生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新

1、 4、生長(zhǎng)因子 一類對(duì)微生物必不可少且不能用簡(jiǎn)單的碳源或氮源自行合成的有機(jī)物。 需要量很少，例如各種維生素、堿基、卟啉、甾醇等。不同種類微生物對(duì)生長(zhǎng)因子并非都須外界供給的。 多數(shù)真菌、放線菌和不少細(xì)菌，都不需要外界提供生長(zhǎng)因子； 少數(shù)微生物還能自行合成過(guò)量的生長(zhǎng)因子分泌到環(huán)境中，因此可用作維生素的。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 5、無(wú)機(jī)鹽 除碳、氮元素以外，對(duì)微生物生長(zhǎng)繁殖所必需的無(wú)機(jī)物中的元素，如磷、硫、鉀、鎂、鈉、鐵和鋅、錳、鉬、鈷、銅等。 6、水 水是微生物一切生命活動(dòng)賴以進(jìn)行的基本條件，雖較少用作真正的營(yíng)養(yǎng)物，但因其不能缺少，故也屬營(yíng)養(yǎng)素之一。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新（二）微生物培養(yǎng)基 培

2、養(yǎng)基是人工配制的適合于不同微生物生長(zhǎng)繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。它是微生物的營(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ)，是合成代謝產(chǎn)物的物質(zhì)來(lái)源。 培養(yǎng)基成分和配比合適與否，對(duì)微生物生長(zhǎng)發(fā)育、物質(zhì)代謝、發(fā)酵產(chǎn)物的積累以及生產(chǎn)工藝等都有很大的影響。 一種良好培養(yǎng)基的確定，往往要經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的反復(fù)的試驗(yàn)，并不斷調(diào)整改進(jìn)，逐漸趨于完善。 同時(shí)，應(yīng)根據(jù)菌種特性、發(fā)酵條件和工藝的改變進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整、改善。 生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 除培養(yǎng)基組成外，還需考慮其他培養(yǎng)條件的控制，才能發(fā)揮其最大效能。 任何培養(yǎng)基都應(yīng)具備微生物生長(zhǎng)所需要的6大營(yíng)養(yǎng)要素，即碳源、氮源、能源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子和水。在發(fā)酵過(guò)程中，為提高產(chǎn)物的量或減少雜質(zhì)的生成，有時(shí)還

3、添加前體、誘導(dǎo)物或抑制劑等成分。 培養(yǎng)基配好后必須立即進(jìn)行滅菌，否則會(huì)因雜菌生長(zhǎng)而破壞其固有成分和性質(zhì)。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 1、培養(yǎng)基的種類 培養(yǎng)基按其組成物質(zhì)的來(lái)源可分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基，前者所用原料的化學(xué)成分明確、穩(wěn)定，但營(yíng)養(yǎng)單一且價(jià)格昂貴，適用于研究菌種基本代謝和過(guò)程的物質(zhì)變化，不適用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。 發(fā)酵工業(yè)普遍使用天然培養(yǎng)基，它的原料是一些天然的動(dòng)植物產(chǎn)品，如花生餅粉、酵母膏、蛋白胨等。 天然培養(yǎng)基的特點(diǎn)是營(yíng)養(yǎng)豐富，適合于微生物的生長(zhǎng)繁殖和目的產(chǎn)物的合成。 一般天然培養(yǎng)基中不需要另加微量元素、維生素等物質(zhì)，而且組成培養(yǎng)基的原料來(lái)源豐富，價(jià)格低廉，適用于工業(yè)生產(chǎn)。生物制藥

4、工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 培養(yǎng)基按狀態(tài)可分為固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。 固體培養(yǎng)基比較適用于菌種的分離和保存。 半固體培養(yǎng)基即在配好的液體培養(yǎng)基中加入少量瓊脂，一般用量為0508，培養(yǎng)基即呈半固體狀態(tài)，主要用于鑒定菌種、觀察細(xì)菌運(yùn)動(dòng)特征及噬菌體的效價(jià)測(cè)定等。 液體培養(yǎng)基中的8090是水，其中配有可溶性的或不溶性的營(yíng)養(yǎng)成分，是發(fā)酵工業(yè)大規(guī)模使用的培養(yǎng)基，它有利于氧和物質(zhì)的傳遞。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 培養(yǎng)基按其用途一般可分為孢子培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基三種。 孢子培養(yǎng)基是供菌種繁殖孢子的一種常用的固體培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基的要求是能使菌體迅速生長(zhǎng)，產(chǎn)生較多優(yōu)質(zhì)孢子并不易引起菌種發(fā)生變異。

5、 種子培養(yǎng)基一般指一、二級(jí)種子罐的培養(yǎng)基和搖瓶培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基主要含有容易被利用的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽等，使孢子很快發(fā)芽、生長(zhǎng)以及大量繁殖菌絲體，并使菌體長(zhǎng)得粗壯和使各種有關(guān)的初級(jí)代謝酶的活力提高。 種子培養(yǎng)基要和發(fā)酵培養(yǎng)基相適應(yīng)，成分不應(yīng)相差太大，以避免種子對(duì)新環(huán)境的適應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 發(fā)酵培養(yǎng)基可供菌種生長(zhǎng)、繁殖和合成產(chǎn)物。它既要使種子接種后能迅速生長(zhǎng)達(dá)到一定的菌體濃度，又要使長(zhǎng)好的菌體能迅速合成所需的產(chǎn)物，因此，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成除有菌體生長(zhǎng)所必需的元素和化合物外，還要有產(chǎn)物所需的特定元素、前體和促進(jìn)劑等。 由于各種培養(yǎng)基的用途不同，其培養(yǎng)基的組成差異也很大。生物制藥工

6、藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 2影響培養(yǎng)基質(zhì)量的因素 （1）原材料質(zhì)量的影響 培養(yǎng)基所用的原材料大多為復(fù)合材料，其中不少天然原料成分復(fù)雜，如玉米漿、黃豆餅粉、花生餅粉、蛋白胨等往往因品種、產(chǎn)地、加工方法和貯藏條件的不同而造成內(nèi)在質(zhì)量較大的波動(dòng)。 （2）水質(zhì)的影響 發(fā)酵工業(yè)所用的水有深井水、地表水、自來(lái)水和蒸餾水等。 深井水的水質(zhì)可因地質(zhì)情況、水源深度、采水季節(jié)及環(huán)境不同而不同， 地表水的水質(zhì)受環(huán)境污染的影響更大。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 對(duì)于發(fā)酵工廠來(lái)說(shuō)，恒定的水源是至關(guān)重要的，因?yàn)樵诓煌粗写嬖诘母鞣N因素對(duì)微生物發(fā)酵代謝影響甚大。 水源質(zhì)量的主要考慮參數(shù)包括pH、溶解氧、可溶性固體、污染程度以及礦物質(zhì)組

7、成和含量。在抗生素發(fā)酵工業(yè)中，由于水質(zhì)不同而導(dǎo)致這結(jié)果差異也時(shí)有發(fā)生。 因此，有的國(guó)家為了避免水質(zhì)變化對(duì)抗生素發(fā)酵產(chǎn)生影響，提出配制抗生素工業(yè)培養(yǎng)基的水質(zhì)要求：渾濁度20、色級(jí)25、pH6872、總硬度100230mgL（ppm）、鐵離子0104mgL（ppm）、蒸餾殘?jiān)?50mgL（ppm）。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新（3）滅菌操作 培養(yǎng)基必須經(jīng)過(guò)滅菌方可使用，目前大多數(shù)生產(chǎn)用培養(yǎng)基均采用高壓蒸汽滅菌法，滅菌時(shí)，營(yíng)養(yǎng)成分會(huì)受到一定程度的破壞。如葡萄糖在高溫下易與氨基酸和其他含氨基的物質(zhì)反應(yīng)，對(duì)微生物有一定的毒性。 磷酸鹽與碳酸鈣之間，磷酸鹽、鎂鹽和銨鹽之間也發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成沉淀或絡(luò)合物，使可

8、利用的磷酸根和銨離子的濃度大為降低。 此外，蛋白質(zhì)在高溫下變性，維生素在高溫下失活。因此，滅菌操作的不當(dāng)不僅會(huì)減少培養(yǎng)基中有效的營(yíng)養(yǎng)成分，還會(huì)產(chǎn)生一些有毒物質(zhì)，給發(fā)酵帶來(lái)不利的影響。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新（4）培養(yǎng)基黏度的影響 培養(yǎng)基中一些不溶性的固體成分，如淀粉、黃豆餅粉等增加了培養(yǎng)基的黏度，直接影響微生物對(duì)溶解氧的利用，給產(chǎn)品的后提取也帶來(lái)不便。 在大規(guī)模發(fā)酵，對(duì)由于淀粉含量過(guò)高，不僅成本增加且使發(fā)酵液黏稠而影響生物合成。如果營(yíng)養(yǎng)成分缺乏，則可通過(guò)中間補(bǔ)料方法予以彌補(bǔ)。 工業(yè)生產(chǎn)中還可采用精料發(fā)酵、基礎(chǔ)原料液體化（即用蛋白酶水解各種餅粉），或采取補(bǔ)加無(wú)菌水的方法，來(lái)降低培養(yǎng)基的黏度，以提

9、高發(fā)酵水平。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 （三）滅菌與除菌方法 1、滅菌方法 （1）加熱滅菌 這是大規(guī)模裝置中最行之有效的滅菌方法。影響這種方法有效程度的因素主要有：待殺滅微生物的種類、待滅培養(yǎng)基的組成、pH以及培養(yǎng)基中顆粒成分的粒度。 一般說(shuō)，生物的營(yíng)養(yǎng)體在較低溫度下很快就可殺滅；而要?dú)⑺牢⑸锏逆咦樱瑒t需要至少121高溫。在所有的微生物孢子中，嗜熱脂肪芽孢桿菌的孢子對(duì)熱的耐受性最強(qiáng)，因此，人們常常用它作為檢驗(yàn)滅菌是否徹底的指標(biāo)。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 常用的加熱滅菌方式有高溫蒸汽濕熱滅菌法和干熱滅菌法。濕熱滅菌比干熱滅菌更為有效，因蒸汽在冷凝時(shí)要釋放大量的潛能，且蒸汽有強(qiáng)大的穿透力，易于傳熱

10、。 這種方法普遍被用來(lái)對(duì)培養(yǎng)基和設(shè)備容器進(jìn)行滅菌。 干熱滅菌只適用于工業(yè)要求為滅菌后能保持干燥狀態(tài)的物料滅菌。 實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的玻璃器皿等器具常采用干熱滅菌。一般干熱滅菌的條件是160，120min。 生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新（2）輻射滅菌 輻射滅菌即利用紫外線、高能量的電磁波或粒子輻射滅菌，其中以紫外線最常用。 紫外線對(duì)微生物有殺滅作用。其波長(zhǎng)在210313.2nm范圍內(nèi)有效，常用的有效波長(zhǎng)為253.7nm。 這與微生物體內(nèi)核酸的吸收光譜相一致，DNA鏈上核苷酸的堿基因具有強(qiáng)烈的吸收紫外線的能力而引起DNA結(jié)構(gòu)的變化，如DNA鏈的斷裂。DNA分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)，嘧啶二聚體的形成等，其中胸腺嘧啶

11、二聚體的形成是紫外線改變DNA生物功能的重要途徑。 紫外線對(duì)芽孢和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞都能起作用，但其穿透力極低，它對(duì)真菌孢子的殺滅能力不大。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新（3）介質(zhì)過(guò)濾除菌 對(duì)培養(yǎng)液中某些不耐熱的成分可采用過(guò)濾除菌法，例如可用濾膜過(guò)濾裝置、燒結(jié)玻璃濾板過(guò)濾器、石棉板過(guò)濾器、素?zé)蛇^(guò)濾器以及硅藻土過(guò)濾器等。 發(fā)酵過(guò)程中所用的大量無(wú)菌空氣也是采用過(guò)濾除菌法。傳統(tǒng)的過(guò)濾方式是深層過(guò)濾，所采用的過(guò)濾介質(zhì)有棉花、玻璃纖維、活性炭、石棉濾板和活性炭纖維素等。 深層過(guò)濾的除菌效果靠多種物理因素的共同作用來(lái)完成，這些因素主要包括沉降作用、擴(kuò)散作用、慣性撞擊作用、攔截作用和靜電吸附作用等。但它們存在著使用壽命短

12、、更換作業(yè)麻煩的缺點(diǎn)。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 又開發(fā)了一些新的過(guò)濾介質(zhì)，如燒結(jié)金屬板、燒結(jié)金屬管、燒結(jié)玻璃纖維以及硝酸纖維酯、聚砜、聚四氟乙烯、尼龍微孔濾膜等。這些過(guò)濾介質(zhì)具有與深層過(guò)濾相同的過(guò)濾除菌效果，且使用壽命較長(zhǎng)，介質(zhì)更換作業(yè)簡(jiǎn)便，因而使用起來(lái)要方便得多。 從大氣空間采集的空氣，在進(jìn)過(guò)濾器之前，還要經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的處理過(guò)程，以盡量除去其中的粉塵、油和水，從而確保進(jìn)罐空氣的潔凈，如圖2 5所示。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新（4）化學(xué)滅菌法 化學(xué)滅菌法是通過(guò)藥劑與微生物細(xì)胞接觸而發(fā)生諸如蛋白質(zhì)變性等作用而達(dá)到殺滅微生物的目的。常用的化學(xué)藥劑包括乙醇、甲醛、苯扎溴銨（新

13、潔爾滅）、戊二醛、環(huán)氧乙烷、含氯石灰（漂白粉）和苯酚（石炭酸）等。化學(xué)滅菌主要用來(lái)進(jìn)行皮膚表面、器具及無(wú)菌區(qū)域的滅菌，不能用于培養(yǎng)基的滅菌。 乙醇。乙醇具有殺菌作用，其殺菌能力隨濃度不同而變化，濃度過(guò)高，乙醇會(huì)使微生物細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)凝固，降低其滲透力，影響殺菌效果，濃度過(guò)低則殺菌力減弱。實(shí)驗(yàn)證明，以7075的乙醇?xì)⒕饔米顝?qiáng)。常用于操作臺(tái)面、皮膚及器具表面消毒。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 甲醛。可將甲醛溶液（37）直接加熱，按18mlm2計(jì)算用量，在12h內(nèi)產(chǎn)生的氣態(tài)甲醛可殺滅所有營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞。 還可用氧化熏蒸法，即用高錳酸鉀（用量為甲醛的一半）與甲醛混合，利用氧化反應(yīng)產(chǎn)生的熱量使甲醛揮發(fā)成氣體進(jìn)

14、行殺菌。此法只適用于密閉空間空氣的滅菌。 新潔爾滅（苯扎溴銨）。按所購(gòu)商品1：50稀釋后，可用于皮膚表面、操作臺(tái)面及有關(guān)器具消毒。本品配制后的溶液可反復(fù)使用40次。 生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 石炭酸。石炭酸是一種常用的消毒劑，其滲透力很強(qiáng)，配成35的水溶液，可用于接種室內(nèi)噴霧，進(jìn)行桌面、地面和墻壁的消毒。 氣體滅菌法。氣體滅菌是使用氣體化學(xué)試劑對(duì)固型材料進(jìn)行滅菌的方法。 此方法適用于不耐熱或不宜沾水的材料。用作滅菌劑的氣體（環(huán)氧乙烷）是可燃性的，毒性很強(qiáng)，使用時(shí)要特別注意安全防護(hù)。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新2培養(yǎng)基與發(fā)酵設(shè)備的滅菌方法 工業(yè)生產(chǎn)上通常采用的蒸汽滅菌法，包括實(shí)罐滅菌（實(shí)消）、空罐滅

15、菌（空消）、連續(xù)滅菌（連消）及附屬設(shè)備滅菌。（1）實(shí)罐滅菌（實(shí)消） 實(shí)消是將配制好的培養(yǎng)基投入發(fā)酵罐中，同時(shí)開動(dòng)攪拌器，通入高溫蒸汽進(jìn)行滅菌。實(shí)消的溫度一般為121。滅菌時(shí)間則視培養(yǎng)基組成、罐容積而定，一般在3060min之間。在滅菌過(guò)程中，應(yīng)讓高溫蒸汽通過(guò)所有與發(fā)酵罐相連的管道、接口、閥門與電極，以避免在這些部位留下死角而引起雜菌污染。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 實(shí)消又分直接加熱和間接加熱兩種形式。 間接加熱是使高溫蒸汽通過(guò)發(fā)酵罐的夾層或內(nèi)部蛇管，與培養(yǎng)基發(fā)生熱交換；而直接加熱則是使經(jīng)純化處理、不含雜質(zhì)的高溫蒸汽通入培養(yǎng)基中，使其溫度在短時(shí)間內(nèi)升至要求的溫度。 在蒸汽與培養(yǎng)基直接接觸時(shí)，有一部

16、分蒸汽要冷凝成水，從而使培養(yǎng)基稀釋，因而在配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)預(yù)先扣除這部分冷凝水。 在實(shí)消過(guò)程中，通常同時(shí)使用直接加熱和間接加熱兩種方式，一般的做法是，用間接加熱方式進(jìn)行預(yù)熱，使罐溫升至8090，然后同時(shí)采用直接加熱和間接加熱兩種方式，使溫度迅速升至121。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 實(shí)消過(guò)的培養(yǎng)基，要采用一定方式將其溫度降至發(fā)酵接種溫度。這部分熱量往往無(wú)法重復(fù)利用，因而，實(shí)消的能耗很高。 值得注意的是，在高溫殺菌的同時(shí)，可能會(huì)引起培養(yǎng)基成分的變化，尤其是維生素等耐熱性差的物質(zhì)尤為如此。糖類與氨基酸等有機(jī)氮源在高溫滅菌時(shí)容易形成5羥基糠醛和其他棕色物質(zhì)，對(duì)微生物的生長(zhǎng)代謝有一定的毒副作用。 另外，滅

17、菌時(shí)磷酸鹽和碳酸鹽之間相互作用，可形成不溶于水的磷酸鈣，降低可溶性磷的含量。其pH也會(huì)發(fā)生較大幅度的變化，一般滅菌前后培養(yǎng)基pH變化在0.20.5之間，有時(shí)也會(huì)超過(guò)1個(gè)pH單位。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新（2）空罐滅菌（空消） 空罐滅菌即發(fā)酵罐罐體的滅菌。空罐滅菌一般維持罐壓1.51052.0105Pa、罐溫125130、時(shí)間3045min。滅菌時(shí)要求總蒸汽壓力不低于3010535105Pa，使用壓力不低于2510530105Pa。滅菌后為避免罐壓急速下降造成負(fù)壓，要等到經(jīng)過(guò)連續(xù)滅菌的無(wú)菌培養(yǎng)基輸入罐內(nèi)后，才可以開冷卻水冷卻。（3）連續(xù)滅菌（連消） 培養(yǎng)基通過(guò)連續(xù)滅菌裝置、進(jìn)行快速連續(xù)加熱滅菌，

18、并快速冷卻，再立即輸入預(yù)先經(jīng)過(guò)空罐滅菌后的發(fā)酵罐中，需要較高的溫度和較短的時(shí)間。其操作包括以下步驟：生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 培養(yǎng)基預(yù)熱。將料液預(yù)熱到6075，避免連續(xù)滅菌時(shí)由于料液與蒸汽溫度相差過(guò)大而產(chǎn)生水汽撞擊聲。 連續(xù)滅菌。連續(xù)滅菌是在連消塔中完成的。連消塔的主要作用是使高溫蒸汽與料液迅速接觸混合，并使料液溫度很快升高到滅菌溫度。 連續(xù)滅菌的溫度一般以126132為宜，由于輸送培養(yǎng)基的連消泵的出口壓力一般為6105Pa，所以總蒸汽壓力要求達(dá)到4510550105Pa以上。只有當(dāng)兩者壓力接近，培養(yǎng)基流速才能均勻穩(wěn)定，否則流速非快即慢，影響滅菌質(zhì)量。生物制藥工藝技術(shù)基

19、礎(chǔ)最新 維持滅菌溫度。由于連消塔加熱時(shí)間較短，光靠這短時(shí)間的滅菌是不夠的。因此，利用維持罐使料液在滅菌溫度下保持57min，以達(dá)到滅菌的目的。維持罐的罐壓一般維持在4105左右。 冷卻 生產(chǎn)上一般采用冷水噴淋冷卻，即用冷水在排管外從上向下噴淋，使管內(nèi)料液逐漸冷卻。一般料液冷卻到4050后，輸送到預(yù)先空消過(guò)的罐內(nèi)。在冷水噴淋前，冷卻管內(nèi)應(yīng)充滿填料。 連續(xù)滅菌的時(shí)間短、溫度較高，培養(yǎng)基受到的破壞較少，故質(zhì)量較好。連續(xù)滅菌時(shí)蒸汽負(fù)荷均衡一致。但不足之處是所需設(shè)備較多。操作較麻煩，染菌的機(jī)會(huì)相應(yīng)增多。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新（4）發(fā)酵附屬設(shè)備及管路的滅菌 發(fā)酵附屬設(shè)備有總空氣過(guò)濾器、管道、計(jì)量罐、補(bǔ)料

20、罐等。 一般糖水罐滅菌時(shí)罐壓為l105Pa、時(shí)間為30min：油罐（消沫劑罐）滅菌的蒸汽壓力為1.51051.8105Pa、時(shí)間為60min。 總空氣過(guò)濾器滅菌時(shí)，滅菌時(shí)的蒸汽壓力為3.5105Pa左右，總過(guò)濾器內(nèi)壓控制為1.51052.0105Pa（表壓），滅菌時(shí)間為2h。滅菌完畢，自上端輸入空氣，自上而下吹干過(guò)濾介質(zhì)。 生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 管道滅菌的蒸汽壓力不應(yīng)低于3.4105Pa（表壓），滅菌時(shí)間為1h。新安裝的管道或長(zhǎng)期未使用的管道滅菌時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)到1.5h。滅菌后以無(wú)菌空氣保壓，自然冷卻30min即可交付使用。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新（四）微生物的培養(yǎng)方法 將微生物接種于培養(yǎng)

21、基中，在特定的條件下增殖，此過(guò)程稱為培養(yǎng)。特定條件一般是指溫度、通氣、pH和培養(yǎng)基組成。1培養(yǎng)裝置（l）恒溫箱 它是將微生物保持在一定溫度進(jìn)行培養(yǎng)的器具?？捎糜谛泵婧推桨屐o置培養(yǎng)。（2）振蕩培養(yǎng)器 用于好氣菌的液體培養(yǎng)。旋轉(zhuǎn)式振蕩器：三角燒瓶。往復(fù)式振蕩器：試管、三角燒瓶等。獨(dú)臂振蕩器：L型管。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新（3）其他 對(duì)于嫌氣菌或分解氣體菌的培養(yǎng)，使用密閉型或能夠交換氣體的容器。 大量液體培養(yǎng)使用發(fā)泡塔、發(fā)酵桶、發(fā)酵罐。特殊裝置。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新2培養(yǎng)方法（1）固體培養(yǎng)法 斜面培養(yǎng)。對(duì)于細(xì)菌、酵母，用接種針在斜面培養(yǎng)上劃一條直線或全面涂抹；對(duì)于霉菌，則取一部分孢子或菌絲體在

22、斜面上劃成彎曲鉤狀，然后進(jìn)行培養(yǎng)。 平板培養(yǎng)。對(duì)于細(xì)菌、酵母，在平板培養(yǎng)基上適當(dāng)涂抹，對(duì)于霉菌，接種時(shí)要將平板反過(guò)來(lái)，從下輕輕一點(diǎn)即可，然后再翻過(guò)來(lái)培養(yǎng)。 穿刺培養(yǎng)。常用于嫌氣菌（乳酸菌等）的保藏或明膠的液化試驗(yàn)等。它用接種針對(duì)深層培養(yǎng)基穿刺接種后培養(yǎng)，若是產(chǎn)生氣體的菌會(huì)發(fā)生龜裂現(xiàn)象。 生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 其他固體培養(yǎng)法。此類培養(yǎng)為用米曲、馬鈴薯和面包進(jìn)行的培養(yǎng)。（2）液體培養(yǎng)法 靜止培養(yǎng)法。一般用于酵母、嫌氣性細(xì)菌、兼性嫌氣性細(xì)菌的培養(yǎng)以及各種生理試驗(yàn)等。對(duì)于霉菌也可在液體培養(yǎng)基中使用稱作表面培養(yǎng)的靜置培養(yǎng)法。 振蕩培養(yǎng)法。這是實(shí)驗(yàn)室最常使用的好氣性菌、兼性菌的液體培養(yǎng)法。生物制藥工藝

23、技術(shù)基礎(chǔ)最新 為提高攪拌效果，增加通氣量，可在裝有檔板的燒瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)，此時(shí)必須控制液量不要使塞弄濕，因?yàn)槿礉窈笠孜廴倦s菌，并同時(shí)降低通氣效果。試管振蕩器主要用于菌種篩選等大量菌株的處理。 通氣攪拌培養(yǎng)法。在發(fā)泡塔、發(fā)酵桶、發(fā)酵罐等容器內(nèi)的培養(yǎng)，均采用通氣攪拌式的大規(guī)模培養(yǎng)。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新三、發(fā)酵過(guò)程的控制（一）發(fā)酵過(guò)程的主要控制參數(shù) 1、物理參數(shù) （1）溫度（） 指發(fā)酵整個(gè)過(guò)程或不同階段所維持的溫度。 （2）壓力（Pa） 這是發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵罐維持的壓力。罐內(nèi)維持正壓可以防止外界空氣中的雜菌侵入而避免污染，以保證純種培養(yǎng)。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 （3）攪拌轉(zhuǎn)速（rmin） 指攪拌器在

24、發(fā)酵過(guò)程中的轉(zhuǎn)動(dòng)速度，通常以每lmin的轉(zhuǎn)速來(lái)表示，它的大小與氧容量傳遞速率與發(fā)酵液的均勻性有關(guān)。 （4）攪拌功率（kW） 指攪拌器攪拌時(shí)所消耗的功率，常指每lm3發(fā)酵液所有消耗均功率（kW/m3）。它的大小與氧容量傳遞系數(shù)KLa有關(guān)。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新（5）空氣流量L（Lmin）空氣流量是每1min內(nèi)每單位體積發(fā)酵液通入空氣的體積，也是需氧發(fā)酵的控制參數(shù)。它的大小與氧的傳遞和其他控制參數(shù)有關(guān)。一般控制在0.51.0L（Lmin）范圍內(nèi)。（6）黏度（Pas） 黏度大小可以作為細(xì)胞生長(zhǎng)或細(xì)胞形態(tài)的一項(xiàng)標(biāo)志，也能反映發(fā)酵罐中菌絲分裂過(guò)程的情況。通常以表觀黏度表示。它的大小可改變氧傳遞的阻力，

25、又可表示相對(duì)菌體濃度。（7）濁度（） 濁度能及時(shí)反應(yīng)單細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的參數(shù)，對(duì)某些產(chǎn)品的生產(chǎn)是極其重要的。（8）料液流量（Lmin） 這是控制流體進(jìn)料的參數(shù)。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新2、化學(xué)參數(shù)（1）pH（酸堿度）發(fā)酵液的pH是發(fā)酵過(guò)程中各種產(chǎn)酸和產(chǎn)堿的生化反應(yīng)的綜合結(jié)果。它是發(fā)酵工藝控制的重要參數(shù)之一。（2）基質(zhì)濃度（g100ml或mg100ml）指發(fā)酵液中糖、氮、磷等重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度。它的變化對(duì)產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成有重要的影響，也是提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的重要控制手段。（3）溶解氧濃度106（ppm）或飽和度（） 溶解氧是需氧菌發(fā)酵的必備條件。利用溶氧濃度的變化，可了解產(chǎn)生菌對(duì)氧利用的規(guī)律，

26、反映發(fā)酵的異常情況。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新（4）氧化還原電位（mV） 培養(yǎng)基的氧化還原電位是影響微生物生長(zhǎng)及其生化活性的因素之一。（5）產(chǎn)物的濃度（gml或Uml） 這是發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量高低或合成代謝正常與否的重要參數(shù)，也是決定發(fā)酵周期長(zhǎng)短的根據(jù)。（6）廢氣中的氧濃度（h） 廢氣中氧含量與產(chǎn)生菌的攝氧率和KLa有關(guān)。（7）廢氣中的CO2濃度（） 測(cè)定廢氣中的CO2可以算出產(chǎn)生菌的呼吸熵，從而了解產(chǎn)生菌的呼吸代謝規(guī)律。 除上述外，還有跟蹤細(xì)胞生物活性的其他參數(shù)，需要時(shí)可查有關(guān)資料。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新3生物參數(shù)（1）菌絲形態(tài) 絲狀菌發(fā)酵過(guò)程中菌絲形態(tài)的改變是生化代謝變化的反映。一般都以菌絲形態(tài)

27、作為衡量種子質(zhì)量、區(qū)分發(fā)酵階段、控制發(fā)酵過(guò)程的代謝變化和決定發(fā)酵周期的依據(jù)之一。（2）菌體濃度 菌體濃度是控制微生物發(fā)酵的重要參數(shù)之一，特別是對(duì)抗生素次級(jí)代謝產(chǎn)物的發(fā)酵。在生產(chǎn)上，常根據(jù)菌體濃度來(lái)決定適合補(bǔ)料量和供氧量，以保證生產(chǎn)達(dá)到預(yù)期的水平。 根據(jù)發(fā)酵液的菌體量和單位時(shí)間的菌濃、溶氧濃度、糖濃度、氮濃度和產(chǎn)物濃度的之比值，這些參數(shù)也是控制產(chǎn)生菌代謝、決定補(bǔ)料和供氧條件的主要依據(jù)，多應(yīng)用于發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新（二）發(fā)酵過(guò)程的變化規(guī)律與控制 1、分批發(fā)酵 分批培養(yǎng)是指在一封閉培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)含有初始限制量的基質(zhì)的發(fā)酵方法。 （1）遲滯期 在接種后，這是一個(gè)不生長(zhǎng)期。遲滯期的長(zhǎng)短

28、與3個(gè)因素有關(guān)， 一是新的培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件與舊的越接近，則一般遲滯期越短； 二是種子的質(zhì)量，一般移種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的比移種其他生長(zhǎng)期的細(xì)胞遲滯期短； 三與接種量有關(guān)，接種量大，遲滯期要相對(duì)短些。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新（2）對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 在這個(gè)分期中，細(xì)胞的生長(zhǎng)率逐漸加大，達(dá)到最大生長(zhǎng)率，此時(shí)將菌體濃度的自然對(duì)數(shù)與時(shí)間作圖可得一直線。處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的微生物其各種酶系的活力最強(qiáng)，因此工業(yè)生產(chǎn)中，常以此作為種子移入新環(huán)境中以縮短發(fā)酵過(guò)程中的遲滯期。（3）減速期和穩(wěn)定期 在培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物逐步耗盡，微生物生長(zhǎng)速度變慢（進(jìn)入減速期），直至停止（進(jìn)入穩(wěn)定期）。由于這一時(shí)期菌體代謝十分活躍，有許

29、多次級(jí)代謝產(chǎn)物在此期合成，因此也被稱為生產(chǎn)期或分化期。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新2、補(bǔ)料分批發(fā)酵 在發(fā)酵過(guò)程中采用補(bǔ)料分批培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)越性如下。（1）可使底物的殘留濃度保持在較低的水平，以免微生物受到這些底物的調(diào)節(jié)作用。（2）能夠增加微生物細(xì)胞的合成能力。通過(guò)補(bǔ)料工藝能夠不斷地提供足夠的養(yǎng)料用于合成微生物細(xì)胞。（3）能夠提高非生長(zhǎng)偶聯(lián)型產(chǎn)物（如抗生素等次級(jí)代謝產(chǎn)物）的合成量。（4）可以解除快速利用底物而造成的阻遏效應(yīng)。（5）能夠降低發(fā)酵液的黏度，提高溶解氧的濃度。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新3、連續(xù)發(fā)酵 所謂連續(xù)發(fā)酵是指培養(yǎng)基料液連續(xù)輸入發(fā)酵罐，并同時(shí)放出含有產(chǎn)品的發(fā)酵液的過(guò)程。連續(xù)發(fā)酵具有以下3個(gè)

30、優(yōu)點(diǎn)。（l）能維持較低的基質(zhì)濃度，有利于產(chǎn)物形成。（2）可以提高設(shè)備利用率和單位時(shí)間的產(chǎn)量，節(jié)省發(fā)酵罐的非生產(chǎn)時(shí)間。（3）由于發(fā)酵罐內(nèi)微生物、基質(zhì)、產(chǎn)物和溶解氧濃度等各種參數(shù)維持在一定水平，故便于自動(dòng)化控制。 連續(xù)發(fā)酵由于長(zhǎng)時(shí)間的連續(xù)培養(yǎng)難以保證純種培養(yǎng)。且菌種發(fā)生變異的可能性較大。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新（三）發(fā)酵過(guò)程的重要影響參數(shù)與控制1、溫度的影響及與控制 不同的微生物菌種的最適生長(zhǎng)溫度和產(chǎn)物形成的最適溫度都是不同的。在發(fā)酵過(guò)程中，可用發(fā)酵熱代表整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中釋放出來(lái)的凈熱量： Q發(fā)酵Q生物Q攪拌Q蒸發(fā)Q濕Q輻射 最適發(fā)酵溫度隨菌種、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件和菌體生長(zhǎng)階段而改變，理論上，在整

31、個(gè)發(fā)酵過(guò)程中不應(yīng)只選一個(gè)培養(yǎng)溫度，而應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)的不同階段調(diào)整溫度，以達(dá)到最佳效果。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新2、pH的影響與控制 微生物生長(zhǎng)都有最適pH范圍及其變化的上下限，超出此上下限，菌體將無(wú)法忍受而自溶。pH對(duì)產(chǎn)物的合成也有明顯的影響。合適的pH是根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果來(lái)確定的。 在發(fā)酵過(guò)程中，首先考慮和試驗(yàn)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)配方，采用適當(dāng)?shù)呐浔?，使發(fā)酵過(guò)程中pH變化在合適的范圍內(nèi)。因?yàn)榕囵B(yǎng)基中含有代謝產(chǎn)酸和代謝產(chǎn)堿物質(zhì)以及緩沖劑，它們?cè)诎l(fā)酵過(guò)程中要影響pH的變化。 如果達(dá)不到要求，就可在發(fā)酵過(guò)程中直接補(bǔ)加酸或堿和補(bǔ)料的方式來(lái)控制。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新3、溶氧的影響與控制 溶氧是需氧發(fā)酵控制的最重

32、要參數(shù)之一。氧在水中的溶解度很小、所以需要不斷通氣和攪拌，才能滿足溶氧的要求。 溶氧高雖然有利于菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成，但溶氧太大有時(shí)反而會(huì)抑制產(chǎn)物的形成。因此需考查每種發(fā)酵的臨界氧濃度和最適氧濃度。 在已有設(shè)備和正常的發(fā)酵條件下，每種產(chǎn)物發(fā)酵過(guò)程中溶氧的變化都有自己的規(guī)律，并與菌體自身的繁殖和代謝密切相關(guān)。 出現(xiàn)溶氧濃度明顯降低或明顯升高的異常變化，這可能有幾種原因：生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 污染了好氣性雜菌，大量的溶氧消耗； 菌體代謝發(fā)生異?，F(xiàn)象，需氧要求增加，使溶氧下降； 某些設(shè)備或工藝控制發(fā)生故障或變化，如攪拌功率消耗變小或攪拌速度下降等，也可能引起溶氧的下降。因此，從發(fā)酵液中溶解氧的濃度

33、的變化，可了解微生物代謝是否正常，工藝控制是否合理。 設(shè)備供氧能力是否充足等問(wèn)題，以幫助查找不正常的原因和控制好發(fā)酵生產(chǎn)。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新4二氧化碳的影響與控制 CO2是微生物生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中的代謝產(chǎn)物，也是某些合成代謝的基質(zhì)，對(duì)微生物生長(zhǎng)和發(fā)酵具有刺激或抑制作用。 CO2還能使發(fā)酵液的pH下降，或與其他物質(zhì)如生長(zhǎng)所必需的金屬離子形成碳酸鹽沉淀等，造成間接作用而影響菌的生長(zhǎng)代謝和產(chǎn)物的合成。 CO2在發(fā)酵液中的大小受到許多因素的影響，由于CO2的溶解度隨壓力增加而增大，大發(fā)酵罐中發(fā)酵液的靜壓較大，尤其在罐的底部，CO2濃度較大。形成碳酸，進(jìn)而影響菌體的呼吸和產(chǎn)物的合成。 生物制藥工藝技術(shù)

34、基礎(chǔ)最新 采用增加罐壓的方法來(lái)消泡。也會(huì)增加CO2的溶解度，對(duì)菌體產(chǎn)生不利的影響。 CO2濃度的控制可通過(guò)通氣攪拌來(lái)控制，對(duì)其形成的碳酸，可用堿來(lái)中和，罐壓的調(diào)節(jié)，也影響CO2的濃度，對(duì)菌體代謝和其他參數(shù)產(chǎn)生影響。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新5泡沫的影響與控制 在大多數(shù)微生物發(fā)酵過(guò)程中，由于培養(yǎng)基中有蛋白質(zhì)類表面活性劑存在，在通氣條件下，培養(yǎng)液中就形成了泡沫，起泡會(huì)帶來(lái)許多不利因素，如發(fā)酵罐的裝料系數(shù)減少，氧傳遞系數(shù)減小等。泡沫過(guò)多時(shí)，可能會(huì)造成大量逃逸，發(fā)酵液從排氣管路或軸封逃出而增加染菌機(jī)會(huì)等。所以，控制泡沫乃是正常發(fā)酵的基本條件。 泡沫的控制，可采用調(diào)整培養(yǎng)基成分、改變某些物理化學(xué)參數(shù)或者改

35、變發(fā)酵工藝來(lái)控制，但這些方法的效果有一定限度。采用消沫的方法是公認(rèn)的比較好的方法。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 消沫可以用機(jī)械消沫和消沫劑消沫兩大類方法： 機(jī)械消沫是利用機(jī)械強(qiáng)烈振動(dòng)或壓力變化而使泡沫破裂，常用在罐內(nèi)靠消沫漿轉(zhuǎn)動(dòng)打碎泡沫，但消沫效果不理想。 另一種消沫的方法是采用外加消沫劑，使泡沫破裂。 常用的消沫劑主要有天然油脂類，高碳醇、脂肪酸和酯類，聚醚類，硅酮類等。其中以天然油脂類和聚醚類在微生物發(fā)酵中最為常用。 天然油脂中有豆油、玉米油、棉籽油、菜籽油和豬油等。油不僅可作消沫劑，還可作為碳源和發(fā)酵控制的手段。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新第三節(jié) 生物技術(shù)制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)、基因工程制藥技術(shù)基礎(chǔ)

36、基因工程藥物制造過(guò)程的主要程序是：獲得目的基因構(gòu)建DNA重組體將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞鑒定篩選陽(yáng)性克隆構(gòu)建基因工程菌（或工程細(xì)胞）培養(yǎng)工程菌分離純化表達(dá)產(chǎn)物除菌過(guò)濾半成品檢定制劑成品檢定包裝， 以上程序的每個(gè)階段都包含若干操作技術(shù)單元，并依產(chǎn)品的性質(zhì)，隨研究和生產(chǎn)條件的不同而有所改變。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 通常將上述制造過(guò)程分為上游和下游兩個(gè)階段。 上游階段是研究開發(fā)基因工程藥物的必不可少的基礎(chǔ)，主要包括分離獲得的目的基因，獲得重組DNA，陽(yáng)性克隆的篩選與鑒定及構(gòu)建工程菌（工程細(xì)胞）等步驟。 下游階段是從工程菌（工程細(xì)胞）的大規(guī)模培養(yǎng)直到產(chǎn)品的純化、制劑和成品的檢定與包裝。上游階段的工作主要在

37、實(shí)驗(yàn)室完成， 其主要技術(shù)過(guò)程分為下列5個(gè)部分。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新1、獲得具有遺傳信息的目的基因 從復(fù)雜的生物體基因組中采用不同方法分離并獲得帶有目的基因的DNA片段。獲得目的基因主要通過(guò)下述方法。（1）鳥槍克隆法 一般包括提取細(xì)胞總DNA，經(jīng)過(guò)酶切、克隆至特定載體，再轉(zhuǎn)化至特定宿主細(xì)胞，構(gòu)建成具有一定大小的基因文庫(kù)，以同源基因?yàn)樘结?，進(jìn)行雜交獲得的目的基因。（2）人工合成目的基因 人工合成目的基因主要采用下列3種途徑。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 酶促方法。經(jīng)提取獲得編碼基因的信息RNA（mRNA），在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成互補(bǔ)DNA（cDNA）鏈，在DNA聚合酶I的作用下，加工成為雙鏈DN

38、A分子。 化學(xué)合成法。 前提是必須已知基因的核苷酸序列，化學(xué)合成的DNA片段一般較短，需要用DNA連接酶進(jìn)行連接，從而獲得較長(zhǎng)的DNA片段。 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）。先決條件是必須已知基因的核苷酸序列，根據(jù)序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的目的基因。也可以采用反轉(zhuǎn)錄PCR（RT PCR）等方法，直接從富含目的基因的實(shí)驗(yàn)材料提取RNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下獲得cDNA，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得目的基因。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 2、選擇基因載體構(gòu)建重組DNA 在體外將含目的基因的DNA片段和具有自我復(fù)制功能、并帶有選擇標(biāo)記的載體分子進(jìn)行酶切連接，獲得重組DNA分子。常見基因載體有質(zhì)粒、噬菌體、

39、黏粒、病毒載體等。 3、將重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞 采用特定的方法將重組DNA分子轉(zhuǎn)移至適當(dāng)受體細(xì)胞（也稱寄主細(xì)胞），并與之同步增殖。被導(dǎo)入的受體細(xì)胞分為兩大類：第一類為原核細(xì)胞；第二類為真核細(xì)胞，此外為動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞。另外也可以導(dǎo)入動(dòng)物和植物體。 導(dǎo)入的方法主要有轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染等方法，此外也可采用電融合、顯微注射和基因槍等技術(shù)。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 4、鑒定帶有目的基因的克隆 從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出克隆有重組DNA分子的寄主細(xì)胞。針對(duì)不同基因的表達(dá)產(chǎn)物，采用各自特有的測(cè)活方法；也可以采用酶聯(lián)免疫方法確定其抗原性；以目的基因?yàn)樘结?，通過(guò)DNA雜交方法可以直接確定重組子。 5、目的

40、基因的擴(kuò)增及獲得目的產(chǎn)物 培養(yǎng)克隆有目的基因的重組子，提取獲得擴(kuò)增的目的基因以進(jìn)行深入的研究。 將目的基因克隆至適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，采用特定的方法將基因?qū)胧荏w細(xì)胞，使其在新的遺傳背景下獲得活性表達(dá)，從而得到人類需要的特定目的物質(zhì)。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新（一）基因工程的主要操作技術(shù) 1、目的基因的制備 為實(shí)現(xiàn)某一目的基因（靶基因）的轉(zhuǎn)移與表達(dá)，首先必須克隆得到該基因。在技術(shù)路線或操作細(xì)節(jié)技巧上也會(huì)有所差異。 目前常用的有三種方法： 構(gòu)建cDNA文庫(kù)，篩選目的cDNA； 通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法得到目的基因； 人工化學(xué)合成方法制備。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新（1）cDN

41、A文庫(kù)的建立與目的基因的分離 在高等生物中由于結(jié)構(gòu)基因是由外顯子（蛋白質(zhì)編碼序列）與內(nèi)含子（非蛋白質(zhì)編碼的間隔序列）排列組成的，其轉(zhuǎn)錄物需要經(jīng)過(guò)剪接去除內(nèi)含子，使外顯子連接加工產(chǎn)生成熟的mRNA，為獲得完整的能直接進(jìn)行表達(dá)的真核生物編碼目的基因，就必須構(gòu)建cDNA文庫(kù)。 所謂cDNA是指以mRNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成的互補(bǔ)DNA，不含有任何內(nèi)含子序列，可以在任何一種生物體中進(jìn)行表達(dá)。將細(xì)胞總mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并獲得克隆，由此得到的cDNA克隆群體稱為cDNA克隆群體，也稱為cDNA文庫(kù)，它代表了某種生物的全部mRNA序列，即蛋白質(zhì)編碼信息。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新（2）通過(guò)PCR

42、技術(shù)制備目的基因 PCR基本原理 PCR技術(shù)可在短時(shí)間內(nèi)于試管中獲得數(shù)百萬(wàn)個(gè)特異DNA序列的拷貝。它實(shí)際上是在欲擴(kuò)增的目的DNA的兩側(cè)設(shè)計(jì)一對(duì)正向和反向引物，在模板DNA以及四種脫氧核糖核酸（4dNTPs）底物存在的條件下由TaqDNA聚合酶所引導(dǎo)催化的DNA擴(kuò)增酶促反應(yīng)。 PCR由3個(gè)基本反應(yīng)組成： a、高溫變性。通過(guò)加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA。 生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 b、低溫退火。使溫度下降，引物與模板DNA中所要擴(kuò)增的目的序列的兩側(cè)互補(bǔ)序列進(jìn)行配對(duì)結(jié)合。 c、適溫延伸。在TaqDNA聚合酶、4dNTPs及Mg2存在下，引物3端向前延伸，合成與模板堿基充列完全

43、互補(bǔ)的DNA鏈。以上變性、退火和延伸便構(gòu)成一個(gè)循環(huán)，數(shù)小時(shí)之后（約2530次循環(huán)），介于兩引物間的目的DNA片段便可擴(kuò)增105107拷貝（圖2 11）。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 通過(guò)在引物的5端添加額外的與模板不互補(bǔ)的所需DNA序列，如限制性酶切位點(diǎn)、起始密碼子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、啟動(dòng)子、終止密碼及終止子等，便可以將其引入目的基因中，從而方便進(jìn)行目的基因的克隆、表達(dá)與調(diào)控研究。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新（3）人工合成目的基因 最簡(jiǎn)單的辦法就是首先利用化學(xué)合成法分別合成兩條互補(bǔ)的寡核苷酸鏈，然后讓這兩條鏈在適當(dāng)條件下退火，形成雙鏈。但是這種方法僅限于合成組裝較短的基因（6080bp），這是由于隨著寡

44、核苷酸鏈合成長(zhǎng)度的增加，出錯(cuò)率也會(huì)增加，同時(shí)產(chǎn)物的得率也會(huì)下降。 人們嘗試采用了多種人工基因組裝方法（圖2 12）。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 2、重組子的構(gòu)建 目的基因必須與載體連接形成一種重組DNA分子，并轉(zhuǎn)入相應(yīng)的宿主細(xì)胞后才能實(shí)現(xiàn)目的基因的克隆與表達(dá)。 根據(jù)目的基因片段的來(lái)源與類型不同，可以采取不同的連接策略，目前應(yīng)用較多的連接方式有3種：黏端連接、平端連接和TA克隆。（1）黏端連接 黏端連接是指目的基因與載體之間具有彼此互補(bǔ)的黏性末端，在較低的溫度下可以形成氫鍵，再通過(guò)T4DNA連接酶便可以連接成完整的重組DNA分子。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新（2）平端連接 有時(shí)

45、為了滿足實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的需要，必須進(jìn)行DNA的平齊末端之間進(jìn)行連接。因?yàn)槌齼?nèi)切酶酶切DNA直接產(chǎn)生的平齊末端分子外，黏性末端通過(guò)一定的修飾也能產(chǎn)生平齊末端。平齊末端的連接效率較低。因此，在進(jìn)行平齊末端連接時(shí)一般需加入更多的T4DNA連接酶，同時(shí)適當(dāng)提高DNA底物濃度。（3）TA克隆 TA克隆是一種直接將PCR基因產(chǎn)物進(jìn)行快速克隆的方法。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 其原理是，在PCR反應(yīng)過(guò)程中熱穩(wěn)定聚合酶（即Taq聚合酶）可以向PCR產(chǎn)物的3末端加上一個(gè)不依賴于模板的腺苷酸（A）。利用這個(gè)末端突出的3A，即可將PCR產(chǎn)物直接插入到插入位點(diǎn)只有一個(gè)3T突出的線性T載體分子。這種方法只限于PCR產(chǎn)物的克隆，

46、且必須采用3T突出的T載體。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新3、DNA重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞技術(shù)（1）DNA重組體導(dǎo)入微生物細(xì)胞的方法 轉(zhuǎn)化作用。轉(zhuǎn)化是指微生物細(xì)胞直接吸收外源DNA的過(guò)程，而通過(guò)轉(zhuǎn)化接受了外源DNA的細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)化子。 在分子克隆中，宿主細(xì)胞需經(jīng)人工處理成能吸收重組DNA分子的敏感細(xì)胞才能用于轉(zhuǎn)化，此時(shí)的細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞。 將細(xì)菌處于0的CaCl2低滲溶液中，細(xì)胞膨脹成球型（感受態(tài)），經(jīng)42短時(shí)間熱沖擊后，細(xì)胞可吸收外源DNA，在豐富培養(yǎng)基上生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞復(fù)原，并分裂增殖。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 除化學(xué)法轉(zhuǎn)化細(xì)菌外，還可采用高壓脈沖電擊轉(zhuǎn)化法，電擊法不需要預(yù)先誘導(dǎo)細(xì)菌的感受態(tài)，

47、依靠短暫的電擊，促使DNA進(jìn)入細(xì)胞。 轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。噬菌體載體所構(gòu)建的重組DNA分子可以直接感染進(jìn)入E.coli寄主細(xì)胞內(nèi)，這叫轉(zhuǎn)染，但轉(zhuǎn)移效率很低。 為了提高轉(zhuǎn)移效率，重組的噬菌體DNA或重組的黏粒DNA必須包裝成完整的噬菌體顆粒，通過(guò)溫和噬菌體顆粒的釋放和感染將重組DNA轉(zhuǎn)移至宿主內(nèi)，這稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)，而通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)接受外源DNA的細(xì)胞則稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子。 生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新（2）DNA重組體導(dǎo)入動(dòng)植物細(xì)胞的方法 隨著高等動(dòng)植物細(xì)胞基因工程的發(fā)展，人們發(fā)明了多種基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，根據(jù)原理不同，主要可分為物理方法、化學(xué)方法和生物學(xué)方法3大類，見表2 6。4、篩選與鑒定帶有目的基因的陽(yáng)性克隆 為了提高篩選效率，

48、建立好的篩選模型十分重要。因此，在進(jìn)行基因克隆實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)首先必須考慮重組子的篩選方案，根據(jù)目的基因的特性，選擇合適的載體與宿主細(xì)胞。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新（1）根據(jù)遺傳表型差異進(jìn)行篩選 由于外源基因的插入使得載體分子上的一些篩選標(biāo)記基因的失活，從而導(dǎo)致宿主細(xì)胞的某些遺傳表型的改變，便可直接篩選出重組子菌落。 抗藥性篩選。在含有兩個(gè)抗藥性基因的載體中，插入失活其中一個(gè)基因，再用兩個(gè)不同抗性平板對(duì)照篩選出重組子。 半乳糖酶顯色反應(yīng)選擇。 噬菌斑形成能力 沒(méi)有外源DNA插入的載體不能包裝成噬菌體顆粒，不能感染細(xì)菌形成噬菌體。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新（2）根據(jù)重組子的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行篩選 快速裂解菌落比

49、較重組DNA分子大小。直接進(jìn)行凝膠電泳。 限制性內(nèi)切酶分析。即快速提取質(zhì)粒DNA，用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，與分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)作對(duì)照，根據(jù)片段的大小和酶譜特征判斷是否為陽(yáng)性克隆。 原位雜交。原位雜交是以基因探針檢出培養(yǎng)板上陽(yáng)性重組子菌落位置的技術(shù)。是從基因文庫(kù)篩選陽(yáng)性克隆的首選方法。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 PCR篩選法。 根據(jù)目的基因兩端已知核苷酸序列設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求的不同快速抽提宿主細(xì)胞質(zhì)粒DNA或染色體DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，將擴(kuò)增反應(yīng)物進(jìn)行凝膠電泳分析，若出現(xiàn)特異片段的擴(kuò)增條帶，即說(shuō)明該克隆為陽(yáng)性克隆。 該法快速、靈敏、簡(jiǎn)單、易行，

50、廣泛應(yīng)用于陽(yáng)性重組子的篩選。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新5、基因表達(dá)系統(tǒng) 基因工程的最終目的是在合適的宿主系統(tǒng)中使目的基因獲得高效表達(dá)，從而生產(chǎn)出有重要價(jià)值的目的蛋白質(zhì)或多肽。（1）大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)雖然不能像真核系統(tǒng)那樣進(jìn)行翻譯后加工（尤其不能進(jìn)行糖基化），因此像EPO等需要糖基化才有活性的目的蛋白不能在該體系進(jìn)行表達(dá)。但它具有遺傳背景比較清楚，使用安全、技術(shù)操作簡(jiǎn)便，繁殖力強(qiáng)（平均2030min即可繁殖一代），便于大規(guī)模培養(yǎng)，成本較低，表達(dá)水平較高，下游技術(shù)成熟、易于控制。是目前使用最廣泛、最成功的表達(dá)系統(tǒng)。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 啟動(dòng)子和終止子。啟動(dòng)子是DNA鏈上一段能與R

51、NA聚合酶結(jié)合并啟動(dòng)mRNA合成的長(zhǎng)4050bp序列。原核生物啟動(dòng)子包括兩個(gè)高度保守區(qū)域，一是Pribnow box，位于起始位點(diǎn)上游510bp，由68bp組成，富含A、T，故又稱為TATA box或10區(qū)，來(lái)源不同的啟動(dòng)子，Pribnow box的堿基序列稍有變化； 另一個(gè)是35區(qū)，位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約35bp處，一般由10bp組成。35區(qū)提供了RNA聚合酶識(shí)別信號(hào)。 5ITGACATATAAT3生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 啟動(dòng)子有強(qiáng)弱之分，強(qiáng)啟動(dòng)子與RNA聚合酶結(jié)合緊密，可使基因獲得高水平轉(zhuǎn)錄，弱啟動(dòng)子則相反。 原核啟動(dòng)子聚合酶不能識(shí)別真核細(xì)胞啟動(dòng)子，因此只有將真核基因置于原核生物強(qiáng)啟動(dòng)子

52、下游才能實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)錄。 終止子是指一個(gè)基因或操縱子3末端能有效終止轉(zhuǎn)錄的一段特定的DNA序列。 在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，為了防止過(guò)度轉(zhuǎn)錄而引起載體不穩(wěn)定，以及雜蛋白的合成，一般在外源基因下游插入一強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止子。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 SD（ShineDalgamo）序列。大腸桿菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)外源基因的高效表達(dá)十分重要。mRNA分子上有兩個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)是起始密碼AUG上游311bp處的序列，SD序列富含嘌呤核苷酸，剛好與16s r RNA 3末端的富含嘧啶的序列互補(bǔ)，可促進(jìn)mRNA與核糖體結(jié)合，提高翻譯效率。 SD序列與起始密碼子之間的距離，也是mRNA翻譯效率的重要因素。有人指出，

53、SD序列與AUG之間的最佳距離為（93）bp。 另一個(gè)影響外源基因mRNA翻譯效率的重要因素是mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，通過(guò)減少二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，可以提高mRNA翻譯水平。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 非融合表達(dá)。表達(dá)蛋白的N端不會(huì)有任何其他原核生物肽段的蛋白質(zhì)稱為非融合蛋白。為了實(shí)現(xiàn)非融合表達(dá)，必須將帶有起始密碼AUG的外源基因插到原核啟動(dòng)子和SD序列的下游，組成一個(gè)雜合的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯，表達(dá)出非融合蛋白。 非融合表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)在于，表達(dá)的非融合蛋白與天然蛋白在結(jié)構(gòu)、功能以及免疫原性等基本一致。缺點(diǎn)是，表達(dá)產(chǎn)物N端不可避免地帶上一個(gè)甲硫氨酸，一級(jí)結(jié)構(gòu)與天然蛋白存在差異； 其次，當(dāng)進(jìn)行高表達(dá)時(shí)表達(dá)產(chǎn)

54、物易形成包涵體，包涵體的處理往往需要采用強(qiáng)變性劑將包涵體溶解，然后再進(jìn)行產(chǎn)物復(fù)性，最后才能得到具有生物活性的目的重組蛋白，且復(fù)性得率很低。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 為了阻止非融合蛋白表達(dá)時(shí)形成包涵體，有些研究表明，降低工程菌的培養(yǎng)溫度（從37 降到30）能顯著降低包涵體的形成率。 另外，與硫氧還原蛋白一起進(jìn)行融合表達(dá)，在很多實(shí)例中，可消除包涵體的形成。 生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 融合表達(dá)。當(dāng)小分子外源多肽蛋白在原核系統(tǒng)中表達(dá)時(shí)，很易被宿主細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶降解，為解決這一問(wèn)題，常采用融合表達(dá)方法。 所謂融合表達(dá)就是通過(guò)DNA重組技術(shù)，將外源基因拼接于原核多肽編碼基因下游進(jìn)行表達(dá)。在拼接外源基因時(shí)，

55、應(yīng)使其閱讀框架與原核多肽基因閱讀框架保持一致。這樣表達(dá)出的融合蛋白N端為原核多肽序列，而C端為目的蛋白序列。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新 分泌表達(dá)。所謂分泌表達(dá)是指將目的基因嵌合在信號(hào)肽基因下游進(jìn)行表達(dá)，目的產(chǎn)物在信號(hào)肽介導(dǎo)下分泌至細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中，同時(shí)信號(hào)肽被信號(hào)肽酶識(shí)別并切除，從而可以直接獲得成熟的活性蛋白或多肽產(chǎn)物。 分泌表達(dá)可以防止宿主細(xì)胞對(duì)目的產(chǎn)物的降解，減輕宿主細(xì)胞代謝負(fù)荷，有利于直接形成具有天然構(gòu)象的活性產(chǎn)物，同時(shí)避免了N端非融合表達(dá)中出現(xiàn)的甲硫氨酸延伸的情況。 但分泌表達(dá)的主要缺點(diǎn)是表達(dá)量不高，有時(shí)信號(hào)肽不被切割或不在特異位置上切割等，且并非所有的蛋白都可以在Ecoli沖進(jìn)行分泌表達(dá)。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)最新（2）酵母表達(dá)體系 以往多采用釀酒酵母作為表達(dá)體系，近年來(lái)已被畢赤酵母所替代。 其優(yōu)點(diǎn)是： 轉(zhuǎn)錄外源基因的啟動(dòng)子來(lái)自甲醇調(diào)節(jié)的畢赤酵母乙醇氧化酶I基因，該啟動(dòng)子受甲醇控制，以達(dá)到高效表達(dá)； 易于高密度培養(yǎng)、菌絲干重可達(dá)100gL。 作為表達(dá)體系它有以下特點(diǎn)： 是真核表達(dá)體系，對(duì)表達(dá)蛋白可進(jìn)行折疊