實驗一 細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞器的觀察

1、細(xì)胞生物學(xué)實驗實驗課要求1.安全第一。2.認(rèn)真聽課，隨時發(fā)問。3.上課期間不要吃東西，手機調(diào)到震動。4.缺課1/3以上者直接進(jìn)入重修。5.成績包括：實驗報告，平時成績，期末小考。2實驗一 細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞器的觀察實驗?zāi)康模?）學(xué)習(xí)普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造和原理，重點掌握光學(xué)顯微鏡的規(guī)范操作方法。（2）觀察動植物細(xì)胞的細(xì)胞及其細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，重點觀察有絲分時期的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征及染色體的變化規(guī)律。3實驗用品普通光學(xué)顯微鏡以及動植物細(xì)胞裝片?？谇簧掀ぜ?xì)胞，洋蔥鱗莖表皮細(xì)胞，洋蔥根尖細(xì)胞。4主要內(nèi)容顯微鏡的發(fā)展顯微鏡的光學(xué)原理顯微鏡的幾個基本概念顯微鏡的結(jié)構(gòu)顯微鏡的使用觀察細(xì)胞及細(xì)胞器的形態(tài)-實際操作5幾個重要的

2、分辨率人眼：0.2mm光學(xué)顯微鏡：0.2um電子顯微鏡：0.2nm61.顯微鏡的發(fā)展1.1 人眼：人眼觀察物體的能力是有限的。一般的情況下，在25cm的明視距離內(nèi)，人眼只能分辨相距0.1-0.2mm的兩個物體。也就是說，當(dāng)兩個物體相距不到0.1mm的時候，人眼就會把它們看成是一個物體了。這個極限便稱為人眼的分辨本領(lǐng)。 7 1.2 放大鏡：約在四百年前眼鏡片工匠們開始磨制放大鏡。當(dāng)時的放大鏡的放大倍數(shù)只有35x 1.3 顯微鏡： 1590年，荷蘭和意大利的眼鏡制造者造出類似顯微鏡的放大儀器。 16731677年期間，列文胡克制成單組元放大鏡式的高倍顯微鏡 19世紀(jì)70年代，德國人阿貝奠定了顯微鏡

3、成像的古典理論基礎(chǔ)。 1850年出現(xiàn)了偏光顯微術(shù)； 1893年出現(xiàn)了干涉顯微術(shù)； 1935年荷蘭物理學(xué)家澤爾尼克創(chuàng)造了相襯顯微術(shù)， 89 1611年，德國天文學(xué)家開普勒用兩片雙凸透鏡分別作為物鏡和目鏡，使放大倍數(shù)有了明顯的提高，以后人們將這種光學(xué)系統(tǒng)稱為開普勒式望遠(yuǎn)鏡。人們用的折射式望遠(yuǎn)鏡還是這兩種形式，天文望遠(yuǎn)鏡一般是采用開普勒式。 10羅伯特虎克制造的顯微鏡（1665）放大倍數(shù)：140倍 11121314152 顯微鏡的光學(xué)原理折射和折射率 光線在均勻的各向同性介質(zhì)中，兩點之間以直線傳播，當(dāng)通過不同密度介質(zhì)的透明物體時，則發(fā)生折射現(xiàn)象，這是由于光在不同介質(zhì)的傳播速度不同造成的。16 2.2

4、凸透鏡的五種成象規(guī)律(1) 當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距以外時，則在象方二倍焦距以內(nèi)、焦點以外形成縮小的倒立實象； (2) 當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距上時，則在象方二倍焦距上形成同樣大小的倒立實象； (3) 當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距以內(nèi)，焦點以外時，則在象方二倍焦距以外形成放大的倒立實象； (4) 當(dāng)物體位于透鏡物方焦點上時，則象方不能成象； (5) 當(dāng)物體位于透鏡物方焦點以內(nèi)時，則象方也無象的形成，而在透鏡物方的同側(cè)比物體遠(yuǎn)的位置形成放大的直立虛象。17顯微鏡的成像原理 顯微鏡和放大鏡起著同樣的作用，就是把近處的微小物體成一放大的像，以供人眼觀察。只是顯微鏡比放大鏡可以具有更高的放大率而已。

5、 物體位于物鏡前方，離開物鏡的距離大于物鏡的焦距，但小于兩倍物鏡焦距。所以，它經(jīng)物鏡以后，必然形成一個倒立的放大的實像AB。 AB靠近F2的位置上。再經(jīng)目鏡放大為虛像AB后供眼睛觀察。目鏡的作用與放大鏡一樣。所不同的只是眼睛通過目鏡所看到的不是物體本身，而是物體被物鏡所成的已經(jīng)放大了一次的像。 18193 顯微鏡的幾個基本概念3.1 光源：能發(fā)射光波的物體。 可見光頻率范圍：7.51014 - 3.91014 Hz。 真空中對應(yīng)的波長范圍：390nm 760nm 相應(yīng)光色：紫、藍(lán)、青、綠、黃、橙、紅203.2分辨率(鑒別距離)：顯微鏡能分辨的最小距離，用D表示。顯微鏡的鑒別距離越小，分辨率越高

6、。 D=0.61/ nsin D：分辨率 :光波的波長 N:介質(zhì)折射率 :物鏡鏡口角3.3孔徑角：由標(biāo)本上一點發(fā)出的進(jìn)入物鏡最邊緣光線L和進(jìn)入物鏡中心光線OA之間的夾角稱為孔徑角。3.4數(shù)值孔徑：NA = nsin , 叫物鏡的數(shù)值孔徑。 數(shù)值孔徑與顯微鏡的分辨率有密切關(guān)系，越短，NA越大，分辨率越高。21物鏡數(shù)值孔徑22 在顯微鏡下所看到的物像和實際物體之間的大小比例叫顯微鏡的放大率或放大倍數(shù)。顯微鏡下物像的放大主要由物鏡、鏡筒長度、目鏡所決定。適合的放大倍數(shù)決定于物鏡的數(shù)值孔徑，一船應(yīng)為數(shù)值孔徑的5001000倍。顯微鏡的總放大率（Mt)應(yīng)為：Mt=MobMeMob：物鏡放大率Me：目鏡放

7、大率3.6放大率23像差球差象散慧差場曲負(fù)畸變正畸變24色差25色差校正263.7焦點深度 在顯微鏡的光軸上有一段距離范圍內(nèi)物體被看得清晰。超出這段距離的物體就模糊不清。這段距離位于顯微鏡焦點的上下很小的范圍之內(nèi)。這段距離的上下限叫焦點深度。27焦點深度283.8視場數(shù) 目鏡中觀察到的物像的一定范圍叫視野。 顯微鏡的總放大率小的時候所能看到的標(biāo)本的范圍大，而總放大率愈大所能看到的標(biāo)本的局部愈小。所以說視野與顯微鏡的總放大率成反比。 在同一總放大率的條件下視野也可有大小差別。這種差別決定于目鏡的某些性能。首先目鏡的視場光欄的直徑是最主要的條件。視場光欄的直徑叫目鏡的視場數(shù)值293.9工作距離 工

8、作距離也叫物距，即指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離。 在物鏡數(shù)值孔徑一定的情況下，工作距離短孔徑角則大。 數(shù)值孔徑大的高倍物鏡，其工作距離小。 30提高顯微鏡分辨率的方法：（1）增大物鏡的數(shù)值孔徑在物鏡和蓋玻片之間充以n 較大的油，如香柏油n =1.52,不僅使n 增大，而且孔徑角 也增大。（2）用短波長的光照射如紫外光顯微鏡，電子顯微鏡。314 顯微鏡的結(jié)構(gòu)組成光學(xué)放大系統(tǒng)照明系統(tǒng)機械和支架系統(tǒng)物鏡光源折光鏡聚光鏡濾光片目鏡32光學(xué)顯微鏡基本結(jié)構(gòu)：1. 照明燈(Lamp)2. 聚光器(Condenser)3. 載物臺和切片夾(Mechanical stage and specimen

9、retainer)4. 推進(jìn)器(Mechanical stage adjustment knob)5. 物鏡(Objectives)6. 粗細(xì)螺旋(Course and fine focus knob)7. 目鏡(Oculars)8. 照相機等接口(Connection to camera, etc.)33344.1物鏡 物鏡(objective)是光學(xué)顯微鏡成像系統(tǒng)中決定其分辨率或叫分辨本領(lǐng)的最關(guān)鍵部件。 (1)消色差物鏡(achromat) 色差校正使可見光中紅光和藍(lán)光聚焦于一點，而黃綠光則聚焦于另一點。能夠消除光譜中紅光和藍(lán)光所形成的色差。這種物鏡與目鏡配用時可達(dá)到消色差物鏡所要求的光學(xué)

10、性能。 (2)復(fù)消色差物鏡(apochromat) 是性能最高的物鏡。能消除可視光中黃、紅、藍(lán)即包括幾乎所有譜線在成像過程中所造成的色差。35 (3)平象物鏡 它們所成的影象基本上是平的，象場彎曲很小，不會發(fā)生視野中心與邊緣不能同時準(zhǔn)焦的現(xiàn)象，因此對目視觀察及顯微攝影都極為方便。平象物鏡由于將彎曲的影象展平，在同樣放大倍數(shù)下它成的影象比用一般物鏡要大一點。在平象物鏡的金屬外框上，刻有Flanachr、 planapo、 plan 等字樣。 (4)相差物鏡 相差物鏡(Phasencontrast objective)的一個透鏡片上噴涂著一層環(huán)狀金屬膜板叫相位板。相位板是相差顯微鏡的關(guān)鍵部件。它和

11、相差顯微鏡的聚光鏡上的的環(huán)狀光欄相配合使用。有關(guān)位相板涂料的性質(zhì)和作用原理在以后詳述。 外殼上刻有Ph標(biāo)記 36物鏡結(jié)構(gòu)37物鏡殼上的標(biāo)志：(1)物鏡的種類APO(復(fù)消色差物鏡)FL(螢石物鏡或半復(fù)消色差物鏡) PL(平場物鏡)PLFL(平場螢石物鏡）PLAPO(平場復(fù)消色差物鏡)38 2)放大倍數(shù)用數(shù)字表示，如4、10、20、40和100等。(3)數(shù)值孔徑（NA）如100.25，400.65和1001.3(4)標(biāo)準(zhǔn)機械筒長 160mm、170mm或(5)需用蓋片情況1600.17 1600或160-；0或-39物鏡標(biāo)識404.2目鏡 目鏡的作用是把物鏡放大的實象再放大一級，并把物象映入觀察者

12、的眼中，實質(zhì)上目鏡就是一個放大鏡。顯微鏡的分辨率能力是由物鏡的數(shù)值孔徑所決定的，而目鏡只是起放大作用。對于物鏡不能分辨出的結(jié)構(gòu)，目鏡放的再大，也仍然不能分辨出。4.3聚光鏡 聚光鏡裝在載物臺的下方。小型的顯微鏡往往無聚光鏡，在使用數(shù)值孔徑0.40以上的物鏡時，則必須具有聚光鏡。聚光鏡不僅可以彌補光量的不足和適當(dāng)改變從光源射來的光的性質(zhì)，而且將光線聚焦于被檢物體上，以得到最好的照明效果。41 聚光鏡光欄 所謂光欄，從廣義的角度可指一切限制入射光束截面的框孔都可認(rèn)為光欄。 聚光鏡光欄作用 （1）改變聚光鏡的數(shù)值孔徑以便與物鏡的數(shù)值孔徑相匹配，可調(diào)整圖象的分辨率和反差。 （2）輔助調(diào)整亮度。4243

13、5 光學(xué)顯微鏡的使用實驗時要把顯微鏡放在座前桌面上稍偏左的位置，鏡座應(yīng)距桌沿 67 cm左右。打開光源開關(guān)，調(diào)節(jié)光強到合適大小。轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器，使低倍鏡頭正對載物臺上的通光孔。 將所要觀察的玻片放在載物臺上，使玻片中被觀察的部分位于通光孔的正中央。先用低倍鏡觀察（4X）。觀察之前，先轉(zhuǎn)動粗動調(diào)焦手輪，使載物臺上升，物鏡逐漸接近玻片。需要注意，不能使物鏡觸及玻片，然后，通過目鏡觀察，并轉(zhuǎn)動粗調(diào)焦手輪，使載物臺慢慢下降，直到看清物像。44如果像偏離視野，可慢慢調(diào)節(jié)載物臺移動手柄。瞳距調(diào)節(jié)：左右推拉目鏡，使兩目鏡距離與自己兩眼距離相等。高倍物鏡觀察：把物像中需要放大觀察的部分移至視野中央。將高倍物鏡

14、轉(zhuǎn)入光路（一般具有正常功能的顯微鏡，低倍物鏡和高倍物鏡基本齊焦，在用低倍物鏡觀察清晰時，換高倍物鏡應(yīng)可以見到物像，但物像不一定很清晰），微動調(diào)焦手輪進(jìn)行調(diào)節(jié)。根據(jù)需要調(diào)節(jié)孔徑光闌的大小或聚光器的高低，使光線符合要求（一般將低倍物鏡換成高倍物鏡觀察時，視野要稍變暗一些，所以需要調(diào)節(jié)光線強弱）。45瞳距調(diào)節(jié)46屈光度調(diào)節(jié)47光學(xué)顯微鏡的維護(hù) 顯微鏡要輕拿輕放。嚴(yán)禁將表面有水的載片放到顯微鏡上。從低倍轉(zhuǎn)入高倍應(yīng)能看到圖象，否則需轉(zhuǎn)入低倍另行調(diào)節(jié)、查找原因。每次使用完畢后將將光源亮度調(diào)至最低。臨時不用顯微鏡只需將光源亮度調(diào)至最低而無需關(guān)閉。忌頻繁開關(guān)顯微鏡電源。鏡頭臟污只能用專用工具經(jīng)專門程序清洗。使

15、用完畢等燈箱冷卻后罩上防塵罩或放入箱內(nèi)，并存于干燥無塵處。48觀察細(xì)胞及細(xì)胞器的形態(tài)口腔上皮細(xì)胞49洋蔥表皮鱗狀細(xì)胞50植物和動物細(xì)胞形態(tài)差別動植物細(xì)胞都可以觀察到細(xì)胞核動物細(xì)胞沒有細(xì)胞壁（形狀不規(guī)則）植物細(xì)胞具有細(xì)胞壁（形狀較為規(guī)則）51洋蔥根尖細(xì)胞52細(xì)胞有絲分裂根據(jù)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，將有絲分裂人為地劃分為6個時期：前期(prophase)、前中期(premetaphase)、中期(metaphase)、后期(anaphase)和末期(telophase)、胞質(zhì)分裂。53前期Prophase（1）染色質(zhì)(chromatin)凝縮成染色體(由兩條染色單體組成)；（2）中心體(centros

16、ome)移向兩極，分裂極確立，紡錘體(spindle)開始裝配；（3）核仁(nucleonus)消失，核被膜裂解；前中期Prometaphase（1）染色體進(jìn)一步凝集濃縮，變粗變短；（2）紡錘體形成，紡錘絲捕獲染色體，并拉動染色體向紡錘體赤道面移動。54中期metaphase（1）所有染色體排列到赤道板(equatorial plate)；（2）紡錘體呈典型的紡錘樣，位于染色體兩側(cè)的動粒微管長度相等，作用力均衡。后期anaphase中期染色體的兩條染色單體相互分離，形成子代，并分別向兩極運動。(1)后期Aanaphase A:動粒微管縮短，拉動染色單體移向兩極；(2)后期Banaphase B:極性微管延長，兩極間距離逐漸增長；55末期telophase（1）色單體到達(dá)兩極，并開始去濃縮變成染色質(zhì)，核仁重新出現(xiàn)，核膜開始重新裝配，形成子代細(xì)胞核；（2）動粒微管消失，