zhì)B蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯mRNA5353962. 5-AUG的作用起始密碼AUG上游的非編碼區(qū)也有一個(gè)或數(shù)個(gè)AUG稱(chēng)5 AUG,。 從非

25、編碼區(qū)第一個(gè)5 AUG開(kāi)始翻譯很快就會(huì)遇到終止密碼子,翻譯的產(chǎn)物為無(wú)活性的短肽,減少正常AUG的翻譯啟動(dòng)作用,從而抑制正常翻譯的頻率.對(duì)翻譯起始的競(jìng)爭(zhēng).97AUGCAAGCCGGU53編碼區(qū)正常翻譯5 AUG競(jìng)爭(zhēng)正常起始密碼翻譯AUGCAAGCCGGU53AUGAAAAUGAG編碼區(qū)非編碼區(qū)98（二）翻譯錯(cuò)誤校正.tRNA與密碼子反向互補(bǔ)配對(duì)，以上是遺傳信息正確解讀的保障.氨基酰-tRNA合成酶對(duì)氨基酸與tRNA特異選擇性99（三）5帽和polyA尾2.polyA位點(diǎn)的數(shù)目，有或無(wú)對(duì)形成不同類(lèi)型的翻譯產(chǎn)物具有重要的調(diào)節(jié)意義5帽和polyA尾具有保護(hù)mRNA維持 其穩(wěn)定, 保證翻譯過(guò)程的穩(wěn)定.1

26、00 降鈣素基因降鈣素35P 12345含有剪切位點(diǎn)序列TTATTTmRNApolyA1 2 3 1 2 3 4 5 polyA降鈣素基因相關(guān)多肽polyA的調(diào)節(jié)101蛋白質(zhì)合成后加工和輸送Posttranslational Processing & Protein Transportation第 三 節(jié)102從核蛋白體釋放出的新生多肽鏈不具備蛋白質(zhì)生物活性，必需經(jīng)過(guò)不同的翻譯后復(fù)雜加工過(guò)程才轉(zhuǎn)變?yōu)樘烊粯?gòu)象的功能蛋白。主要包括多肽鏈折疊為天然的三維結(jié)構(gòu) 肽鏈一級(jí)結(jié)構(gòu)的修飾高級(jí)結(jié)構(gòu)修飾 103 瘋牛病和“克雅氏癥 1986, England首次發(fā)現(xiàn)。 朊病毒蛋白（prion relative p

27、rotein,PrPc） 是存在于神經(jīng)原、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞的 細(xì)胞膜上的糖蛋白。 Chr20，3335 kD。3. PrPc的空間構(gòu)象異常改變104一、多肽鏈折疊為天然功能構(gòu)象的蛋白質(zhì)新生肽鏈的折疊在肽鏈合成中、合成后進(jìn)行，新生肽鏈N端在核蛋白體上一出現(xiàn)，肽鏈的折疊即開(kāi)始?？赡茈S著序列的不斷延伸肽鏈逐步折疊，產(chǎn)生正確的二級(jí)結(jié)構(gòu)、模體、結(jié)構(gòu)域到形成完整的空間構(gòu)象。大多數(shù)天然蛋白質(zhì)折疊都需要其他酶和蛋白質(zhì)的輔助。105幾種有促進(jìn)蛋白折疊功能的大分子1. 分子伴侶 (molecular chaperon) 2. 蛋白二硫鍵異構(gòu)酶 (protein disulfide isomerase, PD

28、I)3. 肽-脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶 (peptide prolyl cis-trans isomerase, PPI)106（1）熱休克蛋白(heat shock protein, HSP) HSP70、HSP40和GreE族 （2）伴侶素(chaperonins) GroEL和GroES家族1. 分子伴侶分子伴侶是細(xì)胞中一類(lèi)保守蛋白質(zhì)，可識(shí)別肽鏈的非天然構(gòu)象，促進(jìn)各功能域和整體蛋白質(zhì)的正確折疊。 107熱休克蛋白促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊的基本作用：結(jié)合保護(hù)待折疊多肽片段，再釋放該片段進(jìn)行折疊。形成HSP70和多肽片段依次結(jié)合、解離的循環(huán)。 108HSP40結(jié)合待折疊多肽片段 HSP70-ATP復(fù)合物 HS

29、P40- HSP70-ADP-多肽復(fù)合物 ATP水解GrpE ATPADP復(fù)合物解離，釋出多肽鏈片段進(jìn)行正確折疊 109伴侶素的主要作用:為非自發(fā)性折疊蛋白質(zhì)提供能折疊形成天然空間構(gòu)象的微環(huán)境。 110伴侶素系統(tǒng)促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊過(guò)程 1112. 蛋白二硫鍵異構(gòu)酶（PDI） 二硫鍵異構(gòu)酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔活性很高，可在較大區(qū)段肽鏈中催化錯(cuò)配二硫鍵斷裂并形成正確二硫鍵連接，最終使蛋白質(zhì)形成熱力學(xué)最穩(wěn)定的天然構(gòu)象。1123. 肽-脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶 多肽鏈中肽酰-脯氨酸間形成的肽鍵有順?lè)磧煞N異構(gòu)體，空間構(gòu)象明顯差別。 肽酰-脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶可促進(jìn)上述順?lè)磧煞N異構(gòu)體之間的轉(zhuǎn)換。 肽酰-脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶是蛋白質(zhì)三維

30、構(gòu)象形成的限速酶，在肽鏈合成需形成順式構(gòu)型時(shí)，可使多肽在各脯氨酸彎折處形成準(zhǔn)確折疊。 113二、一級(jí)結(jié)構(gòu)的修飾（一）肽鏈N端的修飾（二）個(gè)別氨基酸的修飾（三）多肽鏈的水解修飾114（二）個(gè)別氨基酸的的共價(jià)修飾糖基化羥基化甲基化磷酸化乙?；H脂化115N-連接糖蛋白的形成116 O 型 A 型 B 型 糖鏈與ABO血型 GlcNAc： Gal： Glc： GalNAc： Fuc： 117免疫球蛋白分子IgG的糖鏈結(jié)構(gòu) 正常糖鏈 IgG異常糖鏈 IgG1異常糖鏈 IgG0118 親脂化：疏水脂鏈的連接Ras蛋白脂肪酸鏈Ras蛋白R(shí)as蛋白119鴉片促黑皮質(zhì)素原(POMC)的水解修飾NC信號(hào)肽PMO

31、CKRKR103肽 ( ？)ACTH-LT-MSH-MSHEndophin120胰島素原的C肽切除胰島素的水解加工過(guò)程-非功能片段的切除2.121 3.內(nèi)含肽的切除 內(nèi)含子 外顯子內(nèi)含肽（intein）：前體蛋白的肽鏈切除的一些氨 基酸序列。外顯肽（extein）：內(nèi)含肽兩側(cè)的氨基酸序列，在 內(nèi)含肽切除后重新連接起來(lái)成 為成熟的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。內(nèi)含肽剪接是自我催化，機(jī)制不詳。122三、高級(jí)結(jié)構(gòu)的修飾（一）亞基聚合 （二）輔基連接（三）疏水脂鏈的共價(jià)連接 123蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定 許多蛋白質(zhì)在翻譯中或翻譯后在氨基酸鏈上共價(jià)結(jié)合各種非肽類(lèi)基團(tuán)，形成翻譯后修飾。修飾約有30多種類(lèi)型。124Post-

32、Translational Modifications (PTM)酰胺化甲硫基化氨甲?；位撬醽喕撬崦擋０坊柞；罐⑺峄粱貦磅；蛐了峄瘉喯趸姿徇炼叽蓟姿岱乎€基乙胺化三棕櫚酸 三棕櫚酸化瓜氨酸化125最常見(jiàn)修飾包括磷酸化，糖基化。蛋白質(zhì)的糖基化修飾和磷酸化修飾在生命活動(dòng)中具有重要的調(diào)控作用，因此也是目前蛋白質(zhì)組中翻譯后修飾研究的熱點(diǎn)。126第一節(jié) 磷酸化蛋白質(zhì)的鑒定一 生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)磷酸化修飾及其功能Analysis of the entire complement of phosphorylated proteins in cells:“phosphoproteome”。

33、蛋白質(zhì)磷酸化是最常見(jiàn)、最重要的共價(jià)修飾方式。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期中，大約有13的蛋白質(zhì)發(fā)生過(guò)磷酸化的修飾，在脊推動(dòng)物基因組中，有5的基因編碼的蛋白質(zhì)是參與磷酸化和去磷酸化過(guò)程的蛋白激酶(kinase)和磷酸(酯)酶(phosphatase)。 蛋內(nèi)質(zhì)的磷酸化和去磷酸化這一可逆過(guò)程幾乎調(diào)節(jié)著生命活動(dòng)的所有過(guò)程，包括細(xì)胞的增殖、發(fā)育和分化 ，細(xì)胞骨架調(diào)控、細(xì)胞凋亡等。127 真核細(xì)胞蛋白質(zhì)的磷酸化翻譯后修飾一般是O-磷酸化即磷酸化位點(diǎn)在蛋白質(zhì)的絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)殘基側(cè)鏈的羥基上。 原核生物中蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)常在組氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)

34、，此外，在賴(lài)氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)和半胱氨酸(Cys)也會(huì)發(fā)生磷酸化修飾。 不同的蛋白激酶可識(shí)別和修飾不同蛋白質(zhì)的不同位點(diǎn)(不同的氨基酸順序)。128真核細(xì)胞蛋白質(zhì)中常見(jiàn)的幾種磷酸化修飾氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)129二. 磷酸化蛋白質(zhì)分析概述 傳統(tǒng)的磷酸化蛋白質(zhì)的分析有許多是利用體外激酶反應(yīng)使蛋白質(zhì)被磷酸化修飾，產(chǎn)生足夠用于分析的磷酸化蛋白，經(jīng)化學(xué)或質(zhì)譜分析確定磷酸化位點(diǎn)，例如Edman測(cè)序和串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)序。同時(shí)為了證明體外研究確定的磷酸化位點(diǎn)確實(shí)具有生物學(xué)意義，還必須證實(shí)在體內(nèi)存在相同的磷酸化位點(diǎn)。 通常通過(guò)比較磷酸化蛋白質(zhì)的二維磷酸肽圖得以證實(shí)。當(dāng)體內(nèi)和體外同一磷酸化蛋白質(zhì)酶切后各自的磷酸

35、肽在二維譜圖中共遷移時(shí)，可認(rèn)為體內(nèi)、體外磷酸化蛋白有相同的磷酸化位點(diǎn)。130傳統(tǒng)分析方法的局限性 這個(gè)方法間接確定了體內(nèi)蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)，并未直接分析體內(nèi)磷酸化蛋白質(zhì)； 在分析中為了追蹤磷酸化蛋白質(zhì)和磷酸化肽段，一般都要采用放射性標(biāo)記，所以存在放射性污染的問(wèn)題； 一次只能分析一個(gè)目的蛋白質(zhì)，不適應(yīng)蛋白質(zhì)組大規(guī)模、整體分析的策略。131 現(xiàn)在技術(shù) 從蛋白質(zhì)組的規(guī)模上分析磷酸化蛋白質(zhì)，目前最常用的分離技術(shù)還是二維凝膠電泳技術(shù)。 細(xì)胞蛋白質(zhì)經(jīng)二維凝膠電泳分離后，磷酸化蛋白質(zhì)的檢測(cè)通常用32P放射性標(biāo)記放射自顯影和抗磷酸氨基酸抗體免疫反應(yīng)的方法。磷酸化蛋白質(zhì)的鑒定可以用肽質(zhì)量指紋譜方法或串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)序

36、方法；磷酸化位點(diǎn)的鑒定可用磷酸酶法、串聯(lián)質(zhì)譜側(cè)序法等。有些情況下，在質(zhì)譜分析前還需要對(duì)磷酸肽進(jìn)行富集，如金屬螯合離子親和提取法。132三. 磷酸化蛋白質(zhì)的檢測(cè)1. 32P放射性標(biāo)記法 從蛋白質(zhì)組水平檢測(cè)磷酸化蛋白質(zhì)最經(jīng)典的方法是32P放射性標(biāo)記法。也就是用放射性32P標(biāo)記的ATP處理細(xì)胞，使32P接入磷酸化蛋白質(zhì)。 133具體方法是： 培養(yǎng)待標(biāo)記的細(xì)胞至適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)期，在生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞中磷酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)達(dá)到最高峰用不含磷酸鹽的標(biāo)記培養(yǎng)液(如DMEM)替換原來(lái)的細(xì)胞培養(yǎng)液，并加入32P標(biāo)記磷酸鹽共培養(yǎng)，使細(xì)胞ATP庫(kù)與32P平衡，蛋白激酶利用被放射標(biāo)記的ATP使底物磷酸化。培養(yǎng)約2h后裂解細(xì)胞提取蛋白

37、質(zhì)，隨后進(jìn)行2D電泳分離，放射自顯影檢測(cè)磷酸化蛋白質(zhì)。134局限性對(duì)某些磷酸轉(zhuǎn)換速率較低的磷酸化蛋白質(zhì)，只能摻入少量的放射性磷酸鹽，有可能檢測(cè)不到。不同的氨基酸有不一樣的磷酸化去磷酸化代謝速率，所以摻入32P磷酸鹽的速率也是不一樣的，在不同磷酸化氨基酸之間進(jìn)行定量比較時(shí)要注意這一問(wèn)題。放射性標(biāo)記方法雖然靈敏而且直觀，但是因?yàn)榇嬖诜派湫晕廴镜膯?wèn)題，所以在相當(dāng)多的實(shí)驗(yàn)室是不適用的。135 2抗體免疫印跡檢測(cè)法用抗磷酸氨基酸抗體與磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫印跡反應(yīng)來(lái)檢出磷酸化蛋白質(zhì)也是目前較常用的磷酸化蛋白質(zhì)分析方法。 1. 抗酪氨酸磷酸鹽抗體的特異性最好 2. 抗磷酸化絲氨酸和蘇氨酸抗體的特 異性不太高

38、。136一般步驟：a) 細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品的制備 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后加裂解液提取細(xì)胞蛋白質(zhì)。裂解液中要加入一定濃度的酶抑制劑。以避免細(xì)胞裂解后發(fā)生的蛋白質(zhì)磷酸化或去磷酸化作用。137b) 一維或二維電泳分離細(xì)胞蛋白質(zhì) 按照常規(guī)SDS或雙向電泳的操作步 驟進(jìn)行蛋白質(zhì)分離。 c) 轉(zhuǎn)膜：電泳結(jié)束后將膠上蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)印到膜上，如：PVDF膜(Po1yvinylidene fluorine聚偏二氟乙烯)。 d) Western blotting 反應(yīng)轉(zhuǎn)印完成后轉(zhuǎn)印膜要進(jìn)行封閉及與抗體反應(yīng)。138 e) 蛋白質(zhì)的鑒定 為了鑒定檢測(cè)出的磷酸化蛋白質(zhì)，可以平行運(yùn)行兩塊2D膠。其中一塊作為分析膠、另一塊作為制備膠。將分

39、析膠分離的細(xì)胞蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，進(jìn)行免疫印跡反應(yīng)檢測(cè)出磷酸化蛋白質(zhì)，再染色顯出其他全部蛋白質(zhì)。制備膠分離的蛋白質(zhì)直接染色后，與分析膠轉(zhuǎn)膜后的譜圖及免疫印跡后的x膠片進(jìn)行對(duì)比，在制備膠上找出相應(yīng)的磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步分析、鑒定。 139磷酸化蛋出質(zhì)組的抗體免疫印跡分析策略樣品制備140四、蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)的分析 1磷酸肽的分離和富集 常用的分析方法是將蛋白質(zhì)酶解成肽段，找到被磷酸化修飾的肽段，并對(duì)該肽段進(jìn)行序列分析，確定發(fā)生磷酸化的氨基酸位點(diǎn)。 由于蛋白質(zhì)磷酸化的化學(xué)計(jì)量值較低，磷酸化肽段的信號(hào)豐度會(huì)比相應(yīng)未磷酸化肽段的豐度要低。因此需要分離富集磷酸肽。141(1) 反相液相色譜(R

40、P-HPLC)分離磷酸肽 經(jīng)RP-HPLC分離，肽混合物成分可以被簡(jiǎn)化，磷酸肽可根據(jù)其疏水性被分離。RP-HPLC系統(tǒng)可以與電噴霧(ESI)質(zhì)譜連接，使用HPLC-MSMS串聯(lián)系統(tǒng)，可以直接檢測(cè)和鑒定肽混合物中的磷酸肽，尤其適用于沒(méi)有被放射性標(biāo)記的分析樣品。142(2)IMAC分離富集磷酸肽 固相金屬親和色譜（immobilized metal affinity chromatography IMAC)原來(lái)用來(lái)純化含組氨酸的蛋白質(zhì)，現(xiàn)在也常被用來(lái)選擇性富集磷酸肽。 磷酸基團(tuán)與固相化的金屬離子有高親和力，可被選擇性地吸附在上面，用高pH溶液或磷酸鹽洗脫后即為富集的磷酸肽。L Limitation

41、: non-specific binding to acidic side chains (D, E). Solution: Derivatize all peptides by methyl esterification to reduce non- specific binding by carboxylate.groups.143(3) 磷酸基團(tuán)親和取代 將磷酸肽上的磷酸基團(tuán)用另一種親和配基取代，再用親和提取的方法從混合中分離富集磷酸肽。目前有2種親和配基取代方法。144 一種方法是使磷酸基團(tuán)在堿性條件下發(fā)生消除，然后由疏基乙醇取代磷酸基團(tuán)的位置，最后在疏基上通過(guò)交聯(lián)劑連接上生物素，生物

42、素取代的磷酸肽由親和素色譜柱分離。這種方法只適合于磷酸化絲氨酸和磷酸化蘇氨酸磷酸肽的取代。145生物素生物素146 另一種方法是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)在磷酸基團(tuán)上連接一個(gè)半胱胺基團(tuán)(cysteamine)，修飾的磷酸肽用固相化的碘乙酰凝膠親和提取。這種方法適合各種磷酸氨基酸的修飾。 147(二碳酸二叔丁酯) (半胱胺基)（碘乙酰凝膠）148 這兩種親和取代方法都需要進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，為了避免副反應(yīng)的影響，都需要對(duì)蛋白質(zhì)中的一些活性基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)，所以整個(gè)反應(yīng)體系還是比較復(fù)雜的。149磷酸化蛋白質(zhì)染料150151 (1) MALDI-TOF-MS結(jié)合磷酸酶水解分析法，這是蛋白質(zhì)磷酸肽鑒定的常用手段。 首先將磷酸

43、化蛋白用蛋白水解酶水解為肽片段，再用磷酸(酯)酶處理肽段，使肽段脫磷酸。磷酸化氨基酸殘基脫磷酸后，肽段失去了一個(gè)HPO3分子，相應(yīng)肽段的質(zhì)量減少80Da用質(zhì)譜分析磷酸酶作用前后肽質(zhì)量譜的差異，尋找質(zhì)量數(shù)減少80Da或80倍數(shù)的肽段。這樣不僅可以用PMF的方法鑒定蛋白質(zhì)，又可基本確定發(fā)生磷酸化的肽段及磷酸化的數(shù)目。肽譜分析最常用的質(zhì)譜儀是MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀。2磷酸肽的識(shí)別152圖7-4是這一方法的簡(jiǎn)要示意圖。153(2) PSD-MALDI-MS分析 源后衰變(PSD)是指發(fā)生在源內(nèi)離子化之后的分子裂解，也就是MALDI-TOF-MS離子源內(nèi)產(chǎn)生的離子在真空無(wú)電場(chǎng)飛行管道飛行過(guò)程中發(fā)

44、生結(jié)構(gòu)斷裂，丟失一個(gè)中性分子后產(chǎn)生了碎片離子。由于是在無(wú)電場(chǎng)區(qū)飛行,所以碎片離子都具有與其前體離子相同的飛行速度，但由于質(zhì)量小，所以其動(dòng)能比前體離子的動(dòng)能小，稱(chēng)為亞穩(wěn)離子。由于前體離子和碎片離子具有相同的表觀質(zhì)荷比，飛行速度也一樣，所以將同時(shí)到達(dá)線性檢測(cè)器在線性TOF分析器中，不能分辨碎片離子與前體離子。而碎片離子與前體離子存在動(dòng)能差異，所以在具有反射器的MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀上可以通過(guò)改變反射器電壓分析到碎片離子。154 前述的固相金屬離子親和色譜法也是選擇性檢測(cè)磷酸肽的方法。它有一個(gè)好處是可以直接用MALDI-TOF-MS分析，即直接用此IMAC填料與肽混合物共孵育，使磷酸肽與色譜

45、填料結(jié)合，離心后填料與磷酸肽共同沉淀在底部，棄上清，將沉淀清洗幾遍后，可直接與MALDI-MS的基質(zhì)溶液混合并進(jìn)行質(zhì)譜分析?；蛘呤褂肐MAC柱將磷酸肽富集洗脫后質(zhì)譜分析。通過(guò)比較IMAC處理前后肽譜的變化找到磷酸肽。155156用MALDI-TOF-MS分析ZipTip處理前后的肽段m/z 2061.933到48位，序列為FQSEEQQQTEDELDK，該肽段質(zhì)荷比的理論值為mz 1981.9，但是在其中的第35位絲氨酸殘基上有一個(gè)磷酸基團(tuán)，使該肽段的質(zhì)量數(shù)增加了80而成為質(zhì)荷比為mz 2061.9的峰157(3) 磷酸化氨基酸位點(diǎn)的確定 要確定其磷酸化位點(diǎn)，需要用串聯(lián)質(zhì)譜產(chǎn)物離子掃描模式（p

46、roduct ion scanning)對(duì)磷酸肽進(jìn)行序列分析。 MS/MS spectraTrypsinGTVQPASNFNDDSSQGLGTDEGSIVLTQRGTVQPASNFNDDSSQGLGTDEGSIVLTQRSNAQAVEGAGTDESTLIELMATRILVSLALGNRDEGPENLTQAVVAETLNKLLALXGGDDFKLMAAG158 將選定的磷酸肽在碰撞誘導(dǎo)解離(CID)室打碎。檢測(cè)其產(chǎn)生的全部碎片離子，根據(jù)碎片離子質(zhì)量數(shù)推斷肽段序列和磷酸化位點(diǎn)。磷酸肽在CID室碰撞誘導(dǎo)解離易產(chǎn)生丟失80 Da(HPO3)和98Da(H3PO4)的子離子，此離子峰的豐度很高，往往在整

47、個(gè)碎片離子譜中占據(jù)主導(dǎo)地位。一般較短的磷酸肽比較長(zhǎng)的磷酸肽更易于丟失磷酸159磷酸肽的串聯(lián)質(zhì)譜圖例160五、蛋白質(zhì)磷酸化的定量分析 蛋白質(zhì)磷酸化的定量問(wèn)題，即磷酸化蛋白質(zhì)與其相應(yīng)非磷酸化蛋白質(zhì)的比例，也是蛋白質(zhì)組研究非常關(guān)心的問(wèn)題。 下面介紹一種穩(wěn)定同性素標(biāo)記磷酸化蛋白質(zhì)定量的方法。161 15N穩(wěn)定同位素標(biāo)記法 將兩種細(xì)胞在不同的培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)，一種為正常培養(yǎng)基，另一種培養(yǎng)基的氮源有15N提供，混合兩種培養(yǎng)物，提取細(xì)胞蛋白。分離目標(biāo)蛋白質(zhì)(磷酸化蛋白)后，酶解，提取肽段，用質(zhì)譜分析。因?yàn)閮煞N細(xì)胞蛋白分別摻入14N和15N ，所以在質(zhì)譜圖中，每個(gè)水解肽段表現(xiàn)為一對(duì)峰。 14N/15N的同位素

48、豐度比可以體現(xiàn)出兩種細(xì)胞來(lái)源蛋白質(zhì)表達(dá)量的相對(duì)水平。162163六、小結(jié) 目前，現(xiàn)有的磷酸化蛋白質(zhì)研究手段還不能滿足研究的需要，尤其是對(duì)微量磷酸化蛋白的富集、鑒定、磷酸化的定量，還需要更持異地富集磷酸化蛋白和磷酸肽的方法。磷酸化修飾是蛋白質(zhì)組研究中一個(gè)非常重要的內(nèi)容，蛋白質(zhì)磷酸化與其功能密切相關(guān)，所以磷酸化蛋白質(zhì)組研究都應(yīng)在一定的功能環(huán)境下研究磷酸化蛋白，例如在某一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路內(nèi)或在某種外界刺激下細(xì)胞蛋白質(zhì)磷酸化的變化。164第二節(jié) 糖基化蛋白質(zhì)的鑒定 糖蛋白在各種生命現(xiàn)象中起著重要的作用。如：細(xì)胞識(shí)別、信號(hào)傳導(dǎo)、免疫與應(yīng)答、分化與反分化等等，都與存在于糖蛋白中的糖鏈的結(jié)構(gòu)與作用有關(guān)。自19世

49、紀(jì)末人們開(kāi)始提出糖蛋白的概念并加以研究以來(lái)，先后明確了其糖基結(jié)構(gòu)、成分、部分生物學(xué)功能，以及認(rèn)識(shí)了糖蛋白中的糖苷鍵類(lèi)型。165 隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，也出現(xiàn)了多種頗具療效的由真核細(xì)胞表達(dá)的糖蛋白類(lèi)藥物，如干擾素(IFN)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)等。由于糖蛋白本身的微不均一性，使得其結(jié)構(gòu)、位點(diǎn)的差異直接影響到療效。雖然對(duì)重組糖蛋白的質(zhì)量或結(jié)構(gòu)均一性的控制在某些方面是可行的，但這些手段都不足以保證產(chǎn)生單一的糖蛋白產(chǎn)品。因此無(wú)論是自然的還是重組的糖蛋白，其結(jié)構(gòu)鑒定就成為一個(gè)十分重要的課題。166 傳統(tǒng)的糖蛋白分析方法 將糖蛋白中的糖鏈及蛋白分開(kāi)來(lái)研究，即利用化學(xué)方法如肼解法、氧化還原法或衍生物法

50、先將糖鏈釋放，然后用層析法，如Sephadex (G-25或G-50）進(jìn)行凝膠層析分離，收集含糖組分，或用SDS、HPLC等傳統(tǒng)的分離分析方法，粗略地觀察糖蛋白的分子質(zhì)量。應(yīng)用化學(xué)方法降解、還原多糖研究糖鏈結(jié)構(gòu)的方法雖具有普遍性，但反應(yīng)周期長(zhǎng)(幾小時(shí)到幾天不等)，反應(yīng)條件難以控制，對(duì)糖蛋白的需要量非常大，而且并不是所有的糖蛋白都能適應(yīng)這種高溫、堿性的實(shí)驗(yàn)條件而不被降解.167168 現(xiàn)代分析技術(shù) 生物質(zhì)譜法：主要用MALDI-TOF-MS 和ESI-MS等，可以直接分析糖蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量、糖基化位點(diǎn)、氨基酸序列以及糖鏈結(jié)構(gòu)等。169一、糖蛋白的結(jié)構(gòu)特征 糖蛋白是一類(lèi)由糖類(lèi)和蛋白質(zhì)以共價(jià)鍵連接

51、而成的結(jié)合蛋白，修飾范圍從蛋白質(zhì)上連接單糖到密集、復(fù)雜、由側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的多糖，以及具有復(fù)雜的氨基葡聚糖側(cè)鏈的蛋白多糖。 蛋白與多糖相連有兩種最基本的形式: 1. N-糖苷鍵 2. O-糖苷鍵170天冬酰胺N-糖苷鍵b- N-乙酰氨基糖苷鍵Asn經(jīng)常處于Asn-x-Thr/Ser(x是除Pro以外的任何氨基酸)的序列子中，我們稱(chēng)其為天冬酰胺序列子，只有處于該序列子中的Asn才會(huì)發(fā)生糖基化。171N-糖鏈常具有三甘露糖五糖核心172O-糖苷鍵它最主要是由N-乙酰氨基糖苷鍵的異頭碳與Ser/Thr中的羥基縮水而成，173二 生物質(zhì)譜技術(shù)鑒定糖蛋白 糖含量 糖基化位點(diǎn) 糖苷鍵類(lèi)型是糖蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo)

52、。174糖含量 糖苷內(nèi)切酶可以切斷糖鏈與蛋白鏈間連接的糖苷鍵，因此用糖苷內(nèi)切酶將糖鏈切除，將反應(yīng)前后的質(zhì)譜圖進(jìn)行比較，就能直接表述糖鏈的平均質(zhì)量。而糖蛋白的平均糖含量可由據(jù)鏈的平均質(zhì)量占糖蛋白平均相對(duì)分子質(zhì)量的百分比來(lái)表示。175糖基化位點(diǎn) 在糖蛋白中，可以有一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)，采用蛋白酶酶解與糖苷內(nèi)切酶酶解相結(jié)合的方法，先用蛋白酶將糖蛋白酶解成含有和不含有糖鏈的肽片段，獲得糖蛋白的肽質(zhì)量指紋譜，再用糖苷內(nèi)切酶將糖鏈切除，其肽質(zhì)量指紋譜將發(fā)生變化，原含糖肽段的質(zhì)量由于糖鏈的丟失在質(zhì)譜圖上發(fā)生了位移，通過(guò)網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)檢索可以得到位移肽片段的氨基酸序列，而在這個(gè)序列中必含有糖基化位點(diǎn)。由此可以確定

53、糖蛋白分子中的糖基化位點(diǎn)。應(yīng)用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)肽質(zhì)量指紋譜中的肽片段進(jìn)行分析，可以得到蛋白某中間片段的序列。對(duì)已知蛋白，依靠此序列判斷其歸屬，從而對(duì)糖蛋白的氨基酸序列加以證實(shí)。176糖苷鍵類(lèi)型 凝集素是一類(lèi)糖結(jié)合蛋白，能專(zhuān)一地識(shí)別某一特定結(jié)構(gòu)的單糖或寡糖中特定的糖基序列而與之結(jié)合，它不但可用于寡糖或糖復(fù)合物的分離純化，也可用于糖鏈的結(jié)構(gòu)分析，因此，用凝集素直接提取糖肽段可以同時(shí)起到富集、濃縮以及分離的多重效果。177糖蛋白還原、烷基化、蛋白酶解糖苷內(nèi)切酶糖含量MALDI-TOF-MS相對(duì)分子量MALDI-TOF-MS糖基化位點(diǎn)凝集素提取糖肽片斷ESI串聯(lián)質(zhì)譜氨基酸序列糖基化蛋白鑒定的一般

54、思路1781. MALDI-TOF-MS的應(yīng)用 例：核糖核酸酶B的MALDI-TOF-MS分析 核糖核酸酶B由124個(gè)氨基酸組成，在34位Asn處連接有一個(gè)高甘露糖型N-糖鏈。179180 糖蛋白的平均相對(duì)分子質(zhì)量 由于糖鏈的微不均一性與普通蛋白質(zhì)不同，其分子離子峰在MALDI-TOF-MF質(zhì)譜圖上表現(xiàn)為一簇峰G+，各峰之間約相差個(gè)糖基同時(shí)還出現(xiàn)了雙電荷峰G+2， 其中T+及T+2為樣品中含少量不帶糖鏈的蛋白峰及其雙電荷峰G+五重峰的測(cè)定值，可以直接計(jì)算出糖蛋白的平均相對(duì)分子質(zhì)量(X=Xin)。181平均糖含量 內(nèi)糖苷鍵酶F切斷N-糖鏈五糖核心最內(nèi)側(cè)的G1cNAc-G1cNAc糖苷鍵，得到含一

55、個(gè)GlcNAc(M=203Da)的肽鏈，從中減GlcNAc, 可以計(jì)算出準(zhǔn)確的肽鏈相對(duì)分子質(zhì)量。肽鏈相對(duì)分子質(zhì)量與糖蛋白平均相對(duì)分子質(zhì)量之差為糖鏈的平均相對(duì)分子質(zhì)量，進(jìn)而求得糖蛋白的平均糖含量。182183 糖基化類(lèi)型及糖基位點(diǎn)的確定 糖鏈和肽鏈中的氨基酸殘基通過(guò)共價(jià)鍵連接，用生物質(zhì)譜的方法測(cè)定糖基化位點(diǎn)，一般是通過(guò)蛋白酶切與糖苷內(nèi)切酶切相結(jié)合的辦法，尋找質(zhì)譜圖上的峰位移，從位移峰的肽序列中，尋找出可能連接糖鏈的氨基酸，從而確定糖基化位點(diǎn)。184185 其中含有N糖鏈持異連接位點(diǎn)天冬酰胺序列于(Asn-x-Thr/Ser)，由此可以確定了34位Asn為糖基化位點(diǎn)186 2液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜

56、 串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定糖蛋白的氨基酸序列 對(duì)于已知蛋白，用串聯(lián)質(zhì)譜的方法，可以測(cè)定蛋白質(zhì)氨基酸序列中間某一片段，從而判斷其序列與理論序列是否一致，這一方法完全可以被延伸至糖蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析中來(lái)，可以將糖蛋白酶切后的肽段，包括含糖肽段，在串聯(lián)質(zhì)譜上直接選擇離子進(jìn)行碰撞活化，從而分析選擇肽段的氨其酸序列，得到糖蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)信息。187 糖鏈結(jié)構(gòu)的分析 隨著電噴霧申聯(lián)質(zhì)譜儀器的發(fā)展，目前最直接的分析糖鏈結(jié)構(gòu)的方法是應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜的母離子掃描(parent ion scan)技術(shù)，選擇特定的糖鏈離子經(jīng)碰撞活化室用惰性氣體將其打碎，從而推斷糖鏈結(jié)構(gòu)。1881893.凝集素在糖蛋白分析中的應(yīng)用 凝集素不但可用于

57、寡糖或糖復(fù)合物的分離純化，也可用于糖鏈的結(jié)構(gòu)分析，比如：伴刀豆球蛋白(ConA)對(duì)高甘露糖型N-糖鏈有專(zhuān)一性；麥胚凝集素(WGA)卻對(duì)雜合型N-糖鏈有專(zhuān)一性；而親和核心巖藻糖類(lèi)糖鏈應(yīng)選用兵豆凝集素等。以核糖核酸酶B為例，用比ConA提取其高甘露糖型糖鏈。190191六、小結(jié) 蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，包括糖基化，對(duì)于發(fā)生在生物學(xué)體系中的新陳代謝具有控制作用，多糖結(jié)構(gòu)中存在著可利用的廣泛的差異性這些差異性對(duì)于新陳代謝的調(diào)節(jié)細(xì)致入微。2D展示的糖蛋白陣列為我們提供了一個(gè)譜圖，由它我們可以探索疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的變化。重組糖蛋白由于其能夠提供足夠的樣品量應(yīng)用質(zhì)譜以及相關(guān)技術(shù)的分析工具已經(jīng)能夠較完善地鑒定

58、其結(jié)構(gòu)。192蛋白質(zhì)合成后需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜機(jī)制，定向輸送到最終發(fā)揮生物功能的細(xì)胞靶部位，這一過(guò)程稱(chēng)為蛋白質(zhì)的靶向輸送。 四、蛋白質(zhì)合成后的靶向輸送蛋白質(zhì)的靶向輸送（protein targeting）193所有靶向輸送的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中存在分選信號(hào)，主要為N末端特異氨基酸序列，可引導(dǎo)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞的適當(dāng)靶部位，這一序列稱(chēng)為信號(hào)序列 。 信號(hào)序列(signal sequence)194靶向輸送蛋白信號(hào)序列或成分分泌蛋白信號(hào)肽內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔蛋白信號(hào)肽，C端-Lys-Asp-Glu-Leu-COO-(KDEL序列)線粒體蛋白N端靶向序列（2035氨基酸殘基）核蛋白核定位序列（-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-，SV40 T抗原）過(guò)氧化體蛋白-Ser-Lys-Leu-（PST序列）溶酶體蛋白Man-6-P（甘露糖-6-磷酸）靶向輸送蛋白的信號(hào)序列或成分 195（一）分泌蛋白的靶向輸送真核細(xì)胞分泌蛋白等前體合成后靶向輸送過(guò)程首先要進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，再分別被包裝成分泌小泡而分泌出細(xì)胞。 信號(hào)肽(signal peptide) 各種新生分泌蛋白的N端有保守的氨基酸序列稱(chēng)信號(hào)肽。 196信號(hào)肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)N端側(cè)堿性區(qū)