低氧暴露所致大鼠骨骼肌萎縮的蛋白轉(zhuǎn)化調(diào)節(jié)機制

1、低氧暴露所致大鼠骨骼肌萎縮的蛋白轉(zhuǎn)化調(diào)節(jié)機制題目：字體中文黑體，英文新羅馬；字號小二。付鵬宇1，胡揚2，李燕春2，于加倍1，朱镕鑫1,3，賈杰1，龔麗景2*作者，單位，中英文摘要及未特別標(biāo)注的正文：中文字體宋體，英文字體新羅馬；字號五號；行距1.5倍行距；段前段后均為0；首行縮進2字符，請勿選擇懸掛。北京體育大學(xué)運動人體科學(xué)學(xué)院，北京 100084；2. 北京體育大學(xué)中國運動與健康研究院，北京 100084；3. 上海體育科學(xué)研究所，上海200030）【摘要】摘要中“目的、方法、結(jié)果、結(jié)論”加粗。 目的 本研究擬對比低氧暴露和常氧下配對低氧攝食干預(yù)（半饑餓狀態(tài)）大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)合成和分解相關(guān)基

2、因表達(dá)的差異，以探討低氧暴露誘導(dǎo)骨骼肌萎縮發(fā)生的可能機制。方法 SD大鼠分為：（1）常氧正常飲食組（C組），（2）低氧正常飲食組（H組），氧氣濃度為12.4%，（3）常氧配對飲食組（P組），投喂與H組前一天相同攝食量。4周干預(yù)后測量大鼠體成分，取比目魚肌（SOL）和趾長伸?。‥DL），稱量濕重；HE染色觀察肌纖維形態(tài)，計算肌纖維橫截面積（FCSA）；WB測試骨骼肌中HIF1、Akt、p-Akt及骨骼肌蛋白合成和分解相關(guān)基因蛋白含量。 結(jié)果 （1）H組大鼠體重較C組持續(xù)下降，P組與C組間無顯著性差異；干預(yù)初期H組（P組同）攝食量較C組顯著下降，后期兩組間無差異；（2）干預(yù)后，H組大鼠體重和肌肉總

3、量較C組和P組顯著性降低，P組與C組間無差異；H組兩肌肉濕重較C組顯著下降；H組EDL的FCSA顯著低于C組和P組；（3）H組EDL中HIF1蛋白含量顯著高于C組；H組和P組SOL中p-Akt/Akt比值顯著低于C組；H組EDL中mTOR、4EBP1蛋白含量顯著低于C組，atrogin 1、MuRF1、beclin 1蛋白含量及LC3/比值顯著高于C組，H組SOL中MuRF1蛋白含量顯著高于C組和P組。 結(jié)論 低氧所致的骨骼肌萎縮由低氧特異性因素誘發(fā)，表現(xiàn)為以快肌為主的骨骼肌蛋白合成減少和分解增加，而非低氧下攝食量減少引起?！娟P(guān)鍵詞】低氧暴露；骨骼肌萎縮；半饑餓狀態(tài)；骨骼肌蛋白轉(zhuǎn)化調(diào)節(jié)；肌肉類

4、型；大鼠與英文關(guān)鍵詞一一對應(yīng)。Protein turnover regulation mechanism of rat skeletal muscle atrophy induced by hypoxia字號小四，字體新羅馬，加粗。FU姓：所有字母均大寫；名：首字母大寫，且名字之間沒有連接線。 Pengyu1, HU Yang2, LI Yanchun2, YU Jiabei1, ZHU Rongxin1, JIA Jie1, GONG Lijing2*（1. College of Human Sport Science, Beijing Sport University, Beijing 1

5、00084, China. 2. China Institute of Sport and Health Science, Beijing Sport University, Beijing 100084. 3. Shanghai Research Institute of Sports Science, Shanghai 200030英文單位必須與中文單位一一對應(yīng)。多個單位時，僅第一個單位后帶有“, China”，后面不再需要標(biāo)注。）Corresponding author：GONG Lijing. E-mail：lijing.gong必須有【Abstract】Objective The a

6、im of this study was to identify the mechanism underlying skeletal muscle atrophy induced by hypoxia exposure. To this aim, expression levels of different types of skeletal muscle protein synthesis- and degradation-related genes were compared between rats that had experienced hypoxic exposure and no

7、rmoxia in a hypoxic feeding intervention (semi-starvation state). Methods SD rats were divided into a normoxic normal diet group (group C), a hypoxic normal diet group (group H; oxygen concentration of 12.4%), or a normoxia-matched diet group (group P; the food intake was matched to that of group H)

8、. The body composition of rats was tested by DEXA after the 4-week intervention. The soleus (SOL) and the extensor digitorum longus (EDL) muscles were collected and weighed. Muscles fiber histology was observed using HE staining, and the muscle fiber cross-sectional area (FCSA) was calculated. The p

9、rotein contents of HIF1, Akt, p-Akt, and skeletal muscle protein synthesis- and degradation-related genes were detected using Western blot. Results (1) Body weight was lower in the group H than group C, but there was no significant difference between the groups P and C during the intervention period

10、. At the beginning of the intervention, the food intake of group H (which was the same as group P) was significantly lower than that of group C, and there was no significant difference between the two groups. (2) After the intervention, the body weight and muscle mass were significantly lower in the

11、 group H compared to groups C and P; the wet weights of SOL and EDL muscles in the group H were significantly lower than those of group C; and the FCSA of the EDL muscle was significantly lower in the group H than in groups C and P. (3) HIF1 protein contents of the EDL muscle was significantly highe

12、r in the group H than group C; the ratio of p-Akt/Akt of the SOL muscle in the groups H and P was significantly lower than that of group C; mTOR and 4EBP1 protein levels in the EDL muscle of group H was significantly lower than group C; atrogin1, MuRF1, and Beclin1 protein levels and the ratio of LC

13、3II/I in EDL of the group H were significantly higher than those of group C, and MuRF1 protein level in the SOL muscle of group H was significantly higher than that of the groups C and P. Conclusions Skeletal muscle atrophy caused by hypoxia is induced by hypoxia-specific factors, showing that decre

14、ased synthesis and decomposition of skeletal muscle proteins, which is manifested by a decrease in skeletal muscle protein synthesis and a decrease in decomposition of fast muscle fibers, rather than a decrease in food intake under hypoxia. 【Key words】 hypoxic exposure除特定大寫要求，首字母小寫; skeletal muscle

15、atrophy;每個關(guān)鍵詞之間采用分號“；”進行分隔。 semi-starvation state; protein turnover-regulatory pathways; muscle types; rat 【基金項目】中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助課（2017SYS009）；國家自然科學(xué)基金（31771317）。Funded by the Fundamental Research Funds for the Central Universities of China (2017SYS009) and National Natural Science Foundation of Ch

16、ina (31771317) .英文對照英文固定為：Funded by +基金除介詞外，所有單詞的首字母需大寫?！咀髡吆喗椤康谝蛔髡呒巴ㄐ抛髡叩暮喗楸仨毻暾揖杼峁┏Ｓ绵]箱。付鵬宇（1991），女，在讀博士研究生，研究方向：運動生物化學(xué)。Email：1402884452【通信作者】龔麗景（1981），女，助理研究員，博士，研究方向：運動與脂肪代謝；低氧與胃腸道、骨骼肌萎縮。Email：lijing.gong高原是指海拔超過2400 m的環(huán)境1。參考文獻(xiàn)間接引用時，序號放句尾參考文獻(xiàn)直接引用時：英文為姓+等的方式，序號放在等右上角；中文為全名+等的方式，序號放在右上角。急進高原會給機體的生理

17、和代謝系統(tǒng)帶來多種不利影響，骨骼肌萎縮就是其中之一2。高原低氧暴露可造成運動員肌肉力量和耐力丟失，影響高原訓(xùn)練效果。低氧所致的肌萎縮還表現(xiàn)出快慢肌的差異，不同類型的骨骼肌可能對低氧刺激產(chǎn)生不同的應(yīng)答，從而影響運動員相應(yīng)運動素質(zhì)的發(fā)揮；隨著高原旅游的興起，世居平原者進入高原可能會發(fā)生的肌肉丟失和肌力下降，從而影響其體力活動和健康狀態(tài)3。低氧下機體組織器官會發(fā)生功能改變或釋放出各種調(diào)節(jié)因子以直接和/或間接調(diào)控骨骼肌重量。低氧環(huán)境下食欲和消化吸收能力會受到抑制，使能量攝入不足，導(dǎo)致機體處于負(fù)能量平衡狀態(tài)，誘發(fā)骨骼肌蛋白代謝失衡，影響肌肉重量的維持4。相反觀點認(rèn)為低氧誘導(dǎo)的肌萎縮與攝食行為無關(guān)，營養(yǎng)良

18、好情況下的低氧暴露仍會使肌肉重量無法維持，可能與低氧特異性因素對骨骼肌蛋白轉(zhuǎn)化（蛋白合成和分解間的動態(tài)平衡）的改變有關(guān)5。低氧下骨骼肌蛋白的轉(zhuǎn)化過程由多基因協(xié)同發(fā)揮作用6。其中低氧誘導(dǎo)因子1 （hypoxia-inducible factor全文中出現(xiàn)此類進行補充說明的英文時，除規(guī)定首字母必須大寫外，所有字母小寫。 1，HIF1）是關(guān)鍵低氧調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)控低氧應(yīng)激下蛋白質(zhì)代謝；絲氨酸/蘇氨酸激酶（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，Akt），又稱作蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt），是蛋白合成和分解的中樞因子，磷酸化

19、后有活性7；哺乳動物雷帕霉素靶向基因（mammalian target of rapamycin，mTOR）可整合細(xì)胞外多種信號刺激，影響基因轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)合成8。其下游的真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1（eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF4E)-binding protein 1，4EBP1）和核糖體蛋白S6激酶-1（ribosomal protein S6 kinase beta-1，P70S6K1/S6K1）參與蛋白合成的調(diào)控9；叉頭框蛋白O1（forkhead box O1，F(xiàn)oxO1）是調(diào)控蛋白分解兩條重要通路的關(guān)鍵基因，包括

20、泛素蛋白酶途徑（ubiquitin-proteasome pathway，UPP）和自噬溶酶體途徑（autophagy-lysosome pathway，ALP），其中肌萎縮F-box 1（muscle atrophy F-box 1，F(xiàn)bx32/atrogin1）和肌肉特異性環(huán)指蛋白1（muscle-specific ring finger 1，MuRF1）是UPP的重要基因10；微管相關(guān)蛋白3 （microtubule associated protein light chain 3，Map1lc3/LC3）和B細(xì)胞淋巴瘤-2相互作用蛋白1（B-cell lymphoma-2 intera

21、cting protein 1，Beclin1）是ALP的重要基因11。目前，關(guān)于低氧暴露所致肌萎縮的發(fā)生機制和肌肉類型的選擇性尚不清楚，是否與低氧下攝食量減少有關(guān)還存在爭議。低氧暴露與攝食量不足所致的半饑餓狀態(tài)下骨骼肌蛋白轉(zhuǎn)化的差異還有待于進一步的探究。因此，本研究中通過低氧暴露和常氧配對低氧攝食干預(yù)大鼠后，對比不同類型骨骼肌蛋白轉(zhuǎn)化調(diào)節(jié)的差異，以探明低氧暴露誘導(dǎo)骨骼肌萎縮發(fā)生的可能機制。1 材料與方法請根據(jù)以下內(nèi)容表達(dá)形式，來完成自身文章的撰寫。1.1 材料1.1.1 實驗動物21只SPF級雄性SD大鼠，8周齡，體重約為230 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK(京)201

22、5-0004】。微生物級別、品種、數(shù)量、體重、月齡，生產(chǎn)許可證號齊全飼養(yǎng)于北京體育大學(xué)動物實驗室【SYXK（京）2016-0034】。 飼養(yǎng)期間各組大鼠自由飲水，飼喂普通維持飼料由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心【SCXK(軍)2012-0004】提供。實驗地點及許可證號齊全飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜各半循環(huán)照明，濕度恒定，溫度控制在22 25具體的飼養(yǎng)環(huán)境描述。所有操作均符合北京體育大學(xué)運動科學(xué)實驗倫理學(xué)要求（審批號：IACUC 2017009A）。體內(nèi)實驗，倫理委員會審批號碼齊全1.1.2 主要試劑與儀器實驗中所用到的主要試劑與儀器均需有所呈現(xiàn)，切勿僅寫試劑。Anti-HIF1（Novusbio，NB100

23、-479），Anti-pan-Akt（Abcam，ab8805），Anti-pSer473-Akt（Cell Signaling，4060），Anti-mTOR（Abcam，ab2732），Anti-4EBP1（Abcam，ab2606），Anti-p70S6K1（Abcam，ab32529），Anti-FoxO1（Abcam，ab52857），Anti-pSer256-FoxO1（Abcam，ab131339），Anti-atrogin1/Fbx32（Abcam，ab74023），Anti-MuRF1（Abcam，ab172479），Anti-LC3B（Novusbio，NB100-2220

24、），Anti-beclin1（Abcam，ab207612）。雙能X射線骨密度儀（dual energy X-ray absorptiometer，DEXA；Lunar Idxa，美國公司和國家齊全），天平（Sartorius，美國），正置光學(xué)顯微鏡（尼康，Nikon Eclipse E100，日本），電泳槽和干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（Life Technologies，美國），近紅外光譜檢測系統(tǒng)（LI-COR，美國）。1.2 方法1.2.1 動物分組及實驗干預(yù)大鼠隨機分為3組： eq oac(,1)常氧正常飲食組（C組）：常氧環(huán)境中自由飲食； eq oac(,2)低氧正常飲食組（H組）：置于氧濃度為12

25、.4%的低氧房中（模擬海拔4000 m數(shù)字與計量單位之間空半格高度），自由飲食； eq oac(,3)常氧配對飲食組（P組）：常氧環(huán)境中，控制其攝食量與H組配對（H組前一天的攝食量，即為P組當(dāng)天的投食量）。每組7只。1.2.2 形態(tài)指標(biāo)測試及取材記錄各組大鼠的攝食量和體重。4周后， DEXA）掃描大鼠體成分（包括肌肉和脂肪總量）；麻醉后取兩側(cè)比目魚肌（soleus，SOL）和趾長伸?。╡xtensor digitorum longus，EDL），稱量濕重。一側(cè)肌肉投入多聚甲醛固定液中固定，另一側(cè)肌肉置于-80保存，用于蛋白含量的測試。1.2.3 HE染色觀察肌纖維形態(tài)及肌纖維橫截面積（musc

26、le fiber cross-sectional area，F(xiàn)CSA）的計算骨骼肌組織在多聚甲醛中固定24 h后，修剪為約5 mm3的組織塊，石蠟包埋切片，HE染色，封片后，1040倍鏡下拍照，用Image J軟件分析計算FCSA。1.2.4 Western Blot測試骨骼肌蛋白含量分別提取各肌肉蛋白后，BCA法測定蛋白濃度，調(diào)整上樣量為20 g。使用梯度膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)至NC膜，封閉液封閉1 h，4溫度單位不空格孵育一抗過夜，洗去未結(jié)合的一抗，室溫孵育二抗1 h，洗去未結(jié)合的二抗，近紅外光譜檢測系統(tǒng)檢測條帶信號值，Image Studio軟件對結(jié)果進行相對定量分析。1.3 統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果

27、用平均值 標(biāo)準(zhǔn)差（x s）表示。所有數(shù)據(jù)均用 SPSS 19.0和GraphPad Prism 5軟件處理，多組間比較使用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P 0.05表示差異具有顯著性。2 結(jié)果2.1 大鼠體重變化大鼠初始體重?zé)o明顯差異，從第2周時，H組體重較C組均顯著下降（P大寫，斜體 0.05），P組與C組差別不大；干預(yù)3周、4周時，H組較C組和P組均顯著下降（P 0.05），P組較C組則無顯著性差異統(tǒng)計學(xué)表示用差異有顯著性或差異無顯著性表達(dá)（圖1）。圖片中所有文字均需以文本框形式置入，同時，請將文本框與圖片組合，避免錯位情況。中文字體宋體，英文字體新羅馬；字號統(tǒng)一為小五或

28、六號。時間（周）Time（weeks）體重（g）Body weight（g）注：干預(yù)2，3，4周后，與C組相比，*P 0.05。 干預(yù)3，4周后，與P組相比，#P 0.05。圖1 體重變化Note. After 2, 3, and 4 weeks of intervention, compared with group C, *P 0.05. After 3 and 4 weeks of intervention, compared with group P, #P 0.05.Figure 1 Changes of body weight of the rats所有與圖相關(guān)的均有中英文對照，包括圖注及橫縱坐標(biāo)。圖上的文字用文本框格式，便于編輯加工處理。順序為中文圖注，中文圖題，英文圖注，英文圖題。2.2 干預(yù)后大鼠FCSA每幅病理圖的右下角均需有標(biāo)尺：文字在橫線的上方，數(shù)字與單位之間空一格，字體為新羅馬。各組SOL的FCSA沒有顯著性差異；H組EDL的FCSA較C組顯著下降（P 0.05），H組EDL的FCSA較P組顯著下降（P 0.05）（圖5）。 比目魚肌SOL趾長伸肌EDL肌纖維橫截面積（m2）Skeletal muscle fiber c