微生物發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用

1、教學(xué)安排： 1. 員工培訓(xùn) 由老師講解發(fā)酵過(guò)程的理論根底。 分配實(shí)操任務(wù)：發(fā)酵過(guò)程控制。 2. 學(xué)生模擬組建運(yùn)營(yíng)一個(gè)發(fā)酵車(chē)間，撰寫(xiě)方案書(shū)(在理論教學(xué)期間完成)。 市場(chǎng)部：當(dāng)前發(fā)酵過(guò)程控制的技術(shù)進(jìn)展。 技術(shù)部：確定pH、溫度、溶O2、補(bǔ)料等關(guān)鍵參數(shù)的控制方法，撰寫(xiě)操作規(guī)程。 品控部：制定發(fā)酵過(guò)程控制的方案。 總經(jīng)理：協(xié)調(diào)監(jiān)督各部工作，最后拿出完整的方案書(shū)。 3. 方案書(shū)實(shí)施。 方案書(shū)要先經(jīng)過(guò)老師的審核，然后實(shí)施。 實(shí)施過(guò)程中考核操作技能。 實(shí)施后及時(shí)進(jìn)行實(shí)訓(xùn)報(bào)告的撰寫(xiě)也總結(jié)。第一節(jié) 微生物發(fā)酵類(lèi)型一 分批發(fā)酵、補(bǔ)料分批發(fā)酵與連續(xù)發(fā)酵二 需氧發(fā)酵與厭氧發(fā)酵三 生長(zhǎng)偶聯(lián)型、局部生長(zhǎng)偶聯(lián)型和非生長(zhǎng)偶聯(lián)

2、型第二節(jié) 發(fā)酵過(guò)程工藝參數(shù)控制一 物理參數(shù)1 溫度2 壓力： 內(nèi)部壓力高于外部壓力。3 攪拌轉(zhuǎn)速： 轉(zhuǎn)/分鐘4 攪拌功率：每立方米發(fā)酵液所消耗的功率，kw/m35 空氣流量：每分鐘內(nèi)每單位體積發(fā)酵液通入空氣的體積，V/V.min6 粘度：反映氧傳遞阻力和菌體濃度。二 化學(xué)參數(shù)1 pH2 基質(zhì)濃度：糖、氮、磷等。3 溶解氧濃度4 氧化復(fù)原電位5 產(chǎn)物濃度6 廢氣中氧的含量7 廢氣中CO2的含量。三 生物參數(shù)1 菌體濃度2 菌絲形態(tài)第三節(jié) 發(fā)酵過(guò)程中的代謝變化一 初級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)酵的代謝變化1 菌體濃度的變化 延遲期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、靜止期和死亡期。 延遲期的長(zhǎng)短與培養(yǎng)條件和菌種生理狀態(tài)有關(guān)。 在未達(dá)死

3、亡期之前放罐。2 營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)濃度的變化 隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)不斷降低，用于菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的形成。 溶氧的變化規(guī)律(后面講)。3 產(chǎn)物濃度的變化 (1) 與菌體濃度平行； (2) 與培養(yǎng)條件有關(guān)。二 次級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)酵的代謝變化 次級(jí)代謝發(fā)酵的菌體生長(zhǎng)(生長(zhǎng)期)和產(chǎn)物合成期(生產(chǎn)期)是分開(kāi)的。 發(fā)酵過(guò)程可分為：菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物合成、菌體自溶三個(gè)階段。1 菌體生長(zhǎng)階段 (1) 營(yíng)養(yǎng)成分的變化 碳源、氮源和磷酸鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷被消耗，濃度明顯減少，而新菌體不斷合成，菌濃明顯增加。(2) 攝氧率的變化 隨菌濃增加，攝氧率不斷增加，溶氧濃度下降，菌濃至臨界，溶氧至最低。(3) pH 先下降后下升：利用葡萄糖產(chǎn)生

4、酸，而后再被利用。 先上升后下降：利用氨基酸的碳骨架，剩下氨，而后氨又被利用。 限制性因素的出現(xiàn)，使菌體由生長(zhǎng)向生產(chǎn)轉(zhuǎn)化。2 產(chǎn)物合成階段 產(chǎn)物產(chǎn)量不斷增多，起至到達(dá)最大值，生產(chǎn)速率也達(dá)最大，直至產(chǎn)物合成能力衰退。 該階段要嚴(yán)格控制發(fā)酵條件，對(duì)產(chǎn)物的合成最為關(guān)鍵。例如營(yíng)養(yǎng)濃度。3 菌體自溶階段 菌體衰老、開(kāi)始自溶，氨氮含量升高，pH上升，產(chǎn)物合成能力衰退，生產(chǎn)速率下降。此時(shí)結(jié)束發(fā)酵。第四節(jié) 菌體濃度影響及其控制菌體濃度：?jiǎn)挝惑w積培養(yǎng)液中菌體的含量。一 影響菌體生長(zhǎng)的因素1 比生長(zhǎng)速率：越大，菌體生長(zhǎng)越快；決定于細(xì)胞的復(fù)雜性(越復(fù)雜越慢)；2 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境條件： 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度在一定限度內(nèi)，濃度

5、與菌體生長(zhǎng)成正比。 其它環(huán)境條件越適合，生長(zhǎng)越快。二 菌濃對(duì)初級(jí)代謝和次級(jí)代謝的影響 產(chǎn)物的產(chǎn)率： Rp = Qp X 其中： Qp 為比生產(chǎn)速率； X 為菌體濃度。 X太大的負(fù)面影響： 1 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗太快； 2 生產(chǎn)毒素； 3 溶氧供給不上。發(fā)酵過(guò)程中菌濃度的控制 通過(guò)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)速率實(shí)現(xiàn)，而這又要通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)濃度。 第五節(jié) 營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)影響及其控制一 碳源的影響及其控制1 碳源的種類(lèi)影響代謝情況迅速利用的碳源：迅速參與代謝，合成菌體和產(chǎn)生能量，并產(chǎn)生分解產(chǎn)物，因此有利于菌體生長(zhǎng)，但對(duì)產(chǎn)物(特別是次級(jí)代謝)有抑制作用(例如葡萄糖)。緩慢利用的碳源：可被菌體緩慢利用，有利于延長(zhǎng)代謝產(chǎn)物的

6、合成(例如乳糖、蔗糖、麥芽糖、糊精、飴糖等)。機(jī)理解釋?zhuān)?乳糖的利用速度剛好符合青霉素的合成速度?？刂品椒ǎ毫骷悠咸烟腔虿捎没旌咸荚?。2 碳源濃度的影響 濃度適宜?？刂品椒ǎ褐虚g補(bǔ)料。二 氮源的影響和控制1 氮源濃度的影響以谷氨酸發(fā)酵為例：NH4+太高：合成谷氨酰氨；NH4+缺乏：積累-酮戊二酸。2 氮源的種類(lèi)的影響速效氮源：氨基態(tài)氮和玉米漿，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，但對(duì)局部產(chǎn)物，特別是次級(jí)產(chǎn)物合成有抑制作用。緩慢氮源：延長(zhǎng)產(chǎn)物合成期。發(fā)酵培養(yǎng)基一般采用速效與緩慢氮源的混合物，且中間還要補(bǔ)充。(1) 補(bǔ)加有機(jī)氮源(2) 補(bǔ)加無(wú)機(jī)氮源(補(bǔ)氮和調(diào)pH雙重成效)。三 磷酸鹽的影響和控制 適合微生物生長(zhǎng)的磷鹽濃

7、度偏高； 適合微生物藥物合成的磷鹽濃度偏低。 發(fā)酵過(guò)程一般采用亞適量。第六節(jié) 溫度的影響及其控制一 溫度對(duì)發(fā)酵的影響1 影響各種酶反響的速率和蛋白質(zhì)的性質(zhì)； 菌體生長(zhǎng)所需溫度與產(chǎn)物合成溫度不一致(如青霉素)；溫度不同還可能影響產(chǎn)物合成的方向(如金霉素和四環(huán)素)。2 影響發(fā)酵液的物理性質(zhì)。(粘度、氧和基質(zhì)的溶解與傳遞、分解和吸收)二 影響發(fā)酵溫度變化的因素產(chǎn)熱的因素：1 生物熱(Q生物) 與培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)階段有關(guān)。2 攪拌熱(Q攪拌)散熱的因素：1 蒸發(fā)熱(Q蒸發(fā))2 輻射熱(Q輻射)三 溫度的控制1 最適溫度的選擇2 溫度的控制第七節(jié) pH的影響及其控制一 pH對(duì)發(fā)酵的影響1 影響微生物的生

8、長(zhǎng)及產(chǎn)物的合成(通過(guò)影響酶活性實(shí)現(xiàn))；生長(zhǎng)最適pH與合成最適pH不一致菌體內(nèi)的pH近中性，因?yàn)榘l(fā)酵培養(yǎng)基中的pH是通過(guò)間接方式作用與胞內(nèi)酶的2 影響菌體對(duì)基質(zhì)的利用速度和細(xì)胞結(jié)構(gòu)(通過(guò)影響膜實(shí)現(xiàn))；例如產(chǎn)黃青霉在低pH 下為絲狀，高pH為酵母狀3 影響產(chǎn)物的穩(wěn)定性；噻吶霉素在pH6.7-7.5時(shí)穩(wěn)定；青霉素在堿性條件下發(fā)酵產(chǎn)量低二 發(fā)酵pH的變化(影響因素)1 菌種的遺傳特性菌種具有自我調(diào)節(jié)pH能力，但能力有限度(地中?？ㄖZ氏菌發(fā)酵生產(chǎn)利福霉素SV)2 營(yíng)養(yǎng)成分的分解代謝碳源分解代謝產(chǎn)生中間產(chǎn)物丙酮酸，產(chǎn)生丙酮酸的多少與碳源種類(lèi)和濃度有關(guān)。 pH變化是菌體產(chǎn)酸或產(chǎn)堿的綜合作用結(jié)果，可能通過(guò)pH

9、變化反響發(fā)酵情況。發(fā)酵pH確實(shí)定和控制1 發(fā)酵 pH確實(shí)定 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定2 pH控制最適pH在微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成相互關(guān)系： (1) 二者的pH相似且在較寬的內(nèi)； (2) 生長(zhǎng)的pH較寬，而合成的pH較窄； (3) 二者都敏感，但最適點(diǎn)相同； (4) 二者都敏感，但最適點(diǎn)不同。pH的控制方法：1 培養(yǎng)基配比適當(dāng)，使pH在適宜的范圍內(nèi)變化；2 直接補(bǔ)加酸堿或補(bǔ)料； 其中采用補(bǔ)料的方法可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)、延長(zhǎng)發(fā)酵周期、調(diào)節(jié)pH和改變培養(yǎng)基性質(zhì)等幾種目的。第八節(jié) 溶氧的影響及控制一 溶氧對(duì)發(fā)酵的影響 影響菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物合成及產(chǎn)物的性質(zhì)。1 有時(shí)，氧充分促進(jìn)產(chǎn)物合成，如谷氨酸和金霉素發(fā)酵；2 有

10、時(shí)，氧充足會(huì)對(duì)產(chǎn)物有抑制作用，如維生素B12發(fā)酵。 因此溶氧并非越高越好。氨基酸發(fā)酵對(duì)氧的需求分三類(lèi)：1 谷氨酸、精氨酸和脯氨酸，氧必須供給充足，產(chǎn)量才大；2 異亮氨酸、賴(lài)氨酸和蘇氨酸，供氧充分可獲得最高產(chǎn)量，但供氧受限時(shí)，不會(huì)有太大影響；3 亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸，供氧受限對(duì)產(chǎn)物合成有利。二 發(fā)酵過(guò)程的溶氧變化 在一定的發(fā)酵條件下，每種產(chǎn)物發(fā)酵的溶氧變化都有自身的規(guī)律?？偟囊?guī)律：先下降，后上升，不同產(chǎn)物后期出現(xiàn)最低谷的時(shí)間不同。溶氧異常下降的原因：1 污染好氣性雜菌；2 菌體代謝異常；3 某些設(shè)備或工藝控制發(fā)生故障，如攪拌。引起溶氧異常升高的原因：1 代謝異常，菌體過(guò)早衰老；2 污染噬菌體

11、。三 溶氧濃度的控制 溶氧濃度是由氧的供需平衡所決定的。供大于需時(shí)，溶氧上升；供小于需時(shí)，溶氧下降。提高供氧的方法：提高氧傳遞動(dòng)力和液相體積氧傳遞系數(shù)。氧傳遞動(dòng)力的提高受限，只能通過(guò)攪拌、通氣及發(fā)酵液粘度控制?？刂菩柩醯姆椒ǎ?需氧量受菌體濃度、營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的種類(lèi)和濃度、培養(yǎng)條件影響，其中重要的是菌體濃度。菌體濃度可通過(guò)控制比生長(zhǎng)速率來(lái)實(shí)現(xiàn)，這又要通過(guò)營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)濃度的控制來(lái)實(shí)現(xiàn)。一 二氧化碳對(duì)發(fā)酵的影響二氧化碳的作用：1 刺激作用，如環(huán)狀芽孢桿菌發(fā)芽孢子開(kāi)始生長(zhǎng)時(shí)就需要二氧化碳，此謂二氧化碳效應(yīng)。2 抑制作用，影響生長(zhǎng)速度、菌體形態(tài)、產(chǎn)物合成和培養(yǎng)基pH。第九節(jié) 二氧化碳影響及其控制二 二氧化碳濃度

12、的控制 二氧化碳受呼吸強(qiáng)度、發(fā)酵液流變學(xué)特性、通氣攪拌程度和外界壓力大小影響。 通過(guò) 通氣和攪拌 來(lái)控制。第十節(jié) 補(bǔ)料分批發(fā)酵一 補(bǔ)料分批發(fā)酵的作用補(bǔ)料分批發(fā)酵的概念。補(bǔ)料分批發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)：(1) 解除了底物抑制、產(chǎn)物反響抑制和分解產(chǎn)物阻遏；(2) 防止在分批發(fā)酵中因一次投料過(guò)多造成細(xì)胞大量生長(zhǎng)所引起的不良影響，降低發(fā)酵液的粘度；(3) 可用作控制細(xì)胞質(zhì)量的手段，以提高發(fā)芽孢子的比例；(4) 一種理論研究方法。(一) 可以控制抑制性底物的濃度 高密度的生物量需要投入幾倍的基質(zhì)，但高濃度的基質(zhì)有抑制作用。抑制原因：有的基質(zhì)濃度過(guò)濃使?jié)B透壓過(guò)高，細(xì)胞因脫水而死亡；(2) 高濃度基質(zhì)能使微生物熱致死；

13、(3) 對(duì)代謝關(guān)鍵酶或細(xì)胞組分產(chǎn)生抑制作用；(4) 改變菌體的生化代謝而影響生長(zhǎng)。 局部前體物有毒性，局部是由于溶解度小。(二) 可以解除或減弱分解產(chǎn)物阻遏 局部合成酶受到易利用的碳或氮源的阻遏，例如葡萄糖的分解代謝產(chǎn)物引起的阻遏。(三) 可以使發(fā)酵過(guò)程最正確化二 補(bǔ)料的方式和控制(一) 補(bǔ)料方式 連續(xù)流加、不連續(xù)流加(多周期流加)。(二) 補(bǔ)料控制 1 有反響控制 反響控制系統(tǒng)：傳感器、控制器和驅(qū)動(dòng)器。 直接方法：以限制性營(yíng)養(yǎng)物濃度作為反響參數(shù)； 間接方法：以溶氧、pH、呼吸商、排氣中的CO2及代謝產(chǎn)物濃度等為參數(shù)。 間接方法的例子：以CO2和pH為控制參數(shù)。2 無(wú)反響控制 經(jīng)驗(yàn)補(bǔ)料法。第十一節(jié) 泡沫的影響及控制 泡沫(機(jī)械泡沫和流態(tài)泡沫)的危害：1 裝料系數(shù)減??；2 增加染菌機(jī)率。消泡方法：1 機(jī)械消泡；2 消泡劑消泡。1泡沫保持恒定的水平；2早期穩(wěn)定下降，以后恒定；蛋白質(zhì)的消耗。3前期稍微降低，后又上升；4開(kāi)始低，以后上升。5綜合方式無(wú)規(guī)律性控制泡沫方法：防止氣體、發(fā)泡物質(zhì)：有機(jī)氮源，降低有機(jī)氮源濃度，需求量缺乏，補(bǔ)料不能斗絕治理天然油脂豆油、菜籽油；高碳醇、脂肪酸或脂類(lèi)；聚醚類(lèi)；硅酮。