產(chǎn)微生物絮凝劑菌株地篩選與產(chǎn)絮凝劑發(fā)酵條件地研究

1、PAGE1 / NUMPAGES11XX生物工程學(xué)院畢業(yè)論文(設(shè)計(jì))題目：產(chǎn)微生物絮凝劑菌株的篩選及產(chǎn)絮凝劑發(fā)酵條件的研究學(xué)生：曾威系別：生物技術(shù)系專業(yè)班級(jí)：06級(jí)本科3班指導(dǎo)教師：程愛芳輔導(dǎo)教師：程愛芳時(shí)間：2009年11月至2010年5月目錄摘要II關(guān)鍵詞IIABSTRACTIIIKEYWORDSIII0引言11材料與方法11.1材料11.1.1菌種來源11.1.2培養(yǎng)基11.2方法11.2.1土壤樣品的采集及預(yù)處理11.2.2富集培養(yǎng)21.2.3菌種的分離與純化21.2.4初篩和復(fù)篩21.2.5絮凝活性的測(cè)定22結(jié)果與討論22.1菌株分離及初篩結(jié)果22.2復(fù)篩結(jié)果32.3培養(yǎng)條件的優(yōu)化3

2、2.3.1培養(yǎng)溫度對(duì)絮凝劑絮凝率的影響32.3.2培養(yǎng)基初始pH值對(duì)絮凝劑產(chǎn)生速率的影響32.3.3C1產(chǎn)絮凝劑周期的測(cè)定32.3.4不同接種量對(duì)菌體產(chǎn)絮凝劑的影響43結(jié)論4參考文獻(xiàn)6致謝6I產(chǎn)微生物絮凝劑菌株的篩選及產(chǎn)絮凝劑發(fā)酵條件的研究摘要以活性污泥作為菌種來源，采用常規(guī)微生物學(xué)方法分離到36株菌株，初篩后有9株菌株有絮凝活性，經(jīng)復(fù)篩后有1株菌株C1絮凝活性最高。該菌株所產(chǎn)微生物絮凝劑沉降速度快，絮凝率高，顯示了該微生物絮凝劑良好的實(shí)際應(yīng)用前景。對(duì)其生長(zhǎng)曲線的研究表明，C1菌株的絮凝活性與菌體生物量呈正相關(guān)性，培養(yǎng)24h即可達(dá)到最高絮凝活性。關(guān)鍵詞微生物絮凝劑；篩選；優(yōu)化IIMicrobi

3、alflocculantsstrainsinthescreeningandproduceflocculantsfermentationconditionsAbstractAsasourceofactivatedsludgebacteria,isolatedbyconventionalmicrobiologicalmethodsto36strains,9strainswereisolatedafterscreeningaflocculatingactivity,afterrescreeningafterastrainofthehighestflocculatingactivityofC1.Flo

4、cculantsproducedbythestrainsettlementrate,flocculationrate,showsthepracticalapplicationofmicrobialflocculantsgoodprospects.Thestudyshowsthatitsgrowthcurve,C1strainofflocculatingactivityandcellbiomasswaspositivelycorrelated24hculturecanachievethehighestflocculatingactivity.KeywordsMicrobialflocculant

5、s;Screening;OptimizationIIIXX生物工程學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文（設(shè)計(jì)）0引言目前國(guó)內(nèi)外用于提高水質(zhì)處理效率的一種既經(jīng)濟(jì)又簡(jiǎn)便的水處理技術(shù)之一就是添加適宜的絮凝劑，絮凝劑被廣泛應(yīng)用于廢水處理、食品加工和化工等工業(yè)過程。絮凝劑按其來源和性質(zhì)可分為無機(jī)絮凝劑、有機(jī)高分子絮凝劑和天然生物高分子絮凝劑。前2種絮凝劑不易降解，且其可能是神經(jīng)毒劑和致癌、致突變因子，現(xiàn)在許多領(lǐng)域已禁止或限量使用。微生物絮凝劑(microbialfloeculants，MBF)是利用生物技術(shù)，從微生物體或其分泌物提取、純化而獲得的新型水處理劑，具有安全、高效、可生物降解、不污染環(huán)境、可消除二次污染等特點(diǎn)，具

6、有其它絮凝劑無法比擬的優(yōu)勢(shì)，而且也易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，所以MBF取代大部分傳統(tǒng)的無機(jī)和合成有機(jī)高分子絮凝劑將成為一種趨勢(shì)。MBF的研制正成為當(dāng)今世界絮凝劑研究的重要課題絮凝在給水和排水中均發(fā)揮著不可缺少的重要作用，所應(yīng)用的絮凝劑主要有傳統(tǒng)的無機(jī)、有機(jī)絮凝劑及生物絮凝劑，前者由于具有價(jià)格低廉，絮凝效果好等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛使用，但由于其對(duì)人類健康所形成的隱患使其應(yīng)用越來越受到限制。微生物絮凝劑是一種由微生物產(chǎn)生的具有絮凝活性的高分子化合物，具有絮凝沉降性能好、安全、無毒、無二次污染、易于生物降解等優(yōu)點(diǎn)，不僅能快速絮凝、沉淀各種水中的懸浮顆粒、金屬離子，而且在廢水脫色、高濃度有機(jī)物去除等方面有獨(dú)特效

7、果，是一類極具發(fā)展前景的環(huán)境友好型水處理劑。同時(shí)，由于能產(chǎn)生絮凝作用的微生物種類多、生長(zhǎng)快、易于采取生物工程手段實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，因此，研究和開發(fā)微生物絮凝劑具有深遠(yuǎn)的現(xiàn)實(shí)意義和廣闊的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)從垃圾滲濾液中篩選出一株高效微生物絮凝劑產(chǎn)生菌C2,并對(duì)其的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，以期提高其絮凝效率1。1材料與方法1.1材料1.1.1菌種來源以取自XX生物工程學(xué)院柳園餐廳的生活污水以及餐廳旁的活性污泥作為菌種來源。1.1.2培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)中采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(培養(yǎng)細(xì)菌用)、高氏一號(hào)培養(yǎng)基(培養(yǎng)放線菌用)、查氏培養(yǎng)基(培養(yǎng)霉菌用)、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(培養(yǎng)真菌用)。本實(shí)驗(yàn)中，富集培養(yǎng)時(shí)選用上述培養(yǎng)基的液

8、體培養(yǎng)基，分離、保藏菌株時(shí)則采用相應(yīng)的固體培養(yǎng)基2-3。發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖150g，尿素1g，MgSO47H2O0.5g，KCl015g，KH2PO40.08g，ZnSO47H2O0.01g，MnSO4H2O0.02g，蒸餾水1000mL，pH值自然。1.2方法1.2.1土壤樣品的采集及預(yù)處理取自XX生物工程學(xué)院柳園餐廳的生活污水以及餐廳旁的活性污泥用無菌水浸泡幾分鐘，過濾，到入一個(gè)250ml已滅菌的錐形瓶中。1XX生物工程學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文（設(shè)計(jì)）1.2.2富集培養(yǎng)分別在不加瓊脂的PDA培養(yǎng)基，高氏一號(hào)培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中加入1mL的土壤懸液，均富集培養(yǎng)兩天，編號(hào)并注明日期。

9、1.2.3菌種的分離與純化(1)稀釋培養(yǎng)液。用移液管移取1mL的細(xì)菌富集培養(yǎng)液于一裝有9mL無菌水的試管中，混勻，再用另一支移液管移取此稀釋液1mL于另一裝有9mI無菌水的試管中，依次類推將富集培養(yǎng)液逐漸稀釋制成10-210-6各種梯度的培養(yǎng)液。其他的富集培養(yǎng)液以同樣的方法稀釋4。-3的細(xì)菌培養(yǎng)液，在其培養(yǎng)基中劃線， (2)平板劃線。在無菌條件下，用接種環(huán)取一環(huán)稀釋倍數(shù)為l0平行劃三個(gè)平板，同樣的方法將稀釋倍數(shù)為10-4、10-5培養(yǎng)液平行劃三個(gè)平板，三個(gè)對(duì)照，編號(hào)，注明日期后，倒置在生化培養(yǎng)箱中于37培養(yǎng)2天。放線菌，霉菌，真菌以同樣的方法操作，于28倒置培養(yǎng)57天。(3)菌落的選擇和挑取。

10、將透明圈比較大的菌落進(jìn)行編號(hào)，分別接種于各自的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)5。1.2.4初篩和復(fù)篩將分離菌株分別接種到相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，在30搖床培養(yǎng)48h后，以高嶺土懸濁液為模擬廢水，目測(cè)分離菌株對(duì)高嶺土懸濁液的絮凝活性，初步篩選出絮凝活性較好的菌株。將初篩菌株分別接種于裝有150mL培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30、150rmin振蕩培養(yǎng)，于24h、48h、72h取樣，測(cè)定培養(yǎng)液在不離心和3000rrain離心30min兩種情況下，菌株發(fā)酵液對(duì)高嶺土懸濁液的絮凝活性，進(jìn)行復(fù)篩6-7。1.2.5絮凝活性的測(cè)定絮凝活性用絮凝率來表征。在100mL比色管中加入0.4g高嶺土、2mL1.0的CaCl2及2m

11、L純化培養(yǎng)的培養(yǎng)液，加蒸餾水至100mL。蓋上蓋子做10次上下自然翻轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速以每次翻轉(zhuǎn)時(shí)氣泡上升完畢為準(zhǔn)。靜置10min，取比色管中75mL處的上清液并以蒸餾水為參比溶液，于波長(zhǎng)為550nm處測(cè)其吸光度。絮凝率的計(jì)算公式如下：絮凝率=(A-B)A100式中，A為原高嶺土懸濁液上清液550nm處的吸光度值；B為處理后的高嶺土懸濁液上清液550nm處的吸光度值8-11。2結(jié)果與討論2.1菌株分離及初篩結(jié)果本實(shí)驗(yàn)共分離菌株36株，每種培養(yǎng)基9株，分別命名為P1、P2、P9(PDA培養(yǎng)基)，N1、N2、N9(牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基)，C1、C2、C9（查氏培養(yǎng)基），G1、G2、G9（高氏培養(yǎng)基）12-13

12、。初篩后有絮凝活性的菌株共10株，其中牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基1株，為N2，高氏一號(hào)培養(yǎng)基3株，分別為G2、G4、G5；查氏培養(yǎng)基6株，分別為C1、C2、C3、C5、C7、C8；PDA培養(yǎng)基0株。2XX生物工程學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文（設(shè)計(jì)）2.2復(fù)篩結(jié)果復(fù)篩結(jié)果如表1所示。其中絮凝活性最高的為C1，絮凝率為0.712，其次為C2、C8。將這三株菌株重新接種培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)液的發(fā)酵活性進(jìn)行比較，結(jié)果顯示C1菌株沉降速度最快，絮凝率最高，且菌株懸液濃度較低，表明該菌株產(chǎn)微生物絮凝劑能力強(qiáng)，且培養(yǎng)液絮凝活性好。因此，以該菌株作14為后續(xù)研究對(duì)象。表1不同菌株絮凝活性菌株N2G2G4G5C1C2C3C5C7C8絮凝率

13、0.280.3080.1020.4720.7120.6210.320.3030.5070.5412.3培養(yǎng)條件的優(yōu)化2.3.1培養(yǎng)溫度對(duì)絮凝劑絮凝率的影響表2培養(yǎng)溫度對(duì)絮凝劑絮凝率的影響培養(yǎng)溫度（）23252730333537絮凝率0.5110.5240.5880.6920.6530.5470.501由表2可知，當(dāng)溫度為30時(shí)，絮凝劑絮凝率最大為0.692。2330之間時(shí)，絮凝劑絮凝率隨溫度升高而增大，但溫度為35時(shí)，絮凝劑絮凝率迅速下降。這是因?yàn)闇囟冗^低或過高時(shí)，微生物生長(zhǎng)過慢或過快，均不利于絮凝劑的積累15。因此，選擇培養(yǎng)溫度為30。2.3.2培養(yǎng)基初始pH值對(duì)絮凝劑產(chǎn)生速率的影響表3初始

14、pH值對(duì)絮凝劑絮凝率的影響pH值456789絮凝率0.4120.5290.6420.7120.6850.594pH值對(duì)微生物的生長(zhǎng)和代謝具有很大的影響。一方面，pH過高或過低都會(huì)引起微生物表面電荷的改變，從而不利于細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收；另一方面，pH過高或過低會(huì)使蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子所帶電荷發(fā)生變化，從而影響其生物活性16。由表3可以看出，pH在6.08.0的X圍之間，都有較高的絮凝活性，最佳pH在7.0左右，此時(shí)絮凝率達(dá)到71.2。2.3.3C1產(chǎn)絮凝劑周期的測(cè)定在250mL三角瓶?jī)?nèi)裝50mL發(fā)酵培養(yǎng)基，初始pH值為7，在30、180rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)，每12h取樣一次，測(cè)定發(fā)酵液絮凝

15、活性。發(fā)酵液的絮凝率在12h之前均為負(fù)數(shù)，可能因?yàn)樵谂囵B(yǎng)初期，絮凝劑產(chǎn)生菌尚未產(chǎn)生絮凝劑，相反在發(fā)酵液或高嶺土中某些成分使吸光度增大，導(dǎo)致絮凝率為負(fù)值17。培養(yǎng)中、后期絮凝活性逐步上升，發(fā)酵72h時(shí)絮凝率達(dá)到72%，之后絮凝率又逐漸下降。表4生長(zhǎng)周期對(duì)絮凝劑絮凝率的影響生長(zhǎng)周期12h24h36h48h60h72h84h96h108h絮凝率-0.1830.1540.2630.4210.5740.720.6740.6120.5823XX生物工程學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文（設(shè)計(jì)）2.3.4不同接種量對(duì)菌體產(chǎn)絮凝劑的影響在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別以1、2、3、4、5、6的接種量接入種子液，經(jīng)搖床培養(yǎng)72h后，分別測(cè)定各

16、組培養(yǎng)液的絮凝活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，接種量為3時(shí)，絮凝率較高為70.5，之后隨著接種量的增大，絮凝率降低。因此，接種量也是影響C1產(chǎn)絮凝劑的一個(gè)因素。由于接種量過大，培養(yǎng)液中細(xì)菌的初始濃度高，生長(zhǎng)初期細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖則會(huì)消耗大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致絮凝劑的產(chǎn)量下降；而接種量過小，培養(yǎng)液中的細(xì)菌濃度低，使得培養(yǎng)周期過長(zhǎng)18。表5不同接種量對(duì)絮凝劑絮凝率的影響接種量1%2%3%4%5%6%絮凝率0.5420.6740.7050.6820.6570.6353結(jié)論以活性污泥作為菌種來源，采用常規(guī)微生物學(xué)方法從四種培養(yǎng)基中分離到36株菌株。經(jīng)初篩后有10株菌株有絮凝活性，經(jīng)復(fù)篩后有3株菌株絮凝活性較高，其中C1菌

17、株絮凝活性最高，可達(dá)71.2%。該菌株所產(chǎn)微生物絮凝劑絮凝率高，且生成絮體大，沉降速度快，顯示了該微生物絮凝劑良好的實(shí)際應(yīng)用前景。經(jīng)過單因子實(shí)驗(yàn)的研究表明：（1）在溫度為30、絮凝劑絮凝率最大為0.692。2330之間時(shí)，絮凝劑絮凝率隨溫度升高而增大，但溫度為35時(shí)，絮凝劑絮凝率迅速下降。這是因?yàn)闇囟冗^低或過高時(shí)，微生物生長(zhǎng)過慢或過快，均不利于絮凝劑的積累。因此，選擇培養(yǎng)溫度為30。（2）pH值為7時(shí)，一方面，pH過高或過低都會(huì)引起微生物表面電荷的改變，從而不利于細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收；另一方面，pH過高或過低會(huì)使蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子所帶電荷發(fā)生變化，從而影響其生物活性。由表3可以看出，pH

18、在6.08.0的X圍之間，都有較高的絮凝活性，最佳pH在7.0左右，此時(shí)絮凝率達(dá)到71.2。（3）最佳生長(zhǎng)周期為72h。發(fā)酵液的絮凝率在12h之前均為負(fù)數(shù)，可能因?yàn)樵谂囵B(yǎng)初期，絮凝劑產(chǎn)生菌尚未產(chǎn)生絮凝劑，相反在發(fā)酵液或高嶺土中某些成分使吸光度增大，導(dǎo)致絮凝率為負(fù)值。培養(yǎng)中、后期絮凝活性逐步上升，發(fā)酵72h時(shí)絮凝率達(dá)到72%，之后絮凝率又逐漸下降。（4）最佳接種量為3%。絮凝率較高為70.5，之后隨著接種量的增大，絮凝率降低。因此，由于接種量過大，培養(yǎng)液中細(xì)菌的初始濃度高，生長(zhǎng)初期細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖則會(huì)消耗大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致絮凝劑的產(chǎn)量下降；而接種量過小，培養(yǎng)液中的細(xì)菌濃度低，使得培養(yǎng)周期過長(zhǎng)。雖然

19、當(dāng)前對(duì)微生物絮凝劑菌株的研究比較多，但還是有很多地方還需要實(shí)質(zhì)性的突破。我覺得現(xiàn)在對(duì)微生物絮凝劑菌株研究的重點(diǎn)是盡快將微生物絮凝劑推廣應(yīng)用到實(shí)際中去,實(shí)現(xiàn)微生物絮凝劑的大規(guī)模推廣,關(guān)鍵是要提高生產(chǎn)效率、降低成本、拓寬適用X圍和使用效率。今后的研究工作可能集中在以下幾方面展開：(1)繼續(xù)從各角度研究微生物的絮凝機(jī)理仍將是各國(guó)科學(xué)工作者研究的熱點(diǎn)。(2)在微生物發(fā)酵中,誘導(dǎo)和利用自絮凝菌株實(shí)現(xiàn)微生物的高濃度培養(yǎng),以提高目標(biāo)產(chǎn)物的濃度,優(yōu)化運(yùn)行條件、探索新工藝新方法。尋找物美價(jià)廉的微生物絮凝劑培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件的研究,實(shí)現(xiàn)連續(xù)發(fā)酵也是今后微生物絮凝劑應(yīng)用研究的一個(gè)方向。4XX生物工程學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文（

20、設(shè)計(jì)）(3)在生物發(fā)酵產(chǎn)品的后提取中,針對(duì)具體的微生物發(fā)酵液體系,選擇合適的絮凝劑進(jìn)行絮凝預(yù)處理,從而改善其固液分離性能,以利于產(chǎn)品的進(jìn)一步提純,這將會(huì)大大降低后提取的成本,帶來可觀的經(jīng)濟(jì)效益;研究微生物絮凝劑與其它絮凝劑的配合使用,發(fā)揮互補(bǔ)作用,不但可提高絮凝效率,而且還可降低投加量。(4)從分子生物學(xué)的角度深入研究,運(yùn)用基因工程和生物技術(shù)定向選育高絮凝活性、高降解能力的工程菌將是其發(fā)展的方向之一。參考文獻(xiàn)1周禮,X永奎,陳曉等.一種高效微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選及培養(yǎng)基優(yōu)化J.環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2006,26(4):52-58.2陶然,楊朝暉,曾光明等.微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選、鑒定及其培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究J.中國(guó)生物工程雜志,2005,25(8):76-81.3董曉斌.新型生物絮凝劑的研究與應(yīng)用J.XX聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2006,20(1):52-54.4趙鳳,X蔚萍,胡慶華.微生物絮凝劑的絮凝機(jī)理和應(yīng)用研究J.環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展,2009(2):6-8.5王鍵為,李艷賓.微生物絮凝劑在廢水處理中的應(yīng)用J.XX化工,2007,30(6):75-76.6楊阿明，X志強(qiáng)，王學(xué)江高效微生物絮凝劑用于污泥脫水及其動(dòng)力學(xué)研究J中國(guó)給水排水，2007，23(90)：24-28.7陶然，楊朝暉，曾光明等微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選、鑒定及培養(yǎng)條件