第四課哺乳動(dòng)物總RNA提取及電泳

1、第四課哺乳動(dòng)物總RNA提取及RNA瓊脂糖凝膠電泳1第一部分 哺乳動(dòng)物總RNA提取2實(shí)驗(yàn)原理異硫氰酸胍可將哺乳動(dòng)物組織勻漿中蛋白質(zhì)變性，十二烷基肌氨酸鈉可使細(xì)胞裂解，并釋放RNA，同時(shí)保持RAN的完整。苯酚也是蛋白質(zhì)變性劑，加入氯仿后離心，溶液分為水相和有機(jī)相。酸性條件下DNA同蛋白質(zhì)一起變性被離心下來(lái)，絕大部分RNA則保留于水相。水相的RNA可經(jīng)異丙醇沉淀。3實(shí)驗(yàn)試劑裂解液（4M異硫氰酸胍，25mM檸檬酸鈉 Ph7.0，0.1M-巰基乙醇，0.5%十二烷基肌氨酸鈉）2M醋酸納，pH4.0水飽和苯酚，pH5.0氯仿75%乙醇（用DEPC處理的去離子水配置）DEPC處理的去離子水4實(shí)驗(yàn)步驟取3克組

2、織，加30ml裂解液，勻漿。吸取500ul勻漿液于1.5ml微量離心管中.加50ul2M醋酸納（pH4.0），500ul水飽和苯酚，100ul氯仿，震蕩1分鐘。冰上放置15分鐘。13000rpm，4，5分鐘。將上清轉(zhuǎn)移至1.5ml無(wú)酶微量離心管中，加等體積的苯酚/氯仿（1:1），震蕩1分鐘。13000rpm，4，5分鐘。將上清轉(zhuǎn)移至1.5ml無(wú)酶微量離心管中，加等體積的氯仿，震蕩1分鐘。13000rpm，4，5分鐘。將上清轉(zhuǎn)移至1.5ml無(wú)酶微量離心管中，加等體積的異丙醇。0放置20分鐘。13000rpm，4，10分鐘。去上清。用1ml75%乙醇洗管壁。盡量去處乙醇。室溫干燥。將RNA沉淀溶于

3、10ul經(jīng)DEPC處理的去離子水中。-20保存。 5第二部分 RNA瓊脂糖凝膠電泳6實(shí)驗(yàn)原理常用的變性劑甲醛或戊二醛可使蛋白質(zhì)變性，也可破壞RNA分子的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。因此在含有變性劑的瓊脂糖凝膠中電泳，可防止RNA被降解，同時(shí)可以避免RNA高級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)電泳結(jié)果的影響。7實(shí)驗(yàn)試劑瓊脂糖10X MOPS（嗎啉代丙烷磺酸 ）(0.2M MOPS, 50mM NaAc, 10mM EDTA, Ph 7.0)37%甲醛RNA上樣緩沖液（50%甲酰胺，1X MOPS，6%甲醛，7%甘油，0.3%溴酚藍(lán)） 8實(shí)驗(yàn)步驟稱(chēng)取0.5克瓊脂糖，加40ml去離子水。加熱將瓊脂糖充分融解。當(dāng)溶液溫度降至60左右，加5ml10X MOPS，5ml37%甲醛，2ulGoldView，混勻。倒入制膠板，室溫靜置至膠完全凝固。除去梳齒，將凝膠板放入電泳槽，加入1X MOPS至液面超過(guò)凝膠約2mm。取5ulRNA與10ulRNA上樣緩沖液混勻。6510分鐘，立即置冰上2分鐘。上樣，100V電泳40-50分鐘。在紫外燈下觀察電泳結(jié)果。9思考題如何處理玻璃器皿及金屬器械，使之無(wú)RNA酶？如何配制DEPC水？如何配制無(wú)RNA酶試劑？在提取RNA的實(shí)驗(yàn)中，你認(rèn)為操作上應(yīng)注意那些地方能有助于防止R