【生物課件】 哺乳動(dòng)物克隆技術(shù)(08-08-25)

1、第七章 哺乳動(dòng)物克隆技術(shù) 隨著1997年2月Nature雜志報(bào)道英國Roslin研究所等人創(chuàng)造的克隆羊多莉(Dolly)誕生，生物工程掀開了新的一頁?？寺?clone)一詞原意為無性繁殖系，在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中早有使用，細(xì)胞克隆是指由一個(gè)細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞分裂而產(chǎn)生出的一群細(xì)胞，而動(dòng)物克隆是指由一個(gè)動(dòng)物經(jīng)無性繁殖而產(chǎn)生的遺傳性狀完全相同的后代個(gè)體。卵細(xì)胞供體羊Scottish Blackface sheepDollyDollyFinnDorset(Foster Mother, 寄母)核供體羊克隆羊“多莉誕生后，克隆技術(shù)研究立即成為世界各國生物學(xué)家競相開展的生物學(xué)高新技術(shù)研究?？寺〖夹g(shù)之所以一經(jīng)產(chǎn)生立即引

2、起高度重視，是因?yàn)榭寺〖夹g(shù)不但具有重要的理論意義而且具有良好的應(yīng)用前景。 第一節(jié) 哺乳動(dòng)物克隆的開展歷史講授提綱第七章 哺乳動(dòng)物克隆技術(shù) 第二節(jié) 哺乳動(dòng)物克隆的技術(shù)方法第三節(jié) 克隆動(dòng)物的早衰問題第四節(jié) 克隆動(dòng)物的應(yīng)用前景第一節(jié) 哺乳動(dòng)物克隆的開展歷史同種胚胎細(xì)胞克隆同種體細(xì)胞克隆異種體細(xì)胞克隆克隆動(dòng)物技術(shù)的開展已經(jīng)歷了60余年的漫長探索，根據(jù)供體細(xì)胞核與去核卵細(xì)胞的來源可歸納為3個(gè)標(biāo)志性的開展階段。1938年，德科學(xué)家Hans Spemann最早提出克隆設(shè)想。1952年，美國科學(xué)家Briggs和King將發(fā)育后期的青蛙胚胎細(xì)胞核植入青蛙卵中，沒有發(fā)育。1965年，中國實(shí)驗(yàn)胚胎學(xué)家童第周完成了金

3、魚核移植并獲得成功。1981年，Illmensee和Hoppe用小鼠胚胎細(xì)胞第一次獲得了克隆小鼠，但其實(shí)驗(yàn)未能被重復(fù)。第一個(gè)階段 同種胚胎細(xì)胞克隆1984年，丹麥科學(xué)家Willadsen用胚胎細(xì)胞克隆羊獲得成功。1990年，中國科學(xué)院發(fā)育生物學(xué)研究所杜淼獲得了克隆兔。 隨后，90年代，中國科學(xué)家利用胚胎細(xì)胞相繼克隆成了兔、羊、豬、牛、小鼠等幾種動(dòng)物。1993年，美國的First用牛內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞成功地獲得了克隆牛。1997年，中國學(xué)者孟勵(lì)在美國成功獲得克隆猴。 至此，國內(nèi)外動(dòng)物克隆采用的均為胚胎細(xì)胞。1997年，孟勵(lì)首次用胚胎細(xì)胞獲得的克隆猴。1997年，英國羅斯林研究所等宣布用成年羊乳腺細(xì)胞首

4、次獲得克隆羊。1998年，日本科學(xué)家Kato等用牛的輸卵管細(xì)胞得到克隆牛。第二個(gè)階段 同種體細(xì)胞克隆1998年，美國夏威夷大學(xué)的Yanagimachi等用克隆鼠的卵丘細(xì)胞核作供體，獲得了克隆再克隆小鼠。至此，同種體細(xì)胞克隆進(jìn)入成熟階段。1998年，新西蘭成功地克隆了奶牛，并克隆了世界上僅存的最后一頭珍稀牛。附：同種體細(xì)胞克隆研究現(xiàn)狀1999年10月和2000年5月，我國揚(yáng)州大學(xué)與中科院發(fā)育所合作用攜帶外源基因的體細(xì)胞克隆出轉(zhuǎn)基因山羊。2000年6月，我國西北農(nóng)業(yè)大學(xué)用體細(xì)胞克隆出山羊。2000年9月，美國科學(xué)家采用原核互換的兩步核移植方法獲世界首例克隆豬。2001年1月，美國麻省ATC公司克隆

5、出一只印度野牛。2002年初，世界上第一只克隆貓?jiān)诿绹Q生。2002年，世界上第一只克隆兔在法國誕生。2003年5月，世界上第一只克隆騾子在美國誕生。2003年8月，世界上第一只克隆馬在意大利誕生。2002年初，我國首批成年體細(xì)胞克隆牛群體誕生。2002年初，在美國誕生的世界上第一只克隆貓。2002年，在法國誕生的世界上第一只克隆兔。2003年5月，在美國誕生的世界上第一只克隆騾子。2003年8月，在意大利誕生的世界上第一只克隆馬。2002年初，在我國誕生的首批成年體細(xì)胞克隆牛。1998年1999年，美國人White用珍稀動(dòng)物盤羊的體細(xì)胞核與牛卵結(jié)合，韓國黃禹錫將白頭山老虎體細(xì)胞核與牛卵結(jié)合，

6、我國學(xué)者陳大元將大熊貓?bào)w細(xì)胞核與兔卵結(jié)合，均成功克隆出早期胚胎。 2001年10月,意大利科學(xué)家報(bào)道異種克隆瀕危的歐洲盤羊獲得成功。第三個(gè)階段 異種體細(xì)胞克隆第二節(jié) 哺乳動(dòng)物克隆的技術(shù)方法克隆動(dòng)物主要方法：胚胎分割胚胎細(xì)胞核移植體細(xì)胞核移植連續(xù)細(xì)胞核移植優(yōu)質(zhì)動(dòng)物體細(xì)胞的來源動(dòng)物卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)重構(gòu)胚胚胎移植克隆動(dòng)物檢測體細(xì)胞核移植法克隆動(dòng)物的大體操作流程卵母細(xì)胞核體細(xì)胞核核移植體外培養(yǎng)1、動(dòng)物體細(xì)胞的體外培養(yǎng)G0期(細(xì)胞周期時(shí)相)常規(guī)體外培養(yǎng)降低血清使用量細(xì)胞分裂停止移核前卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COC)用M199洗3次100l成熟培養(yǎng)液成熟培養(yǎng)液： M199 +10% FCS +10 g/mL

7、 PMSG +10 g/mL HCG5%CO2，38.5，飽和濕度24h 或2830h觀察卵丘擴(kuò)展情況例:小牛卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)養(yǎng)(IVM)2、卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)盲吸法熒光法擠壓法吸引法蔗糖法3、去核方法帶下注射直接胞質(zhì)內(nèi)注射法4、核注射方法透明帶應(yīng)用piezo-pulse設(shè)備直接注射法常規(guī)法原核互換兩步法孤雌活化協(xié)同法誘導(dǎo)法5、核移植方法將數(shù)枚重構(gòu)胚放入100L的胚胎培養(yǎng)液CR1-aa中培養(yǎng)48h后，選擇4細(xì)胞以上的胚胎移入鋪滿飼養(yǎng)層細(xì)胞 的培養(yǎng)液滴中。在120h半換液，148h參加1mg/mL的葡萄糖。以后每隔48h半換液。5、重構(gòu)胚胎的體外培養(yǎng)小鼠胎兒成纖維細(xì)胞6、胚胎移植方法假孕的同步

8、發(fā)情的寄母輸卵管內(nèi)移植子宮角移植體細(xì)胞核卵母細(xì)胞重構(gòu)胚移入同步發(fā)情的動(dòng)物輸卵管或子宮內(nèi)體體體細(xì)胞克隆動(dòng)物研究路線圖圖圖體外培養(yǎng)去核胚胎移植移核7、克隆動(dòng)物的檢測方法微衛(wèi)星圖譜法同工酶法克隆?！皠?dòng)動(dòng)的微衛(wèi)星檢測結(jié)果(紅色代表標(biāo)準(zhǔn)分子量，藍(lán)色和綠色代表擴(kuò)增片段)受胎率低26.2%流產(chǎn)率高(53.8%)克隆動(dòng)物的存活率低35.7%)常出現(xiàn)早衰現(xiàn)象存 在 問 題第三節(jié) 克隆動(dòng)物的衰老問題克隆羊“多莉出現(xiàn)了早衰現(xiàn)象，其端粒長度比正常出生的羊短了20%，這與供核羊Finn Dorset的6歲年齡直接相關(guān)。人類染色體端粒的熒光免疫原位雜交照片1999年，美籍華人楊向中教授第一個(gè)報(bào)道了克隆動(dòng)物具有正常長度的端

9、粒和遺傳年齡，得出克隆動(dòng)物不會(huì)未老先衰、克隆動(dòng)物的遺傳年齡與供體動(dòng)物年齡無關(guān)的結(jié)論。此后，這一結(jié)論被美國麻省的ATC公司在克隆牛上和美國洛克菲勒大學(xué)在克隆鼠上得到證實(shí)?？傊捎诩?xì)胞衰老的分子機(jī)理至今仍未能研究清楚，因此有關(guān)克隆動(dòng)物的衰老問題，目前仍在爭論中，還需要進(jìn)一步的研究來證實(shí)。端粒酶結(jié)構(gòu)的模式圖解第四節(jié) 克隆動(dòng)物的應(yīng)用前景克隆動(dòng)物在畜牧業(yè)和醫(yī)學(xué)方面具有極為重要的意義，這不僅表現(xiàn)在理論研究方面，更重要的是其在應(yīng)用開發(fā)方面的實(shí)用價(jià)值。1. 克隆技術(shù)能快速培育出大量的優(yōu)良品種家畜，而用傳統(tǒng)的有性生殖方式培育動(dòng)物良種不但需要花費(fèi)很長的時(shí)間，而且優(yōu)良性狀難以在后代得到控制。克隆動(dòng)物在畜牧業(yè)和醫(yī)學(xué)方面的意義表達(dá)在：2. 克隆動(dòng)物的遺傳背景完全一致，因而可以防止動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的背景干擾，如用在藥物檢測上，所得結(jié)果將更加穩(wěn)定可靠。3. 動(dòng)物克隆技術(shù)可以用來保護(hù)瀕危動(dòng)物，用瀕危動(dòng)物的冷凍細(xì)胞隨時(shí)可以克隆出新的成體動(dòng)物，而無須消耗大量的人力物力?？寺?dòng)物可為需要組織器官移植的病人提供所需要的組織器官。 國外已經(jīng)開始了這方面的研究，例如科羅拉多大學(xué)的研究者用來源于克隆牛胎兒的多巴胺生成細(xì)胞治療帕金森氏病模型大鼠，已取得一定效果。治療性克隆示意圖5、動(dòng)物克隆技術(shù) 如果與 轉(zhuǎn)基因