8 胚胎移植_細胞工程

1、第六章 胚胎移植1胚 胎 移 植胚胎移植embryo transfer,ET也稱受精卵移植，是指將一頭良種母畜配種后的早期胚胎取出，或者由體外受精及其他方式獲得的胚胎，移植到另一頭同種的生理狀態(tài)相同的母畜體內(nèi)，繼續(xù)發(fā)育成為新個體，所以又稱之為人工授胎或借腹懷胎。提供胚胎的個體稱為-供體donor接受胚胎的個體稱為-受體recipient2胚 胎 移 植 的 意 義1.發(fā)揮優(yōu)良母畜的繁殖潛力，提高繁殖效率。2.促進家畜改進的速度3.產(chǎn)生雙胎和使不孕母畜獲得生殖能力4.瀕危動物的拯救和保護5.研究手段3胚 胎 移 植 的 原 那么1.受體與供體在分類學(xué)上的相同屬性2.動物生理上的一致性3.動物解剖

2、部位的一致性4.胚胎發(fā)育的期限5.胚胎的質(zhì)量6.供體、受體的狀況4胚胎移植原那么圖解5胚 胎 移 植 的 程 序優(yōu)良種公畜 供體優(yōu)良母畜 超 數(shù) 排 卵 處 理 發(fā) 情、配 種 胚 胎 回 收 超 數(shù) 排 卵 處 理受體優(yōu)良母畜 同 期 發(fā) 情 處 理 發(fā) 情 胚 胎 移 植優(yōu) 良 后 代6胚胎移植圖解7雄性生殖內(nèi)分泌調(diào)控8雌性生殖內(nèi)分泌調(diào)控19雌性生殖內(nèi)分泌調(diào)控210 在生理或非妊娠條件下，雌性動物每間隔一定時期均會出現(xiàn)一次發(fā)情，通常將這次發(fā)情開始至下次發(fā)情開始、或這次發(fā)情結(jié)束至下次發(fā)情結(jié)束所間隔的時期，稱為發(fā)情周期。 發(fā) 情 周 期11 通常根據(jù)動物的精神狀態(tài)、雌性動物對雄性動物產(chǎn)生的性欲

3、表現(xiàn)、卵巢內(nèi)卵泡的生長發(fā)育、排卵和黃體形成的情況及雌性生殖道子宮、陰道等的生理變化等幾個主要方面，將發(fā)情周期劃分為：發(fā)情前期前情期 發(fā)情期 發(fā)情后期后情期 間情期休情期 12131.供體的超數(shù)排卵( Superovulation of Donor ) 在母畜發(fā)情周期的適當(dāng)時期，用促性腺激素進行處理，誘發(fā)其卵巢上有大量卵泡同時發(fā)育并排卵，稱為超數(shù)排卵，簡稱超排。超排技術(shù)通常用于單胎家畜，如牛、綿羊和山羊等，其目的是讓優(yōu)良母畜排出大量卵子，充分發(fā)揮其繁殖潛力，因而是胚胎移植中的一個重要環(huán)節(jié)，也是首要環(huán)節(jié)。超排方法：在發(fā)情周期的一定時期，用PMSG或FSH促進卵泡發(fā)育，于發(fā)情開始后12-16h和20

4、-24h各配種輸精一次，并于第一次配種后靜脈注射hCG或LH，以便排出多數(shù)卵子。 1415天數(shù) 110 11 12 1315-1620處理 置栓 換栓7:00FSH2.5ml 19:00FSH1.5ml 7:00FSH1.5ml19:00FSH1.5ml7:00FSH1.5ml19:00FSH1.0mlPG0.1mg試配首配后LRHA310-20Mg每8小時配一次 首配后3-3.5d置栓7:00停食腹腔鏡檢查手術(shù)沖胚PG0.1mg羊供體超排處理方案16羊的陰道栓處理17羊的陰道栓處理1819羊的陰道栓處理20 影響超排效果的因素 家畜本身：母畜個體差異可導(dǎo)致超排反響不同，這與家畜的種類、品種、

5、年齡、體重及營養(yǎng)情況都有關(guān)系。促性腺激素：所用激素的種類、用量和注射程序，尤其是制品中兩種促性腺激素FSH/LH )的比例差異，是影響胚胎數(shù)量及質(zhì)量的重要因素；用量的大小那么與超排的多少直接有關(guān)，如果用量過大，往往會使卵泡發(fā)育過多，以致發(fā)生排卵延遲或不能排卵。21用藥時間：發(fā)情周期階段、產(chǎn)后階段及季節(jié)不同，超排結(jié)果均有差異。 重復(fù)超排：一般而言，供體對前3次超排處理 的反應(yīng)相似，但有些個體對重復(fù)超排的反響不佳，可能是由于促性腺激素產(chǎn)生了抗體。為了 提高重復(fù)超排的效果，一是延長激素處理的間 隔，二是盡量采用同種動物的促性腺激素，以減少抗體的產(chǎn)生。22超排效果好的卵巢黃體23超排效果不好的卵巢黃體

6、242.受體的同期發(fā)情( Synchroestrus of recipient ) 無論在何種家畜或任何品種，為了使胚胎移植獲得成功，必須使受體母畜與供體的發(fā)情同期化，使二者的生殖器官處于相同的生理階段。受體與供體發(fā)情開始的時間越接近，移植的受胎率越高。這是因為妊娠初期的子宮環(huán)境在不斷發(fā)生變化，而特定時間的環(huán)境只適合于發(fā)育階段相應(yīng)的胚胎生存；也可能是因為非同期胚胎不能對受體產(chǎn)生促黃體作用。為了獲得最正確受胎效果，應(yīng)將受體與供體的發(fā)情時間之差控制在24h之內(nèi)。25同期發(fā)情方法:誘發(fā)同期發(fā)情的理想藥物有孕激素和前列腺素PGF2及其類似物。其劑量根據(jù)PG種類和用法不同而異。在國外，普遍采用氯前列烯醇

7、(cloprostenol)和15甲基PGF2倘假設(shè)在400頭以上的大牛群中進行胚胎移植，因為每天都可能遇到發(fā)情母牛，就可以盡量選留自然發(fā)情的母牛作為受體，不需要進行同期發(fā)情處理。26羊受體的同期發(fā)情處理方案天數(shù) 1 11 12 131720 處理 置栓 19:00FSH 25iu 或PMSGFSH25iu去栓 早晚試情，記錄發(fā)情時間 7:00停食移胚273.供體的配種輸精 超排供體的配種次數(shù)，應(yīng)比自然供體多一些，每次輸入的精子數(shù)亦應(yīng)增多。超排供體的受精率，通常比自然供體為低，這可能是由于排卵不集中、卵母細胞有缺陷或母畜生殖道的環(huán)境不太適宜于精子的運行。284.收集胚胎Collection o

8、f eggs 收集胚胎就是在配種或輸精后的適當(dāng)時間，從超排供體回收其胚胎，以備給受體移植，亦稱胚胎回收或胚胎采集，簡稱采卵。采卵的效果與采集時間、方法和檢卵技術(shù)均有關(guān)系。29 1.采卵時間 一般將配種當(dāng)日定為0 天，由配種后第二天開始計算采卵天數(shù)。根據(jù)采集目的不同，決定在第幾天采卵。就母牛而言，一般第1-4天可以由輸卵管采到16細胞以前的卵，58天可以由子宮采到桑植胚和囊胚。其依據(jù)是胚胎在生殖道內(nèi)的發(fā)育情況及移行速度 .303132332采卵方法 有手術(shù)法和非手術(shù)法兩種。在大家畜根本上已將手術(shù)法淘汰，但在綿羊、山羊、豬和實驗動物由于受解剖特點的限制，一直采用手術(shù)方法。不管用何種方法，一般收集卵

9、子數(shù)只能相當(dāng)于黃體數(shù)的4080。 34第一種由宮管結(jié)合部沖向輸卵管。本法沖卵率高，很少損害生殖道。除了豬因?qū)m管結(jié)合部具有閥門樣結(jié)構(gòu)不能采用以外，各種中、小動物均可采用。第二種方法是由輸卵管傘沖向?qū)m管結(jié)合部。本法適用于豬，是由一個插入該處的鈍注射針頭或光滑的細玻管收集卵子；其缺點是術(shù)后常造成宮角尖端或輸卵管粘連。手術(shù)法采卵35第三種方法是由子宮角尖端沖向子宮角基部。本法用于發(fā)情5天以后收集子宮內(nèi)的卵，其收集數(shù)量比A, B法略少，易引起子宮粘連。 沖卵液為杜氏PBS,用量:第一、第二兩種方法用5-l0ml，第三種方法用10-20ml。3637羊的手術(shù)法采卵38羊的手術(shù)法采卵 39手術(shù)操作現(xiàn)場40S

10、gie創(chuàng)造了一種帶有氣球的非手術(shù)采卵器，可由牛的子宮角采卵，顯著提高了采卵率。Folley和Stewart又相繼改進，設(shè)計出三通路進氣、進液、回液導(dǎo)管采卵器附圖4，使用更加方便有效，能夠從同一供體反復(fù)收集卵子。沖卵液的用量一般為500 ml，裝入輸液瓶內(nèi)，每次放出30-60m1，反復(fù)沖洗子宮角，并回收到集卵杯內(nèi)。沖完一個子宮角后，再用同法沖洗另一子宮角。 非手術(shù)法采卵4142435.檢卵Egg picking 將沖卵液回收之后，盡快置于放大10-15倍的實體顯微鏡下，檢查收集到的卵數(shù)，并用一細吸管將卵移至新鮮培養(yǎng)液內(nèi)，在放大40-200倍的復(fù)式顯微鏡下，進行形態(tài)學(xué)觀察，選出適合于移植的正常卵附

11、圖5。形態(tài)不正常者附圖6及發(fā)育延遲2天以上的卵，都不可用于移植。44檢胚45顯微鏡下的胚胎4647486.移植胚胎Egg transplantation 移植胚胎就是將采取的可用卵移給受體母畜，亦稱卵的移植，簡稱移卵。移卵方法：與采卵方法相似，也分為手術(shù)法與非手術(shù)法兩種，前者適用于不能進行直腸操作的中小動物，后者適用于大家畜。49手術(shù)法移卵 方法與采卵一樣，先暴露輸卵管及子宮角，再將卵注入輸卵管或子宮角。當(dāng)移入輸卵管時，將毛細移卵管的尖端通過輸卵管傘插到壺腹部，注入含有胚胎的培養(yǎng)液12滴；假設(shè)移入子宮角，可先用鈍針頭刺破子宮角壁，然后將毛細管從針孔插入子宮腔，注入含胚胎的培養(yǎng)液 505152羊的手術(shù)法移卵535