干細(xì)胞治療糖尿病國(guó)家人類(lèi)基因組轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室

1、干細(xì)胞治療糖尿病現(xiàn)狀與展望國(guó)家人類(lèi)基因組轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心 1內(nèi) 容1.糖尿病分型、發(fā)病機(jī)制及治療現(xiàn)狀2.干細(xì)胞獨(dú)特的生物學(xué)特性及分類(lèi)3.干細(xì)胞在糖尿病治療領(lǐng)域的應(yīng)用4.存在的問(wèn)題及展望21型糖尿病發(fā)病機(jī)制遺傳環(huán)境胰島素缺乏1型糖尿病自身免疫性抗體產(chǎn)生 細(xì)胞破壞廖二元等.內(nèi)分泌學(xué),2004,1436-143831型糖尿病的特征4遺傳（ 細(xì)胞缺陷）2型糖尿病發(fā)病機(jī)制環(huán)境因素（肥胖、生活方式等）2型糖尿病胰島素抵抗胰島素分泌不足胰島素相對(duì)缺乏廖二元等.內(nèi)分泌學(xué),2004,1438-144652型糖尿病的特征多于成年尤其是45歲以上起病多數(shù)起病緩慢，隱匿血漿胰島素相對(duì)性降低胰島素的敏感性降低可伴全身肥胖及

2、體脂分布異常 （腹型肥胖）。常有家族史，但遺傳因素復(fù)雜。6糖尿病的自然病程環(huán)境因素病毒感染自身免疫遺傳因素環(huán)境因素肥胖營(yíng)養(yǎng)衛(wèi)生體力活動(dòng)糖尿病起病 高血糖及相關(guān)臨床表現(xiàn) 并發(fā)癥及相關(guān)表現(xiàn)視網(wǎng)膜病變腎病變動(dòng)脈粥樣硬化神經(jīng)病變失明腎功能衰竭心肌梗死卒中截肢（死亡）致殘劉新民主編.實(shí)用內(nèi)分泌學(xué)（第3版）.人民軍醫(yī)出版社.P1221，圖31-11型糖尿病2型糖尿?。ㄍ砥冢┨悄虿∏捌?糖尿病期 糖尿病并發(fā)癥期 糖尿病致死 或致殘期71.皮下注射胰島素 1 型及部分2 型 療效果不理想，難以阻止并發(fā)癥發(fā)生及發(fā)展2.植入胰島細(xì)胞或其替代物 已喪失胰島細(xì)胞功能 *供體細(xì)胞來(lái)源不足 *免疫排斥反應(yīng)（移植后患者終身

3、服用免疫抑制劑，體內(nèi)功能性胰島細(xì)胞可能受到胰島自身免疫反應(yīng)的攻擊，伴促炎性細(xì)胞因子的出現(xiàn)、胰島細(xì)胞凋亡率增加） *移植后患者五年內(nèi)的病情緩解率小于10% 3.干細(xì)胞 胰島細(xì)胞替代物 具有極強(qiáng)的自我更新能力和多向分化潛能的細(xì)胞治療現(xiàn)狀8干細(xì)胞生物醫(yī)學(xué)第二次革命Science 、Time于1999年、2000年、2007年，2008年多次將干細(xì)胞技術(shù)評(píng)為世界十大科學(xué)成就之一。9胚胎干細(xì)胞iPS干細(xì)胞成體干細(xì)胞ISSCR關(guān)于干細(xì)胞定義自我復(fù)制多向分化102、替代和修復(fù)死亡或損傷的細(xì)胞1、干細(xì)胞通過(guò)血液循環(huán)植入， 或直接植入受損的組織3、激發(fā)自身體內(nèi)干細(xì)胞來(lái)修復(fù)干細(xì)胞治療ISSCR關(guān)于干細(xì)胞技術(shù)定義1

4、1干細(xì)胞種類(lèi)iPS 12 (1)胚胎干細(xì)胞干細(xì)胞根據(jù)起源分類(lèi)(2)成體干細(xì)胞具有全能性，能分化為體內(nèi)所有的組織和器官，如血液細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等分化潛能較弱，通常認(rèn)為新生的干細(xì)胞一旦被確定為某種細(xì)胞類(lèi)型，就會(huì)受到某些特定編碼序列的調(diào)控，只能分化成特定的組織細(xì)胞。包括胰腺干細(xì)胞、造血干細(xì)胞和其他種子細(xì)胞。13干細(xì)胞的功能性分類(lèi)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)細(xì)胞肌肉脂肪細(xì)胞上皮細(xì)胞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞心肌細(xì)胞1、全能干細(xì)胞2、萬(wàn)能干細(xì)胞3、多功能干細(xì)胞4、單功能干細(xì)胞14干細(xì)胞移植的生物學(xué)特性（1）趨化性（2）歸巢性（3）遷移性（4）分化性（5）遠(yuǎn)合性 （6）抗原性15干細(xì)胞移植治療疾病的原理1、替代和修復(fù)

5、死亡和受損傷的細(xì)胞2、激活休眠和處于抑制狀態(tài)的細(xì)胞3、旁分泌作用（分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、抗凋亡因子等）4、免疫調(diào)控機(jī)制5、促進(jìn)細(xì)胞間電能力、電傳導(dǎo)恢復(fù)（如間充質(zhì)干細(xì)胞分泌連接蛋白幫助細(xì)胞間連接、促進(jìn)離子通道的開(kāi)放等）16*來(lái)源充足*低毒性(或無(wú)毒性) *一次給藥，長(zhǎng)期有效*自身干細(xì)胞移植還可避免產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)和相關(guān)的倫理學(xué)爭(zhēng)論等。最好的免疫治療和基因治療栽體，是各類(lèi)疾病細(xì)胞治療和基因治療的首選靶細(xì)胞干 細(xì) 胞 技 術(shù) 的 優(yōu) 勢(shì)17成體干細(xì)胞治療糖尿病研究概述具有亞全能分化潛能，在特定的體內(nèi)外環(huán)境下，能夠誘導(dǎo)分化成為多種組織細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞MSC具有巨大的體外擴(kuò)增潛能，易于分離培養(yǎng)，獲取方便；

6、在適當(dāng)?shù)捏w外微環(huán)境的誘導(dǎo)下，具有多向分化潛能。一定數(shù)量的MSC通過(guò)血管途徑遷移到胰腺組織中，并在胰腺組織特定的微環(huán)境誘導(dǎo)下分化增殖為胰島樣細(xì)胞，替代損傷的胰島細(xì)胞分泌胰島素；同時(shí)MSC 還具有強(qiáng)大的細(xì)胞因子分泌和免疫調(diào)節(jié)功能，使損傷或部分損傷的胰島細(xì)胞修復(fù)。 18胰腺干細(xì)胞 具有很強(qiáng)的自我更新能力和分化潛能，能誘導(dǎo)分化為含有、和胰島細(xì)胞, 將其移入糖尿病模型鼠后,能夠逆轉(zhuǎn)糖尿病病情，從而為治療型糖尿病提供了新的胰島資源。W eir 等分離人胰管細(xì)胞培養(yǎng)，成功分離出了胰腺干細(xì)胞，并將其分化為既含胰管細(xì)胞又含胰島細(xì)胞的細(xì)胞群，后者能分泌胰島素，其分泌量隨著濃度的增高而增多，用免疫組化等方法證明了這

7、些細(xì)胞群含有胰島的所有細(xì)胞類(lèi)型。美國(guó)科學(xué)家從尚未發(fā)病的糖尿病小鼠的胰島管中分離出胰島干細(xì)胞，并在體外誘導(dǎo)分化成能產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞。移植實(shí)驗(yàn)表明，接受移植的糖尿病鼠血糖濃度控制良好，而對(duì)照組小鼠則死于糖尿病。這為干細(xì)胞治療糖尿病奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。19S hah 等將胰島素原基因通過(guò)腺病毒轉(zhuǎn)染造血干細(xì)胞, 并將這些干細(xì)胞靜脈注射到糖尿病大鼠中, 使其血糖水平恢復(fù)正常，并在多臟器組織中有前胰島素原基因表達(dá)，說(shuō)明注射前胰島素原基因轉(zhuǎn)染的造血干細(xì)胞可以短期使糖尿病病情好轉(zhuǎn)。 K ang 等將轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓移植入糖尿病鼠體內(nèi)，通過(guò)骨髓擴(kuò)增，有效阻止了糖尿病復(fù)發(fā)，并從同種基因供體鼠來(lái)源的胰島和造血細(xì)胞注入糖尿

8、病鼠，一半的糖尿病鼠好轉(zhuǎn)，因此同種骨髓移植可以治療自身糖尿病, 而這些骨髓產(chǎn)生細(xì)胞能夠分化為胰島功能細(xì)胞。造血干細(xì)胞20其他種子細(xì)胞Blyszczuk 等證實(shí)神經(jīng)干細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞通過(guò)化學(xué)誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)基因的方法形成分泌胰島素的細(xì)胞。B urns 等從胎鼠腦中分離神經(jīng)干細(xì)胞，體外擴(kuò)增并誘導(dǎo)分化表達(dá)前胰島素原m R N A , 顯示了典型的胰腺細(xì)胞的功能應(yīng)答及新陳代謝中葡萄糖依賴(lài)性的增加，說(shuō)明神經(jīng)干細(xì)胞有分化成細(xì)胞來(lái)治療糖尿病的潛能。C hen也證實(shí)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的胰島樣功能細(xì)胞能夠作為一種新的干細(xì)胞治療方法在臨床上治療糖尿病。Lu 等將人胰島素基因通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，結(jié)果顯

9、示這些體外培養(yǎng)的細(xì)胞能夠穩(wěn)定的分泌胰島素，并且持續(xù)3 周以上。21干細(xì)胞在1型糖尿病中應(yīng)用22理想的細(xì)胞替代物必需具有以下特點(diǎn): 1. 表達(dá)葡萄糖激酶和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子2 ; 2. 低表達(dá)高親和力的己糖激酶； 3. 表達(dá)激素原轉(zhuǎn)換酶PC2 、PC3 ,能將胰島素原有效地加 工成胰島素; 4. 能將胰島素釋放入細(xì)胞外的分泌系統(tǒng)；綜上所述,由干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的細(xì)胞是糖尿病細(xì)胞治療的最佳種子細(xì)胞。23目前國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀 干細(xì)胞獨(dú)特的生物學(xué)特性、極強(qiáng)的自我更新能力及多向分化潛能無(wú)疑是獲得大量胰島細(xì)胞的最佳種子細(xì)胞?？蓸O大地解決胰島細(xì)胞來(lái)源不足的問(wèn)題。近幾年，胰島細(xì)胞移植治療糖尿病，使一些人能脫離胰島素治療，

10、血糖控制時(shí)間達(dá)1 年以上。遺憾的是，胰島細(xì)胞移植仍面臨兩大難題：供者來(lái)源不足、嚴(yán)重的免疫排斥反應(yīng)等。24干細(xì)胞治療糖尿病優(yōu)勢(shì)一 干細(xì)胞是基因治療的最理想靶細(xì)胞。對(duì)于糖尿病患者來(lái)說(shuō)，僅輸入足夠數(shù)量的胰島細(xì)胞并不能達(dá)到治療效果。來(lái)源于自體干細(xì)胞的胰島細(xì)胞在植入1 型糖尿病患者體內(nèi)后，仍會(huì)受到免疫攻擊，而如果采用同種異體的細(xì)胞進(jìn)行移植也同樣會(huì)遭受免疫排斥反應(yīng)。對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行基因修飾,可避免免疫排斥反應(yīng)的攻擊。25干細(xì)胞治療糖尿病優(yōu)勢(shì)二 干細(xì)胞的另一優(yōu)勢(shì)在于其分化的胰島細(xì)胞可以發(fā)揮對(duì)血糖的生理性調(diào)節(jié)作用。通過(guò)對(duì)非細(xì)胞(如肝細(xì)胞、垂體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等) 進(jìn)行基因修飾，雖然可以使它們分泌胰島素,但這些細(xì)胞

11、并不能精確的模擬細(xì)胞發(fā)揮生理性的調(diào)節(jié)作用。 26機(jī)理探討一27機(jī)理探討二28機(jī)理探討三29用于臨床的干細(xì)胞來(lái)源自體外周血自體骨髓胎兒附屬物（臍血、臍帶、羊膜等）30自體骨髓干細(xì)胞移植在無(wú)菌條件下抽取糖尿病患者自身的骨髓血混合液，通過(guò)分離、純化等過(guò)程，將骨髓干細(xì)胞定向培養(yǎng)、分化成能夠產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞，制成含有足夠數(shù)量干細(xì)胞的細(xì)胞懸液，再注入患者體內(nèi)。 自體外周血干細(xì)胞移植予以糖尿病患者粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）注射治療四五天，以動(dòng)員細(xì)胞產(chǎn)生了某種變化，通過(guò)誘發(fā)使骨髓干細(xì)胞進(jìn)入外周血，使其在外周血中達(dá)到一定數(shù)量后，再應(yīng)用血細(xì)胞分離機(jī)分離出所需干細(xì)胞進(jìn)行移植。 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植31臍帶間充

12、質(zhì)干細(xì)胞Whartons 膠*在細(xì)胞增殖方面優(yōu)于骨髓干細(xì)胞移植，能形成更大的胰島細(xì)胞團(tuán)塊*在表達(dá)胰島特異性標(biāo)致C肽方面較分化后的骨髓干細(xì)胞移植高72%*臍帶的組織抗原性較弱，不易被受體的免疫系統(tǒng)所識(shí)別 32適 應(yīng) 證1型或部分2型糖尿病患者。年齡1865歲。糖尿病病程3年以?xún)?nèi)。應(yīng)用胰島素治療血糖控制尚可者。依從性好。 33干細(xì)胞治療糖尿病療效判斷標(biāo)準(zhǔn)不需要胰島素維持健康狀態(tài)。胰島素的用量減少低血糖發(fā)生概率降低。34療效評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)觀(guān)察移植前后胰島素注射劑量、2、1、 、2 、胰島自身抗體(、 2、)等變化。35國(guó)外干細(xì)胞研究現(xiàn)狀 * 巴西圣保羅大學(xué)治療15例1型糖尿病患者，結(jié)果14例停用胰島

13、素，雖然其中2例在1年后恢復(fù)胰島素治療，但胰島素用量仍顯著降低。但這也是目前已知的、全球最大的、隨訪(fǎng)時(shí)間最長(zhǎng)的關(guān)于干細(xì)胞治療糖尿病的研究數(shù)據(jù)。 * 2009年4月14日美國(guó)醫(yī)學(xué)會(huì)雜志（JAMA）發(fā)表了一項(xiàng)巴西最新研究結(jié)果，新診斷1型糖尿病患者（23例）接受平均29.8周的造血干細(xì)胞移植（HSCT）治療后，C肽水平顯著升高，大多數(shù)患者成功擺脫了對(duì)胰島素的依賴(lài) 36結(jié) 果2008-2011年共進(jìn)行120例糖尿病患者的臨床研究，移植前與移植后皮下胰島素(諾和靈、諾和靈)注射總量平均為56,85%患者于移植后第14日開(kāi)始減量,移植后第30天胰島素30。18例病人停用胰島素，時(shí)間超過(guò)24個(gè)月。37不良反

14、應(yīng)治療過(guò)程中環(huán)磷酰胺處理階段,患者出現(xiàn)惡心、嘔吐等癥狀,預(yù)處理后第5日癥狀消失。干細(xì)胞回輸過(guò)程未出現(xiàn)發(fā)熱。38南京鼓樓醫(yī)院患者男,21歲,因“口干、多飲、多尿伴消瘦周,神志不清3小時(shí)”于2006年6月18日入院。 診斷1型糖尿病國(guó)內(nèi)第一例沈山梅李莉蓉周士海馮文煥許景艷歐陽(yáng)建朱大龍.自體造血干細(xì)胞移植治療1型糖尿病附一例報(bào)告. 中國(guó)糖尿病雜志2008年第16卷第9期39治療基本過(guò)程(1)干細(xì)胞動(dòng)員:化療外加粒細(xì)胞集落刺激因子( );(2)干細(xì)胞采集:采集足量的干細(xì)胞,確保34+細(xì)胞總量2106/;(3)干細(xì)胞凍存:加入細(xì)胞凍存液后進(jìn)行深低溫凍存(-80);(4)干細(xì)胞預(yù)處理方案:選用+;(5)干

15、細(xì)胞回輸:經(jīng)靜脈回輸入體內(nèi);(6)支持治療:預(yù)處理1周后予 協(xié)助造血重建。40結(jié)果移植前與移植后皮下胰島素(諾和靈、諾和靈)注射總量均為38,于移植后第14日開(kāi)始減量,移植后第27日停止注射胰島素。胰島素停用時(shí)間已超過(guò)15個(gè)月。41隨 訪(fǎng)血糖控制良好(4 25 7/,27 18 8/);移植后1、5、8、13個(gè)月1分別為4 1%、6 9%、5 6%、5 4%, 水平均較移植前明顯增加(表1)。移植后第5個(gè)月復(fù)查、 及 2, 2仍為陽(yáng)性,其余為陰性。42治療后的病情進(jìn)展治療過(guò)程中及治療后體重穩(wěn)定,于干細(xì)胞預(yù)處理階段,患者出現(xiàn)惡心、嘔吐、脫發(fā)等癥狀,預(yù)處理后第5日癥狀消失。于干細(xì)胞回輸后第8日出現(xiàn)

16、發(fā)熱(體溫38 839 3),5天后體溫降至正常。未發(fā)生嚴(yán)重的骨髓抑制、出血性膀胱炎、間質(zhì)性肺炎等。移植后第15日,正常造血功能重建?；颊唧w力已恢復(fù)正常。43第三軍醫(yī)大學(xué)在西南地區(qū)首家采用自體骨髓干細(xì)胞胰腺定向移植治療糖尿病,該患者為接受該方法治療的第1例。 隆敏,鄭宏庭,童強(qiáng),嚴(yán)俊,段煉,楊閻峙,徐梓輝。自體骨髓干細(xì)胞胰腺定向移植治療糖尿病1例 .第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010;32（6）：524.44干細(xì)胞治療方法移植前3d預(yù)先皮下注射集落刺激因子動(dòng)員骨髓。手術(shù)當(dāng)日采取患者400ml骨髓,并立即在層流實(shí)驗(yàn)室行骨髓單個(gè)核細(xì)胞分離,患者入介入手術(shù)室,尋找到供應(yīng)胰腺的胰背動(dòng)脈后,將骨髓干細(xì)胞緩慢均勻

17、注射入胰背動(dòng)脈。 45結(jié) 果 1術(shù)后隨訪(fǎng)發(fā)現(xiàn)在空腹血糖6mmol/L、餐后血糖8mmol/L的情況下,術(shù)后1月胰島素泵基礎(chǔ)量減少至16U,三餐前各3U,日胰島素總量減少了39.02%,術(shù)后3個(gè)月基礎(chǔ)量減少至11U,三餐前各2U,日胰島素總量減少了58.54%,其術(shù)后3個(gè)月內(nèi)胰島素劑量大幅度減少了58.54%,有望完全停用胰島素46結(jié) 果 2復(fù)查GHbA1c為7.7%。復(fù)查饅頭餐試驗(yàn),血糖分別為7.9、7.61、9.65、17.20、16.13mmol/L;胰島素分別為2.9、2.22、3.35、10.83、9.52U/ml;C 肽分別為1. 73、1.60、1.84、3.51、4.2ng/ml。 47解放軍第455醫(yī)院景華,陳文怡,李克良,甄二真(解放軍第455醫(yī)院,上海200052).自體造血干細(xì)胞回輸治療型糖尿病2例東南國(guó)防醫(yī)藥48于4月15日開(kāi)始皮下注射格拉諾賽特行干細(xì)胞動(dòng)員,4月20日外周血CD34陽(yáng)性報(bào)告為1.72%,行自體外周血造血干細(xì)胞采集,過(guò)程順利?？诜h(huán)孢素A及ATG(20mg/日,連續(xù)5天)治療后,回輸自體造血干細(xì)胞(具體過(guò)程同前)。49出院時(shí)復(fù)查C肽:空腹1.94ng/ml,餐后2小時(shí)2.9ng/ml?；剌敽?0天停用胰島素,血糖控制在4.55.9mmol/L之間,血像正常。50隨訪(fǎng)4月,C肽:空腹1.14ng