細(xì)菌內(nèi)毒素檢查實(shí)驗(yàn)技術(shù)和應(yīng)用

1、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查實(shí)驗(yàn)技術(shù)和應(yīng)用2007-9-10Bitab1目 錄一、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的基礎(chǔ)理論-3二、 BET試驗(yàn)前的準(zhǔn)備-24三、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的實(shí)驗(yàn)技術(shù)-281，鱟試劑靈敏度復(fù)核-332，干擾初篩試驗(yàn)-403，干擾試驗(yàn)-494，檢查法-62四、細(xì)菌內(nèi)毒素檢測技術(shù)的發(fā)展Bitab22007-9-10一、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的基礎(chǔ)理論1，細(xì)菌內(nèi)毒素2，鱟試劑3，BET用水4，BET程序5，2005年版細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法6，相關(guān)參數(shù)的計(jì)算7，試驗(yàn)的相關(guān)知識(shí)Bitab32007-9-101、細(xì)菌內(nèi)毒素1）化學(xué)成分及特性 - 革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的產(chǎn)物 - 是高分子量脂多糖復(fù)合物（LPS） 除上述性質(zhì)外，LP

2、S還有許多其他的生物活性Bitab42007-9-10致熱性耐熱性酸堿性與鱟試劑反應(yīng)分子極性需要在250攝氏度干熱至少3060分鐘才能徹底滅活多糖鏈有親水性，脂肪鏈具有疏水性，在水中呈不均勻分布內(nèi)毒素作用于人體細(xì)胞，使之釋放內(nèi)原性熱原，再刺激下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞，引起發(fā)熱反應(yīng)與鱟試劑發(fā)生多級(jí)酶促反應(yīng)，形成凝膠與強(qiáng)酸強(qiáng)堿水解反應(yīng)（1）特性Bitab52007-9-10內(nèi)毒素的分子結(jié)構(gòu)（2）化學(xué)結(jié)構(gòu) - 含有3個(gè)截然不同的區(qū)域O- 特異側(cè)鏈核心多糖類脂A2） 內(nèi)毒素與熱原的關(guān)系 - 內(nèi)毒素是熱原之一種- 醫(yī)藥工業(yè)接受的觀點(diǎn)是，內(nèi)毒素是目前醫(yī)藥工業(yè)中最普遍和最主要的外源性熱原，控制內(nèi)毒素污染就等于控制

3、熱原污染。3）標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素和環(huán)境內(nèi)毒素1）標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素經(jīng)人工提取精制并經(jīng)生物效價(jià)測定的細(xì)菌內(nèi)毒素，作為BET檢查的參考品或?qū)φ掌?。主要分參考?biāo)準(zhǔn)品（RSE）及工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）。CSE的效價(jià)必須用RSE來標(biāo)化。目前CSE的效價(jià)有兩種標(biāo)示方法：固定效價(jià)法（中國）及浮動(dòng)效價(jià)法（國際）。2）環(huán)境內(nèi)毒素天然產(chǎn)生的內(nèi)毒素，普遍存在于水、空氣及各種原料中，成分除了脂多糖外還含有較多的蛋白質(zhì)、多糖和其他雜質(zhì)，其極性不明顯，致熱性較標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素弱。BET的對象是環(huán)境內(nèi)毒素。Bitab62007-9-104）標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液（C溶液）的制備1）中國藥典2005年版的BET法規(guī)定，將細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

4、用水溶解后，需在旋渦混合器上混勻15分鐘，以后每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30秒鐘，其他國家藥典都有類似要求- 具有極性的內(nèi)毒素分子在水中呈現(xiàn)不均勻分布Bitab72007-9-102、鱟試劑1）鱟試劑的分類 - 根據(jù)鱟的種類分類 美洲鱟試劑(LAL) 中國鱟試劑或東方鱟試劑（TAL） - 根據(jù)檢查方法分類 凝膠法鱟試劑 光度法鱟試劑 - 根據(jù)鱟試劑的反應(yīng)特異性分類 普通鱟試劑 特異型鱟試劑Bitab82007-9-102）鱟試劑的規(guī)格 - 一般分單次試驗(yàn)試劑和多次試驗(yàn)試劑（也稱大裝量試劑）- 把自身的包裝容器作為反應(yīng)管的試劑稱為單次試驗(yàn)試劑，在國內(nèi)使用的支的鱟試劑就屬于單次試驗(yàn)試劑- 多

5、次試驗(yàn)試劑有支、支等，使用時(shí)應(yīng)先用相應(yīng)量的溶解液復(fù)溶鱟試劑。Bitab92007-9-103）鱟試劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) - 靈敏度 定義：再細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定的條件下，能使鱟試劑產(chǎn)生凝集的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的最低濃度，單位EU/ml。 常用鱟試劑的靈敏度：、 、 、 、- 自身凝集 部頒標(biāo)準(zhǔn)，鱟試劑的陰性對照在37度4小時(shí)不產(chǎn)生凝集反應(yīng)- 緩沖能力- 干燥失重- 無菌：中國標(biāo)準(zhǔn)無此項(xiàng)要求Bitab102007-9-104）鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)機(jī)理Bitab112007-9-10C因子活化的C因子內(nèi)毒素活化的B因子B因子凝固酶凝固酶原凝固蛋白（凝膠）凝固蛋白原葡聚糖或LAL-RM活化的G因子G因子二價(jià)陽離子A

6、C-lle-Glu-Ala-Arg-pNA（酶作用物）AC-lle-Glu-Ala-Arg-OHpNA405nm測吸光度值（對硝基苯胺 黃色）3、BET用水2000年版藥典要求，BET用水應(yīng)為與或更高靈敏度的鱟試劑在371條件下24小時(shí)不產(chǎn)生凝集反應(yīng)的滅菌注射用水。2005年版藥典要求，凝膠法BET用水應(yīng)為內(nèi)毒素含量小于的滅菌注射用水；光度測定法用的BET用水內(nèi)毒素含量應(yīng)少于。美國藥典要求的BET用水是指與所使用的鱟試劑不發(fā)生反應(yīng)的滅菌注射用水或其他水。Bitab122007-9-104、BET程序1）驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?zāi)z法光度測定法2）檢查法 凝膠法光度測定法 動(dòng)態(tài)法 終點(diǎn)法：終點(diǎn)比色法試驗(yàn)Bita

7、b132007-9-10靈敏度的復(fù)核試驗(yàn)干擾試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗(yàn)干擾試驗(yàn)?zāi)z限量試驗(yàn) 凝膠半定量試驗(yàn) 動(dòng)態(tài)比濁法試驗(yàn)動(dòng)態(tài)比色法試驗(yàn)動(dòng)態(tài)終點(diǎn)法5、中國藥典2005年版細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法1）綜述部分細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的定義及BET方法學(xué)分類內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品及檢查用水BET器具的要求供試品溶液的要求內(nèi)毒素限值的確定最大有效稀釋倍數(shù)的計(jì)算Bitab142007-9-10 2）試驗(yàn)部分（1）凝膠法鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)干擾試驗(yàn)檢查法（2）光度測定法標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)干擾試驗(yàn)檢查法Bitab152007-9-103）2005年版藥典BET法際驗(yàn)部分主要內(nèi)容凝膠限量試驗(yàn)?zāi)z半定量試驗(yàn)鱟 試 驗(yàn) 方 法凝膠法光度測

8、定法限量法半定量法動(dòng)態(tài)法終點(diǎn)法動(dòng) 態(tài)濁度法動(dòng) 態(tài)顯色法終 點(diǎn)濁度法終 點(diǎn) 顯色法靈敏度以標(biāo)示靈敏度表示以標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度表示預(yù)試驗(yàn)1靈敏度復(fù)核試驗(yàn)各濃度平行4管, NC 2管標(biāo)準(zhǔn)曲線驗(yàn)證試驗(yàn)各濃度平行3管，NC 2管有效條件D陰性0.5c2 | |0.980 TDTC（對動(dòng)態(tài)法而言）預(yù)試驗(yàn)2干擾試驗(yàn)干擾試驗(yàn)無干擾條件A、D陰性 0.5Es2 0.5EsEt2Es | |0.980 50%R200%TDTC檢查法A、B、C、D各平行2管(共8管)A、B、C、D各平行2管(共12管)有效條件 B、C陽性 D陰性 | |0.980 50%R200%TDTC2007-9-10Bitab16 1）內(nèi)毒素

9、限值 （1）藥品、生物制品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）一般按以下公式確定：L=K/ML為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，以EU/ml、EU/mg(活性單位)表示；K為人每公斤體重每小時(shí)科接受的最大內(nèi)毒素劑量，以EU/(kgh)表示，注射劑K=5 EU/(kgh),放射性藥品注射劑K=2 EU/(kgh),鞘內(nèi)用注射劑K=0.2 EU/(kgh), M為人每公斤體重每小時(shí)的最大供試品劑量，以ml/(kgh)、mg/(kgh)、 U/(kgh)表示，人均體重按60Kg計(jì)算，注射試劑若不足1小時(shí)，按1小時(shí)計(jì)算。Bitab172007-9-106、相關(guān)參數(shù)的計(jì)算（2）內(nèi)毒素限值計(jì)算舉例 - 注射用的頭孢曲松鈉舒巴坦

10、鈉，成人最大劑量為1500mg/次 - 注射用人頭孢孟多酯鈉，成人每日劑量為至，分3至4次給藥，一日最高劑量不超過12g - 對于大輸液（LVP）,美國藥典（USP）通常都取L值為Bitab182007-9-10 5 EU/(kgh)1500 mg/(60kgh)5 EU/(kgh)(12000mg/3) / (60kgh)2）最大有效稀釋倍數(shù) - 供試品最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）按以下公式計(jì)算 MVD=CL/ C為供試品溶液的濃度，其中當(dāng)L以EU/ml表示時(shí)，C為1.0ml/ml;當(dāng)L以EU/mg或EU/U表示時(shí),C的單位為mg/ml或 U/ml。凝膠發(fā)中，為鱟試劑的靈敏度光度測定法中，為標(biāo)

11、準(zhǔn)曲線最低濃度- 如使用鱟試劑靈敏度為，注射用頭孢曲松鈉舒巴鈉（濃度為）的最大有效稀釋倍數(shù)為 MVD= =8 (倍)Bitab192007-9-103）最低有效稀釋濃度(MVC) - MVC=/ L - 如使用鱟試劑靈敏度為，注射用頭孢曲松鈉舒巴鈉的最低有效濃度為 4) 樣品稀釋過程中加液量的計(jì)算 - 稀釋過程中，假設(shè)從溶液S1取（x）ml溶液稀釋（n）倍至S2，加液量為（y）,則滿足： y= (n-1) X x - 如從溶液S1取稀釋倍至S2,則加液量為： 即的S1加稀釋液即得S1的倍稀釋液S2Bitab202007-9-107、試驗(yàn)相關(guān)知識(shí)1) 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的使用（1）復(fù)溶 - 復(fù)溶2ml

12、安瓿裝的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，為了避免溶液再混合時(shí)溢出安瓿，我們建議在安瓿頸部上方開口加液。復(fù)溶液的體積一般為1ml,或根據(jù)使用說明書加液。（2）效價(jià)- 廠家必須向用戶提供一份效價(jià)分析證書（Certificate of Analysis,CoA）效價(jià)分析證書應(yīng)注明：RSE/CSE _EU/mg; _ng/瓶Bitab212007-9-102) 鱟試劑的使用 - 使用前，應(yīng)將鱟試劑置于室溫環(huán)境下使其大道室溫溫度鱟再復(fù)溶使用 - 復(fù)溶鱟試劑鱟，應(yīng)避免強(qiáng)烈振動(dòng)產(chǎn)生泡沫 - 由于鱟試劑與內(nèi)毒素凝集反應(yīng)的不可逆性，反應(yīng)過程中必須避免反應(yīng)試管的振動(dòng)造成假陽性3）內(nèi)毒素的清除（1） 沖洗適用于器械組件、塞子等可用于

13、加熱等方法提高清除效率（2）蒸餾，折流系統(tǒng)和地心引力阻止大分子量的LPS轉(zhuǎn)變?yōu)檎羝麪顟B(tài)逸出（3）反滲透 （4） 超濾 （5）活性炭吸附Bitab222007-9-104）內(nèi)毒素的滅活（1） 酸/堿水解（2）氧化 - H2O2（3）干熱 - 250，30分鐘的干烤Bitab232007-9-10二、BET試驗(yàn)前的準(zhǔn)備1. 在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)中，凡是與試驗(yàn)樣品或試劑接觸的器具必須經(jīng)過除熱原處理。玻璃器皿一般用洗液浸泡4小時(shí)后，用自來水沖洗，再用真餾水沖洗、晾干。最后在280干烤至少120分鐘。Bitab242007-9-10Bitab252007-9-102. 試驗(yàn)所試用的器具主要包括有：無熱原

14、稀釋管無熱原玻璃移液管無熱原玻璃毛細(xì)管稀釋試管架安瓿試管架反應(yīng)試管架可調(diào)移液器連接膠粒無熱原吸頭安瓿開啟器70%的異丙醇浸泡的無紡布拭布Bitab262007-9-103. 實(shí)驗(yàn)中也可用一次性的無熱原塑料器械。如用可調(diào)移液器和無熱原吸頭代替無熱院玻璃移液管取液等。在使用可調(diào)移液器連接無熱原毛細(xì)管吸取微量溶液時(shí)，采用多吸少打方式。避免由于毛細(xì)管的虹吸作用帶來的加樣誤差；也可避免微量加樣時(shí)產(chǎn)生氣泡。Bitab272007-9-104. 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查實(shí)驗(yàn)的恒溫反應(yīng)在37的恒溫器中進(jìn)行。TAL-40型試管恒溫儀（安度斯設(shè)計(jì)生產(chǎn)），專門用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的恒溫儀器。具有A, 溫度穩(wěn)定；B, 加熱均勻；

15、C, 定時(shí)報(bào)警等特點(diǎn)三、凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查技術(shù)1，凝膠法BET試驗(yàn)程序2，試驗(yàn)器具3，鱟試劑靈敏度復(fù)核4，干擾初篩試驗(yàn)5，干擾試驗(yàn)6，檢查法Bitab282007-9-101、凝膠法BET的實(shí)驗(yàn)程序1）試驗(yàn)準(zhǔn)備：試劑、儀器及實(shí)驗(yàn)用具等2）確定供試品的內(nèi)毒素限值（L）3）選擇鱟試劑（）4）計(jì)算供試品的最大有效稀釋（MVD）或最低有效濃度（MVC）5）鱟試劑靈敏度復(fù)核6）供試品干擾初篩試驗(yàn)（建議試驗(yàn)）7）供試品干擾驗(yàn)證試驗(yàn)8）供試品日常檢查Bitab292007-9-102、試驗(yàn)器具1）器具的要求及處理-玻璃器皿需除熱原處理，以除去可能存在的外源性內(nèi)毒素，常用方法是玻璃器皿經(jīng)清洗后250至少干烤

16、1小時(shí) -塑料器械應(yīng)選用標(biāo)明無內(nèi)毒素并且對試驗(yàn)無干擾的器械 -首選硼硅酸鹽玻璃器具或同等作用的聚苯乙烯塑料器具2）孵育反應(yīng)儀器溫度精確：370.2 發(fā)熱均勻：0.1 可定時(shí)提示：0至90分鐘可設(shè)定定時(shí)蜂鳴提示試管免封口Bitab302007-9-103 、鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)1）鱟試劑靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)?zāi)康?）驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室的條件是否滿足BET實(shí)驗(yàn)的要求2）驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)人員的操作技能是否滿足BET實(shí)驗(yàn)的要求 3）驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所用試劑（包括鱟試劑、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品、BET用水等）是否滿足BET實(shí)驗(yàn)的要求2）鱟試劑靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)的步驟1）恒溫儀器預(yù)熱2）C溶液（標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液）的制備3）鱟試劑制備4）加樣及恒溫反應(yīng)5

17、）結(jié)果判斷6）數(shù)據(jù)處理Bitab312007-9-10Bitab322007-9-10稀釋為2、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液C溶液反應(yīng)：0.1mlCSE(RSE)，平行4管D溶液反應(yīng)：水，平行2管單次管：原安瓿多次管：反應(yīng)試管輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)瓶壁搖勻每步稀釋于旋渦混合器混合30s旋渦混合器混合15min混勻混合BET水復(fù)溶BET水復(fù)溶RSE或CSE鱟試劑TAL371，60min2min混勻（水浴恒溫需封口）3）操作步驟示意圖4）靈敏度復(fù)核試驗(yàn)舉例 (1) 試劑Bitab332007-9-10試劑名稱 廠 家規(guī)格標(biāo)示效價(jià)數(shù) 量TAL 安度斯0.1ml/支 0.25EU/ml18內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品CSE 安度斯10ng/瓶

18、10EU/ng1BET水 安度斯50ml/瓶 0.003EU/ml1（2）實(shí)驗(yàn)前，將恒溫儀器預(yù)熱至37（3）標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液（C溶液）的制備Bitab342007-9-100.25EU/ml30s30s1EU/ml30s5min2.0ml100EU/ml0.4mlCSEBET水1.0ml10EU/ml0.4ml3.6ml0.5EU/ml2.0ml3.6ml2.0ml2.0ml0.125EU/ml30s2.0ml2.0ml0.06EU/ml30s2.0ml2.0ml（4）鱟試劑的準(zhǔn)備取裝量，靈敏度為的鱟試劑18支，在安瓿頸部折斷，按照陰性對照溶液D兩支，標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液每濃度平行4管排列： 用精確移

19、液器準(zhǔn)確吸取水分別加入每支鱟試劑中，使鱟試劑全部溶解Bitab352007-9-10陰性對照溶液D 用精確移液器分別吸取的、 、 、的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液，加入已復(fù)溶的鱟試劑中，每平行4管，吸取用水（D溶液）加入另外兩支鱟試劑內(nèi)，作為陰性對照。Bitab362007-9-10CSETAL0.1ml0.5EU/ml0.1ml0.1ml0.25EU/ml0.1ml0.1ml0.125EU/ml0.1ml0.1ml0.06EU/ml0.1ml0.1mlNC0.1ml（5）加 樣加樣順序一般從低濃度到高濃度（6）恒溫反應(yīng) - 將加樣完的混合液輕輕搖勻（避免產(chǎn)生氣泡），放入371 的恒溫器中孵育602分鐘（孵

20、育過程中避免振動(dòng)影響凝膠形成） -若保溫裝置是水浴恒溫箱，那么在加樣后需將反應(yīng)管封口，避免水蒸氣進(jìn)入反應(yīng)管內(nèi)造成污染。的混合液需封口后再將其放入水浴中恒溫反應(yīng)Bitab372007-9-10 （6）結(jié)果判斷將反應(yīng)試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180，若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性，記錄為“”；未形成凝膠或形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形并從管壁滑脫者為陰性，記錄為“-”。Bitab382007-9-10 陽性陰性結(jié)果判斷：反應(yīng)管緩緩倒轉(zhuǎn)180 陽性(+)：凝膠不變形，不從管壁滑脫者陰性(-)：凝膠不能保持完整，從管壁滑脫者實(shí)驗(yàn)符合要求的基本條件： NC管全部陰性 （） 2管全部陽

21、性 （） 管全部陰性 （）（7）數(shù)據(jù)處理c =lg-1（X/4） =lg-1(0.903)(0.602)(0. 602)(0. 602)/4即在本批號(hào)鱟試劑的復(fù)核靈敏度（ c ）為藥典要求：c在 （包括和2）時(shí)，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示靈敏度為該批鱟試劑的靈敏度值。結(jié)論：本批TAL的靈敏度標(biāo)示值符合規(guī)定，按標(biāo)示值使用! Bitab392007-9-10平行管C溶液(EU/ml)D溶液反應(yīng)終點(diǎn)濃度X（lg反應(yīng)終點(diǎn)濃度）0.50.250.1250.0610.1250.90320.250. 60230.250. 60240.250. 6024、干擾初篩試驗(yàn)1）目的及原理： -本試驗(yàn)是藥品與鱟

22、試劑相容性的篩選試驗(yàn)，通過對一系列含2內(nèi)毒素濃度的樣品溶液與鱟試劑的反應(yīng)，初步篩選出對鱟試驗(yàn)無干擾的濃度。 -本試驗(yàn)可減少干擾試驗(yàn)的盲目性2）試驗(yàn)步驟 供試品限值的確定 供試品最大有效稀釋倍數(shù)的確定 試劑的選擇 反應(yīng)溶液的制備 加樣及反應(yīng) 結(jié)果判斷Bitab402007-9-10 （1）供試品限值 -硫酸慶大霉素，100ml/瓶，20000U/ml； -藥典要求，硫酸慶大霉素限值（2）最大有效稀釋倍數(shù)的確定 -最大有效稀釋倍數(shù)MVD=cL/； -使用靈敏度的鱟試劑時(shí)， MVD0.5= =20 倍 -由此可計(jì)算出使用不同時(shí)所對應(yīng)的MVD:Bitab412007-9-103) 干擾初篩試驗(yàn)舉例 靈

23、敏度（EU/ml）0.50.250.1250.060.03對應(yīng)的MVD(倍)204080160320試劑名稱 廠 家規(guī)格標(biāo)示效價(jià)數(shù) 量TAL 安度斯0.1ml/支 0.25EU/ml24內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品CSE 安度斯10ng/瓶 10EU/ng1BET水 安度斯50ml/瓶 0.003EU/ml1Bitab422007-9-10 -由此可計(jì)算出使用不同時(shí)所對應(yīng)的MVD:（3）試劑 （4）各反應(yīng)溶液的制備 溶液編號(hào)AD溶液內(nèi)容 S20 S40 S80 S160 S320W平行管溶液編號(hào)BC溶液內(nèi)容 S20 E2 S40 E2 S80 E2 S160 E2 S320 E2 E2 平行管Bitab432

24、007-9-10溶液C的制備E100 E10 E1 E溶液A的制備S原液 S10 S20 S40 S80 S160 S320Bitab442007-9-103.6ml W3.6ml W0.5ml W3.6ml W1ml1.4ml W 1ml W1.4ml W1.4ml W1.4ml W溶液C: E 2 溶液ABitab452007-9-10溶液B的制備E1 E1 E1 S20 E0.5 S40 E0.5 S80 E S10 S20 S40 E1 E1 S160 E0.5 S320 ES80 S160 注意事項(xiàng)：制備溶液C和B時(shí)，每一步的混合液需在旋渦混合器上混合至少30秒 Bitab46200

25、7-9-10 （5）加樣及反應(yīng) 用移液器準(zhǔn)確吸取水將鱟試劑復(fù)溶 取相應(yīng)溶液C、B、A加入鱟試劑反應(yīng)管，每濃度平行2管 另外取水作為陰性對照溶液D加入鱟試劑反應(yīng)管 （4）結(jié)果判斷 溶液編號(hào)AD溶液內(nèi)容 S20 S40 S80 S160 S320W平行管溶液編號(hào)BC溶液內(nèi)容 S20 E2 S40 E2 S80 E2 S160 E2 S320 E2 E2 平行管Bitab472007-9-10-+-+-+-Bitab482007-9-10-當(dāng)溶液A、D均為陰性；溶液C均為陽性時(shí)，試驗(yàn)有效。-溶液B系列中，第一個(gè)出現(xiàn)陽性結(jié)果的濃度即初步將其判斷為樣品的無干擾濃度。本試驗(yàn)中的樣品無干擾濃度為S405 、

26、干擾試驗(yàn)Bitab492007-9-10 - 通過比較鱟試劑與內(nèi)毒素在水溶液和供試品溶液中反應(yīng)的差異程度，來確定供試品在該濃度下是否對BET檢查有干擾。 - 至少對3批樣品進(jìn)行干擾試驗(yàn)。 1）試驗(yàn)步驟： - 供試品限值的確定。 - 鱟試劑的選擇 - 最大有效稀釋倍數(shù)的確定 - 反應(yīng)溶液的制備 - 加樣及反應(yīng) - 結(jié)果判斷何種情況下要做干擾試驗(yàn)？ 干擾試驗(yàn)是一個(gè)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)新品種建立BET方法鱟試劑的來源改變鱟試劑的配方、生產(chǎn)工藝改變供試品的來源改變供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了其它任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化Bitab502007-9-10 試劑名稱 廠 家規(guī)格標(biāo)示效價(jià)數(shù) 量TAL 安

27、度斯0.1ml/支 0.125EU/ml36內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品CSE 安度斯10ng/瓶 10EU/ng（CoA）1BET水 安度斯25ml/瓶 0.003EU/ml1Bitab512007-9-10（1）供試品限值 - 硫酸慶大霉素，20000U/ml； 藥典要求內(nèi)毒素限值（2）試劑選擇 Bitab522007-9-10 - 根據(jù)干擾初篩試驗(yàn)的結(jié)果，供試品在40倍稀釋（對應(yīng)鱟試劑靈敏度為）時(shí)無干擾。 - 一般不選擇第一個(gè)出現(xiàn)陽性結(jié)果的供試品濃度作干擾試驗(yàn)。本試驗(yàn)我們選擇靈敏度為的鱟試劑進(jìn)行干擾驗(yàn)證試驗(yàn)。（3）最大有效稀釋倍數(shù)的計(jì)算 MVD = cL/ =80（倍） MVD- = 80(倍) （4）

28、各反應(yīng)溶液的制備 溶液編號(hào)BA溶液內(nèi)容S80 E0.25 S80 E0.125 S80 E0.06 S80 E0.03S80平行管溶液編號(hào)CD溶液內(nèi)容E0.25 E0.125 E0.06 E0.03 w平行管Bitab532007-9-10 溶液C的制備Bitab542007-9-100.25EU/ml30s30s1EU/ml30s5min1.8ml100EU/ml0.4mlCSEBET水1.0ml10EU/ml0.4ml3.6ml0.5EU/ml1.8ml3.6ml1.8ml1.8ml0.125EU/ml30s1.8ml1.8ml0.06EU/ml30s1.8ml1.8mlBitab5520

29、07-9-10 溶液A的制備（供試品的稀釋）硫酸慶大霉素注射液0.3ml20000U/ml0.6ml1.0mlBET水3.0ml2.7ml1:101:400.6ml1:80S10S40S80Bitab562007-9-10 溶液B的制備E0.5 E S80 E0.25 S80 E0.125 S40 S40 E0.125 E0.0625 S80 E0.0625 S80 ES40 S40 （5）加樣及反應(yīng) Bitab572007-9-10 S80 E （S80E2） （2） （） （1/2）BET水 （1/4） S80 E （S80E） S80 E （S80E1/2） S80 E （S80E1/4

30、）S80Bitab582007-9-10 - 36支鱟試劑，先用復(fù)溶，再加相應(yīng)的溶液 - 37 1 反應(yīng)60 2分鐘（6）結(jié)果判斷 反應(yīng)結(jié)果 溶液編號(hào)BA溶液內(nèi)容S80 E0.25 S80 E0.125 S80 E0.06 S80 E0.03S80平行管溶液編號(hào)CD溶液內(nèi)容E0.25 E0.125 E0.06 E0.03 w平行管Bitab592007-9-10+-+-+-+-+-結(jié)果計(jì)算及判斷 Es=lg-1（Xs/4）=lg-1 Et=lg-1（Xt/4）=lg-1 Es 、Et分別為系列C和B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值。 Xs、Xt分別為系列C和B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對數(shù)值（lg）。Bita

31、b602007-9-10(lg0.125) x44(lg0.06)+(lg0.125) x44結(jié)論：使用靈敏度的鱟試劑對樣品（S）的80倍稀釋液（S80）作BET，無干擾。當(dāng)溶液A和溶液D（陰性對照）的所有平行管都為陰性，且0.5 Es 2時(shí)，試驗(yàn)有效。當(dāng) 0.5 Es Et 2.0 Es時(shí)，供試品在該濃度下對檢查無干擾。本試驗(yàn)： ， Es， 0.5 Es 2，有效 0.5 Es=0.06 ， 2 Et，0.5Es Et 2.0 Es，無干擾Bitab612007-9-10藥典規(guī)定：6、 檢查法 1）凝膠法限量試驗(yàn) （1）反應(yīng)設(shè)置： 溶液編號(hào)ABCD溶液內(nèi)容SS E2E2W平行管Bitab62

32、2007-9-10 試劑名稱 廠 家規(guī)格標(biāo)示效價(jià)數(shù) 量TAL 安度斯0.1ml/支 0.125EU/ml8內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品CSE 安度斯10ng/瓶 10EU/ng1BET水 安度斯25ml/瓶 0.003EU/ml1硫酸慶大霉素(S)-100ml/支 20000U/ml1Bitab632007-9-10（2）試劑選擇- 根據(jù)干擾試驗(yàn)結(jié)果，供試品在80倍稀釋，使用鱟試劑靈敏度為條件下，對BET無干擾- 本試驗(yàn)選擇TAL靈敏度為0.125EU/ml,供試品稀釋80倍檢查溶液C的制備E100 E10 E1 E0.5 E0.25 溶液A的制備S原液 S10 S40 S80 溶液B的制備 Bitab642

33、007-9-102.7ml W3.6ml W1.6ml W3.6ml W1.8ml W0.6ml W溶液C溶液A0.6ml wE S40S80E溶液B(3)各反應(yīng)溶液制備Bitab652007-9-10反應(yīng)項(xiàng)目每管加樣內(nèi)容管數(shù)A0.1ml TAL+0.1ml A溶液B0.1ml TAL+0.1ml B溶液C0.1ml TAL+0.1ml C溶液D0.1ml TAL+0.1ml BET水（4）加樣及反應(yīng)試管封口 混合 孵育（37/ 602分鐘） 8支鱟試劑，先加水復(fù)溶，再加入相應(yīng)溶液（如圖）Bitab662007-9-10溶液編號(hào)內(nèi)容A（S80）B（S80E0.25）C（E0.25）DW合格不合

34、格需復(fù)檢復(fù)檢合格復(fù)檢不合格試驗(yàn)無效試驗(yàn)無效試驗(yàn)無效(5)結(jié)果判斷Bitab672007-9-10舉例：注射用頭孢拉定的內(nèi)毒素日常檢查試劑名稱廠 家劑型復(fù)溶體積或裝 量標(biāo)示靈敏度() 或效價(jià)數(shù)量（支）TAL安度斯凍干品0.5ml/支0.125EU/ml3CSE中檢所凍干品1.0ml/支20EU/支1BET水安度斯5ml/支注射用頭孢拉定注射用無菌粉末0.5g/支1Bitab682007-9-101） 參數(shù)確定: 供試品的內(nèi)毒素限值L：中國藥典上規(guī)定注射用頭孢拉定的內(nèi)毒素限值L為。 鱟試劑靈敏度的選擇根據(jù)干擾試驗(yàn)的結(jié)果，可選擇靈敏度為的TAL對注射用頭孢拉定按最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)進(jìn)行日常檢查

35、。 MVD計(jì)算:加5ml BET水溶解一支供試品,得濃度C=100mg/ml的供試液。Bitab692007-9-102） 制備供試液: 供試品溶液（A）的制備100mg/ml頭孢拉定BET水1:801:101:160Bitab702007-9-10 內(nèi)毒素溶液（C）的制備0.25EU/ml30s30s15min20EU/ml0.4mlCSEBET水1.0ml2.0EU/ml0.5EU/ml1.0ml1.0ml3.0ml1.0ml3.6mlE0.5E0.25Bitab712007-9-10 含2內(nèi)毒素的供試液（B）的制備1:160 （ 0.625mg /ml）2CSE（）E注射用頭孢拉定稀釋液1:80Bitab722007-9-10 加樣反應(yīng)反應(yīng)項(xiàng)目每管加樣內(nèi)容管數(shù)A0.1ml TAL+0.1ml A溶液B0.1ml TAL+0.1ml B溶液C0.1ml TAL+0.1ml C溶液D0.1ml TAL+0.1ml BET水試管封口 混合 孵育（37/602分鐘）2. 凝膠法半定量試驗(yàn) 應(yīng)用舉例Bitab732007-9-101. 供試品及試劑1