細(xì)胞增殖活性及原位檢測

1、細(xì)胞增殖活性原位檢測技術(shù)及應(yīng)用重慶醫(yī)科大學(xué)病理教研室 葉秀峰細(xì)胞周期（Cell Cycle)一、細(xì)胞周期概述概念：細(xì)胞周期是指連續(xù)分裂的細(xì)胞從上一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂完成所經(jīng)歷的整個(gè)過程。 主要事件：遺傳信息載體DNA復(fù)制，通過有絲分裂將兩份拷貝DNA平均分配到兩個(gè)子代細(xì)胞中分期：分為4個(gè)時(shí)期 .即G1 S G2 M期(一)Gl期(Gap phase) 是指從有絲分裂完成到DNA復(fù)制之前這一階段，包括RNAs及蛋白的合成，所以又稱復(fù)制前期或合成前期。這一時(shí)期細(xì)胞主要活動(dòng)是為DNA的復(fù)制和蛋白質(zhì)合成作準(zhǔn)備，主要特點(diǎn)為：(1)各種細(xì)胞的G1期持續(xù)時(shí)間變化很大。這可能與細(xì)胞在此期增加質(zhì)量有

2、關(guān)。因此，連續(xù)增殖細(xì)胞的增殖率是受G1期細(xì)胞的平均時(shí)間長度控制的，各種細(xì)胞群體之間細(xì)胞周期的差異取決于G1期的長短。 (2)此期發(fā)生了與DNA合成有關(guān)的事件，主要是RNA和蛋白質(zhì)的合成。(3)RNA合成發(fā)生于G1早期，同時(shí)RNA聚合酶水平也迅速增高。(4)G1早期合成結(jié)構(gòu)蛋白和酶蛋白等， G1后期合成與DNA復(fù)制有關(guān)的酶類，如胸苷激酶、脫氧核苷酸激酶等，其中DNA聚合酶活性在G1末期至S初期增高最快。(5)蛋白質(zhì)磷酸化增加。組蛋白磷酸化增加使染色體解旋，以利于DNA復(fù)制；非組蛋白磷酸化增加可能與基因的活化有關(guān)。 (6)染色體狀態(tài)由凝集轉(zhuǎn)變?yōu)榻饽瑸镈NA合成創(chuàng)造條件。 (7)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能增

3、強(qiáng)。(二)S期(synthesis phase) 即DNA合成期或復(fù)制期，S期主要是DNA合成(自我復(fù)制)、遺傳物質(zhì)從二倍體(2n)到四倍體(4n)的整個(gè)過程。其中主要的生物化學(xué)改變是遺傳物質(zhì)的復(fù)制，即DNA的復(fù)制及組蛋白、非組蛋白等染色體蛋白的合成。由于每一條染色體復(fù)制成兩條染色單體，在S期末，DNA含量增加一倍。DNA的準(zhǔn)確復(fù)制保證了分裂后子細(xì)胞遺傳物質(zhì)的平均分配。DNA合成的同時(shí)，形成新的染色質(zhì)的另一重要成分組蛋白的合成也同時(shí)進(jìn)行。(三)G2期(Gap 2 phase) 指DNA復(fù)制完成到有絲分裂開始這段時(shí)間，這段時(shí)間內(nèi)細(xì)胞有2套二倍體染色體，所以又稱復(fù)制后期或合成后期。DNA復(fù)制完成后

4、，細(xì)胞進(jìn)入G2期。處于此期的細(xì)胞DNA合成已終止，但仍然進(jìn)行著RNA和一定的蛋白合成，為細(xì)胞有絲分裂作準(zhǔn)備。(四)M期(mitosis phase) 即有絲分裂期，細(xì)胞在M期進(jìn)行分裂。M期又分為前期、前中期、中期、后期、末期。M期的末期一結(jié)束，就形成兩個(gè)新的子細(xì)胞，一次細(xì)胞周期即告結(jié)束，細(xì)胞就進(jìn)入下一個(gè)細(xì)胞周期的G1期。細(xì)胞有絲分裂是一個(gè)復(fù)雜的過程，必須在DNA復(fù)制完成后，細(xì)胞才能進(jìn)行有絲分裂。此期細(xì)胞呈球形，不很牢固地附在它生長的基質(zhì)上。染色體在此期凝聚后分開，移向細(xì)胞兩端，解聚并再形成兩個(gè)完整的核，最后通過細(xì)胞質(zhì)分裂而結(jié)束M期。有絲分裂是一個(gè)核改組的連續(xù)過程，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征可分為5個(gè)階段：

5、前期(prophase)前中期(early metaphase)中期(metaphase)后期(anphase)末期(telophase) 1前期 這一期主要發(fā)生染色體凝集、分裂極的確定、核仁解體及核膜消失。2. 前中期 主要變化是紡錘體的形成和染色體排列在赤道面上形成赤道板。3中期 從染色體排列到赤道面上到兩條染色單體(子染色體)開始趨向兩極，這段時(shí)期稱為中期。 中期的染色體濃縮成典型形態(tài)，在赤道面上形成赤道板。 4后期 后期是姐妹染色單體分開并移向兩極的時(shí)期，當(dāng)子染色體到達(dá)兩極時(shí)，此期結(jié)束。 染色單體的分開通常由著絲點(diǎn)開始，即兩個(gè)著絲點(diǎn)先分開，然后兩個(gè)染色單體的臂逐漸分開，完全分開后就向兩

6、極移動(dòng)。 5末期 從子染色體到達(dá)兩極后開始到形成兩個(gè)子細(xì)胞這段時(shí)期稱為末期，包括子核的形成與胞質(zhì)分裂兩個(gè)過程。 二、細(xì)胞周期的控制點(diǎn) 細(xì)胞周期能夠順利地發(fā)生、發(fā)展和完成，取決于三個(gè)重要的控制點(diǎn)(control point)，即決定G1期發(fā)生的G1控制點(diǎn)，決定S期發(fā)生的S控制點(diǎn)和決定M期發(fā)生的M控制點(diǎn)。每一個(gè)控制點(diǎn)控制著細(xì)胞周期一定階段的開始，但只有在細(xì)胞周期前一個(gè)階段徹底完成以后才能發(fā)生。 (一) G1控制點(diǎn):在G1期，哺乳動(dòng)物細(xì)胞的趨向有3種可能性：一些細(xì)胞進(jìn)入S期，通過G2期及有絲分裂期，即進(jìn)入增殖周期；一些細(xì)胞離開細(xì)胞周期，處于靜止期，又稱G0期，它們在一定的條件刺激下可重新進(jìn)入增殖周期

7、； 還有一些細(xì)胞向分化方向發(fā)展，使細(xì)胞的功 能向?qū)Ｒ换至涯芰呄驕p弱。 在正常情況下多細(xì)胞的哺乳動(dòng)物體內(nèi)的部分細(xì)胞處于非增殖狀態(tài)的休止期(Go期)，只在一定條件下才進(jìn)人G1期。在G1期的后期中存在一個(gè)類似于酵母周期中起始點(diǎn)的限制點(diǎn)(restriction point，簡稱R點(diǎn))，它在細(xì)胞的每一次分裂中具有控制作用，故稱為G1控制點(diǎn)，只有通過R點(diǎn)的細(xì)胞才能進(jìn)入S-G2-M期。 在通過R點(diǎn)前必須合成一種不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)(p105 RB)，當(dāng)它積累到一定量時(shí)才能通過R點(diǎn)而啟動(dòng)DNA合成。因?yàn)橐坏﹩?dòng)DNA合成后就可通過G2期而進(jìn)入M期，所以R點(diǎn)是控制細(xì)胞增殖的關(guān)鍵，由此出發(fā)，細(xì)胞可能有3種不同的

8、命運(yùn)： (1)繼續(xù)增殖細(xì)胞。這些細(xì)胞在分裂完成之后，可以超過R點(diǎn)繼續(xù)向前發(fā)展，它們不斷離開G1期，并通過細(xì)胞增殖周期中的各個(gè)不同時(shí)期完成細(xì)胞分裂。如骨髓干細(xì)胞，胃、腸上皮中的基底細(xì)胞等。 (2)暫時(shí)不增殖細(xì)胞。這類細(xì)胞在分裂完成后，暫時(shí)處于G。期，并在R點(diǎn)被阻留很長時(shí)間。在正常情況下，這類細(xì)胞不合成DNA也不分裂，但在一定條件下可再進(jìn)入細(xì)胞周期而進(jìn)行增殖。屬于這種類型的有肝細(xì)胞、哺乳動(dòng)物的初級卵母細(xì)胞等。 (3)不增殖細(xì)胞。這類細(xì)胞可以由R點(diǎn)走向分化細(xì)胞，并成為執(zhí)行專門功能的終末分化細(xì)胞。如神經(jīng)細(xì)胞、哺乳動(dòng)物的成熟紅細(xì)胞、皮膚上皮的角質(zhì)細(xì)胞等。(二)S控制點(diǎn) 細(xì)胞在G1期完成后，細(xì)胞質(zhì)中含有D

9、NA復(fù)制的激活因子，叫S期激活因子(S phase activator)。S期激活因子的量決定Gl期完成和細(xì)胞進(jìn)入S期的速度。 DNA復(fù)制完成后，細(xì)胞結(jié)束S期進(jìn)入G2期，某些細(xì)胞可停在G2期，在適當(dāng)?shù)臈l件下進(jìn)入M期重新分裂。(三)M期控制點(diǎn) 細(xì)胞開始有絲分裂時(shí)需要M期激酶(M phase kinase)激活。M期激酶是由2個(gè)亞單位 組成，一個(gè)是催化亞單位p34；另一個(gè)是調(diào)節(jié)亞單位，它是一種細(xì)胞周期蛋白(cyclin)，可以是周期蛋白A或周期蛋白B，它們是在有絲分裂間期不斷合成并積累的。 p34本身沒有活性，當(dāng)它與調(diào)節(jié)亞單位結(jié)合時(shí)，通過調(diào)節(jié)亞單位變構(gòu)形成p34-cyclinA或 p34-cycl

10、inB二聚體。二聚體中的p34蛋白絲氨酸與蘇氨酸殘基去磷酸化，產(chǎn)生激酶活性位點(diǎn)，使細(xì)胞進(jìn)入M期。在M期中，調(diào)節(jié)亞單位被破壞，使M期激酶失活，從而使分裂的兩個(gè)子細(xì)胞分開，結(jié)束M期。 第二節(jié)細(xì)胞周期的調(diào)控 目前，人們已揭示了細(xì)胞周期的主要生物化學(xué)過程，并獲得了自酵母至人類普遍適用的模式。 一細(xì)胞因子與相應(yīng)的受體 細(xì)胞因子是一類能與特異的、高親和性的細(xì)胞外基質(zhì)、可溶性受體及細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號，刺激細(xì)胞增殖的多肽類物質(zhì)。生長因子為一類促進(jìn)細(xì)胞生長的細(xì)胞因子。 根據(jù)生長因子的靶細(xì)胞的不同，可將其 分為兩類：一類為具有廣泛作用的生長因子，如表皮生長因子(EGF)、血小板衍化生長因子(PD

11、GF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、類胰島素生長因子(IGF)和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-)等；另一類為細(xì)胞特異性生長因子，如白細(xì)胞介素2(IL-2)、神經(jīng)生長因子(NGF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)等。 正常情況下，哺乳動(dòng)物體內(nèi)的大部分細(xì)胞處于非增殖狀態(tài)的G0期，此期細(xì)胞主要表達(dá)與細(xì)胞生長有關(guān)的基因，但不合成與細(xì)胞周期調(diào)控體系有關(guān)的蛋白。細(xì)胞因子作用于細(xì)胞表面的各種相應(yīng)的受體，受體多是增殖信號的跨膜傳遞者。這些受體都是糖蛋白，和生長因子結(jié) 合后產(chǎn)生變構(gòu)，激活了蛋白激酶的活性，可使細(xì)胞內(nèi)靶蛋白的酪氨酸發(fā)生磷酸化，進(jìn)一步觸發(fā)由細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的一系列信號傳遞反應(yīng)。核內(nèi)調(diào)控蛋白接受從細(xì)胞質(zhì)經(jīng)一

12、系列反應(yīng)傳來的增殖信號后，才能變構(gòu)而被激活，與基因組中特定的調(diào)控序列發(fā)生相互作用，開動(dòng)一組與細(xì)胞增殖調(diào)控有關(guān)的特定基因的轉(zhuǎn)錄，首先刺激fos、jun、myc等早期反應(yīng)基因的表達(dá)，并在這些轉(zhuǎn)錄因子的作用下，激活周期蛋白與周期蛋白依賴性激酶 的基因表達(dá)，合成與細(xì)胞周期調(diào)控體系有關(guān)的蛋白，調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)行。 下面介紹幾種主要的生長因子及受體: (一)表皮生長因子 EGF是一種含有53個(gè)氨基酸殘基的多肽。 EGF分子內(nèi)有對維持其生物活性必需的3個(gè)二硫鍵，當(dāng)用巰基乙醇或尿素還原二硫鍵后，EGF活性就會喪失。EGF主要分布于人的尿液、乳汁和血漿中。作為一種作用很強(qiáng)的促細(xì) 胞分裂因子，EGF能刺激多種組織

13、細(xì)胞在體內(nèi)和體外的分裂和增殖。EGF是通過位于細(xì)胞膜上的受體而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)的。EGF受體 (EGFR)是具有內(nèi)在的酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，EGFR的分布較廣泛，來源于內(nèi)、中、外三個(gè)胚層的細(xì)胞均有EGFR表達(dá)。EGF與EGFR結(jié)合后形成復(fù)合物，通過細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)EGF最終被溶酶體降解，EGFR在與EGF解離后被送回質(zhì)膜表面重新利用。 (二)血小板衍化生長因子 血小板衍化生長因子(plateletderived growth factor，PDGF)來源于血小板，由含二硫鍵的二聚體組成，PDGF也是一種較強(qiáng)的促有絲分裂因子。 PDGF以啟動(dòng)性生長因子的身份，刺激靜止細(xì)胞進(jìn)入對推

14、進(jìn)因子敏感的狀態(tài)，離開G0期進(jìn)入生長周期。反轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)化基因v-sis的產(chǎn)物P28V-sis蛋白質(zhì)氨基酸的順序與PDGF的鏈同源，這說明癌基因可能通過編碼生長因子參與細(xì)胞增殖調(diào)控。PDGF也是通過與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合發(fā)揮作用的。PDGF受體(PDGFR)是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，通過與PDGF結(jié)合被活化，發(fā)揮多種生理活性。(三)轉(zhuǎn)化生長因子轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，F(xiàn)GF)是一組誘導(dǎo)非瘤細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)化表型的多肽類物質(zhì)。FGF中最主要的有TGF-和TGF-兩大類。 TGF-在結(jié)構(gòu)上與EGF相關(guān)，生物學(xué)特性非常相似。TGF- 和EGF都能與E

15、GFR結(jié)合，結(jié)合后均可活化EGFR的蛋白激酶活性并誘導(dǎo)受體對信號傳導(dǎo)鏈下游的調(diào)節(jié)作用。TGF-不與EGFR結(jié)合，其受體是含二硫鍵的糖基化復(fù)合物。 TGF-的轉(zhuǎn)化活性需EGF或TGF- 的協(xié)同。 TGF-對于各種腫瘤細(xì)胞。 如上皮細(xì)胞、胚胎成纖維細(xì)胞及大鼠的原代培養(yǎng)均為一種抑制增殖作用。因此，TGF- 可能主要是參與抑制細(xì)胞增殖。對細(xì)胞生長起負(fù)調(diào)節(jié)作用。 (四)抑 素 抑素(chalone)是與生長因子作用相反的、具有組織特異性的內(nèi)源性、生理性生長抑制因子，其作用有組織或細(xì)胞特異性，而無種屬特異性。對細(xì)胞無毒性，僅使細(xì)胞增殖阻滯于細(xì)胞周期某一時(shí)相，作用消失后，細(xì)胞增殖可被逆轉(zhuǎn)。 抑素是肽類、蛋白

16、質(zhì)或與糖結(jié)合的復(fù)合體，水溶性，存在于組織細(xì)胞和血清內(nèi)。 目前確定的抑素有表皮細(xì)胞抑素、肝細(xì)胞抑素、紅細(xì)胞抑素、中性粒細(xì)胞抑素、淋巴細(xì) 胞抑素等。各種抑素的分子量和理化性質(zhì)不同，其分子水平的作用尚不清楚。目前認(rèn)為 抑素主要作用于G1S期，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期的稱為G1抑素或S因子，阻止細(xì)胞進(jìn)入M期的稱為G2抑素或M因子。二、周期蛋白與周期蛋白依賴性激酶對細(xì)胞周期的調(diào)控(一)周期蛋白與周期蛋白依賴性激酶 過去人們一直認(rèn)為細(xì)胞周期受核的控制，細(xì)胞質(zhì)的活動(dòng)是被動(dòng)的。但研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)中存在有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的因子，其活動(dòng)不完全受細(xì)胞核的控制，這種因子被稱為有絲分裂促進(jìn)因子(mitosis promoting

17、factor，MPF)。 MPF由兩種蛋白分子組成，一種是“周期蛋白”(cyclin)，另一組分是具有蛋白激酶活性的 催化亞單位，由于此激酶的活性依賴于和周期 蛋白結(jié)合，又稱為周期蛋白依賴性蛋白激酶(cyclindependent kinase，CDK)。 已發(fā)現(xiàn)的周期蛋白有10多種，如酵母細(xì)胞中的Clnl、Cln2、Cln3及哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的Cyclin A、B、C、D、E、F、H等。依據(jù)它們在細(xì)胞周期中調(diào)控階段的不同分別歸人G1期周期素和M期周期蛋白。在周期蛋白分子中都含有一段高度保守的氨基酸序列，它是與CDK互相結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)，稱“周期蛋白盒”(cyclin box)。周期蛋白周期性地合成

18、、與CDK結(jié)合、降解，起到了對細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)作用。 CDK是具有蛋白激酶活性的催化亞單位。目前已發(fā)現(xiàn)6種CDK。CDK與細(xì)胞分裂周期(cell division cycle，cdc)基因cdc2編碼產(chǎn)物p34cdc具有同源性。與周期蛋白結(jié)合的p34cdc的活性還受其他某些特異性的激酶和磷酸酶的調(diào)控。包括Cdc2(CDKl)、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5和CDK6，它們分別對細(xì)胞G1-S期和G2-M期的過渡進(jìn)行調(diào)控。 當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入G2期后，M期cyclin逐漸增加，并與CDK形成無活性MPF復(fù)合物，在其他激酶和磷酸酶的磷酸化和去磷酸化作用下，轉(zhuǎn)變?yōu)镸PF。通過MPF對這兩類酶的正反饋調(diào)節(jié)

19、作用，不斷加速M(fèi)PF的產(chǎn)生。當(dāng)MPF增加到相當(dāng)高的濃度時(shí)就引發(fā)一系列變化。 (二)細(xì)胞周期蛋白對細(xì)胞周期的調(diào)控1.G1期周期蛋白 正常情況下，哺乳動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞的G1期后期具有一個(gè)控制樣的限制點(diǎn)，稱為G1控制點(diǎn)。 人類細(xì)胞在G-期表達(dá)3種周期蛋白： Cyclin C、D和E。處于Go期的細(xì)胞受生長因子刺激后，首先表達(dá)C、D型周期蛋白，再表達(dá)E型周期蛋白，然后進(jìn)入DNA合成期。 Cyclin C的水平在G0期稍有增加，在細(xì)胞周期的其他時(shí)期內(nèi)波動(dòng)很小。 Cyclin D在不斷增殖的細(xì)胞中的水平波動(dòng)不明顯。 Cyclin D的表達(dá)對生長因子有明顯的依賴性。在G0早期，D型周期素開始表達(dá)，并與CDK4為

20、主的數(shù)種激酶結(jié)合，在細(xì)胞由Go期進(jìn)入Gl的過程中起重要作用。如果抑制Cyclin D在G0期的表達(dá)，細(xì)胞將不能進(jìn)入s期。 Cyclin E的表達(dá)時(shí)間比Cyclin D晚，在細(xì)胞內(nèi)呈周期性表達(dá)，峰值在G1-S過渡點(diǎn)，在控制細(xì)胞由G1期進(jìn)人S期起限速作用。當(dāng)人類Cyclin E在人包皮成纖維細(xì)胞中穩(wěn)定地過渡表達(dá)時(shí)，可以縮短被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的G1間期，細(xì)胞在較小的狀態(tài)通過G1-S期過渡點(diǎn)，并可減少由G1向S期過渡時(shí)血清的需要量，而Cyclin E在周期中產(chǎn)生的時(shí)間并未改變；但是，由于細(xì)胞提前進(jìn)入S期，影響了為復(fù)制DNA所需要的因子的積累，縮短的G1期的時(shí)間由延長s期和G2期得以補(bǔ)差平衡。由此可見，Cycl

21、in E的合成程度是細(xì)胞G1-S過渡的限制因素。2S期和M期的周期蛋白 (1)Cyclin A和Cyclin B。Cyclin A的合成早于Cyclin B，它的合成起始接近于Gl-S期過渡點(diǎn)，并在間期就進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。破壞Cyclin A的功能將抑制染色體的復(fù)制。CyclinB的合成起始于S期，在G2-M期過渡中逐漸增加，直至有絲分裂中期和后期之間發(fā)生驟然降解。而且，Cyclin B在核膜破裂前才進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。Cyclin A和Cyclin B分別與CDK2和CDKl相結(jié)合，使細(xì)胞從G2期進(jìn)入M期。 (2)Cyclin H。Cyclin H與一種與CDK相關(guān)的激酶M01 5相結(jié)合，M015-C

22、yclin H復(fù)合物能增強(qiáng)CDK2-Cyclin A的激酶活性。因此，與其他已知的CDKCyclin復(fù)合物不同，MOl5一Cyclin H復(fù)合物不是細(xì)胞周期次級反應(yīng)中的有關(guān)成分，而是中心調(diào)控體系本身，提示細(xì)胞周期中心調(diào)控機(jī)制中存在CyclinCDK的級聯(lián)反應(yīng)。 第三節(jié) 細(xì)胞增殖與腫瘤 人類腫瘤的發(fā)生與癌基因激活和抑癌基因失活有關(guān)。目前發(fā)現(xiàn)，癌基因和抑癌基因作用的歸結(jié)點(diǎn)在于對細(xì)胞周期的調(diào)控。 腫瘤細(xì)胞周期的調(diào)控多表現(xiàn)為起正調(diào)控作用的Cyclin過度表達(dá)，而發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用的抑制因子CKI卻常常失活。如在多數(shù)惡性腫瘤中都有Cyclin D 的過度表達(dá)或/和P21、P27低表達(dá)。細(xì)胞周期的監(jiān)測點(diǎn)異常也

23、可能導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂而癌變。特別是約半數(shù)以上惡性腫瘤中有分子警察P53的突變。 第四節(jié) 細(xì)胞增殖常用的檢查方法 1.細(xì)胞核分裂計(jì)數(shù)核分裂象是細(xì)胞周期中惟一可以用形態(tài)學(xué)方法識別的時(shí)期，在普通光學(xué)顯微鏡下即能夠進(jìn)行。Baak提出核分裂的識別標(biāo)準(zhǔn)的為：核膜消失；在核分裂中央缺乏透明區(qū)；核分裂象兩側(cè)或外周可見毛發(fā)樣突起；胞漿嗜堿性。核分裂計(jì)數(shù)有高倍視野法(high power fields，HPF)和核分裂指數(shù)法(mitotic index，MI)。 高倍視野法 在高倍(400)下，隨機(jī)選擇多個(gè)視野(10)，分別觀察并計(jì)數(shù)其中的核分裂象，然后計(jì)算出每個(gè)HPF中核分裂象的平均值。由于不同型號的顯微鏡HP

24、F的面積太小可能存在一定差異，且所測細(xì)胞的大小不同，單位面積內(nèi)的細(xì)胞數(shù)亦不相同，該方法存在結(jié)果可比性和重復(fù)性較差的問題。核分裂指數(shù)法:在目鏡上加一單線狀標(biāo)尺，計(jì)數(shù)高倍(400)視野下與標(biāo)尺相交的細(xì)胞數(shù)(n)，該視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)A=(n2)2。計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野，其中第1、5、10視野按上述公式計(jì)算，3個(gè)視野細(xì)胞數(shù)之和除以3，乘以10，則為10個(gè)視野的細(xì)胞總數(shù)。以10個(gè)高倍視野的核分裂象數(shù)除以細(xì)胞總數(shù)，求得MI值。 在不同腫瘤中，核分裂數(shù)多少的意義是不一樣的。如：胃腸道平滑肌腫瘤：5/10HPF；良性或潛在惡性5/10HPF：惡性子宮平滑肌腫瘤：10/10HPF+異型性+腫瘤性壞死：惡性10/10

25、HPF、無異型性、無壞死：潛在惡性胃腸道間質(zhì)瘤：5/50HPF+腫瘤5cm：惡性2.DNA合成情況的檢測直接反映處于S期細(xì)胞的多少?？赏ㄟ^測定標(biāo)記的DNA前體物質(zhì)，如3H-去氧胸腺嘧啶核苷，或核苷酸類似物質(zhì)5-溴-2脫氧尿苷（Bromodeoxyoridine,BrdU),應(yīng)用放射自顯影、免疫組化或閃爍測定儀、流式細(xì)胞儀定性或定量測定標(biāo)記的細(xì)胞術(shù)。3H標(biāo)記胸腺嘧啶脫氧核苷摻人標(biāo)記技術(shù) 3H標(biāo)記胸腺嘧啶脫氧核苷摻人標(biāo)記技術(shù)(thymidine labeling, 3H -TdR)由Johnson等于1961年首次建立，是顯示s期細(xì)胞的經(jīng)典方法。用活細(xì)胞或新鮮組織與3H標(biāo)記胸腺嘧啶脫氧核苷孵育12

26、h，有DNA合成能力的s期細(xì)胞將攝人3HTdR合成新的DNA，通過放射自顯影顯示，可在顯微鏡下直接辨認(rèn)s期細(xì)胞，計(jì)數(shù)全部細(xì)胞中s期細(xì)胞的百分率作為胸腺嘧啶脫氧核苷標(biāo)記指數(shù)(thymidine labeling index，TLI)表示增殖活性。操作步驟 a.剪碎的無菌新鮮組織或體外培養(yǎng)細(xì)胞加入培養(yǎng)基和3H標(biāo)記胸腺嘧啶脫氧核苷，在37的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h； b集組織和細(xì)胞，PBS清洗后，10福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋切片； c.室內(nèi)將脫蠟水化后的切片浸人感光乳膠，然后在4的暗盒內(nèi)曝光3天； d.在暗室內(nèi)放射自顯影的切片在顯影液中顯影，然后在定影液中定影； e.切片經(jīng)蘇木素伊紅染色； f.計(jì)數(shù)

27、20005000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞的百分率，求得TLI。應(yīng)用: 3H -TdR標(biāo)記技術(shù)自建立以來，已得到廣泛應(yīng)用。Iinden研究證實(shí)高TLI與乳腺癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)、病理分型及臨床亞型有關(guān)，與其他預(yù)后指標(biāo)相比，TLI是最有價(jià)值的。存在的問題: TLI只顯示s期細(xì)胞數(shù)量，而未顯示s期長短，因而可能出現(xiàn)細(xì)胞增殖速度慢而TLI增高的情況 由于腫瘤生長的異質(zhì)性，對腫瘤組織取材的代表性不夠亦會造成結(jié)果偏差；觀察者的經(jīng)驗(yàn)、計(jì)數(shù)細(xì)胞的多少、組織的新鮮程度以及放射性同位素的活性均可影響結(jié)果的可靠性；需要新鮮組織及放射性同位素是TLI應(yīng)用受限的主要原因。溴脫氧尿嘧啶核苷標(biāo)記技術(shù)溴脫氧尿嘧啶核苷標(biāo)記技術(shù)(5-br

28、omodeoyuridine，Brdu)由于3H -TdR標(biāo)記技術(shù)需要同位素，推廣受限。5一溴脫氧尿嘧啶核苷(5一bromodeoyuridine，Brdu)是胸腺嘧啶核苷的相似物，像胸腺嘧啶脫氧核苷一樣可摻人到細(xì)胞合成的DNA中，摻人到細(xì)胞DNA的Brdu可通過抗5一Brdu單克隆抗體在組織切片和細(xì)胞爬片上顯示或通過FCM檢測s期細(xì)胞。操作步驟 a.剪成0 .5mm3大小的無菌新鮮組織或體外培養(yǎng)細(xì)胞加入含Brdu的培養(yǎng)基，在37的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h； 2.集組織和細(xì)胞，用PBS清洗后，70乙醇固定，常規(guī)石蠟包埋切片； c.切片脫蠟水化，3H202阻斷內(nèi)源性過氧化物酶20min，蒸餾水洗；

29、 d.0. 1N NaCl于4處理5min，再用90的甲酰胺水溶液58孵育30min，以變性DNA； e. 4預(yù)冷的PBS清洗2min，以停止DNA變性； f.利用抗Brdu抗體，按免疫組織化學(xué)方法染色； g.蘇木素襯染； h.計(jì)數(shù)20005000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞的百分率，求得標(biāo)記指數(shù)LI。應(yīng)用 1982年，Gratzner等首先利用抗5-Brdu和抗5一碘脫氧尿啼啶核苷單克隆抗體顯示DNA復(fù)制，與用3H -TdR標(biāo)記法所獲結(jié)果一致。隨后該方法得到廣泛應(yīng)用，獲得滿意結(jié)果，認(rèn)為此法能對細(xì)胞周期進(jìn)行迅速而穩(wěn)定的測量。 存在的問題 Brdu標(biāo)記技術(shù)雖然不用放射性同位素，但仍需要新鮮組織；組織或細(xì)

30、胞的離體時(shí)間、Brdu濃度是影響結(jié)果的重要參數(shù)。離體時(shí)間超過15min將嚴(yán)重影響結(jié)果的可靠性。3.細(xì)胞核仁組成區(qū)嗜銀相關(guān)蛋白（AgNOR)概述：核仁組成區(qū)（Nucleolus organizer region,NORs)位于核仁rDNA袢，由rDNA、rRNA組蛋白、非組蛋白等組成。參與蛋白質(zhì)、核糖體合成及核仁組成。NORs的酸性非組蛋白又稱為核仁組成區(qū)相關(guān)蛋白，能與Ag結(jié)合并被還原為氧化銀沉淀，故稱為核仁組成區(qū)嗜銀相關(guān)蛋白（AgNOR)。常用明膠液和硝酸銀等作為染色劑?？捎迷谑炃衅蚣?xì)胞涂片中，應(yīng)用廣泛。是常用的檢測細(xì)胞增殖活性方法。細(xì)胞核內(nèi)AgNOR數(shù)目反映：核仁內(nèi)rDNA的轉(zhuǎn)錄活性水平

31、；在染色體組中NOR染色體的數(shù)目，及細(xì)胞分裂周期中所處的階段。組織切片中AgNOR平均計(jì)數(shù)增加的原因：（1）細(xì)胞增殖活躍，以致細(xì)胞核內(nèi)核仁分解， AgNOR分散于細(xì)胞核中（2）核仁融合缺陷，使AgNOR分散（3）細(xì)胞的染色體倍體數(shù)增加（4） rDNA轉(zhuǎn)錄活性增加染色方法 NORs的染色方法很多，有銀染一步法、火棉薄膜覆蓋法、PEG法、雙重染色法和鉍染法等，應(yīng)用最廣的還是銀染一步法。HoweU銀染一步法 1切片的制備 手術(shù)切除的腫瘤標(biāo)本，lO甲醛溶液(福爾馬林)固定，常規(guī)石蠟包埋，作連續(xù)4gm切片。 2膠質(zhì)銀工作液配制 將明膠溶于1甲酸液使其成為2溶液(即2克明膠溶于100ml 1甲酸液中)，將

32、此液按1：2容積比與50硝酸銀混合即成。 3染色 (1)切片常規(guī)脫蠟至去離子水水化。 (2)暗室內(nèi)，室溫(2025 C)下滴加膠質(zhì)銀工作液覆蓋切片表面，一般以2760分鐘為宜。 (3)流水充分沖洗切片 (4)對比染色(中性紅蘇木素或甲基綠等)。 (5)常規(guī)脫水透明封片 4結(jié)果切片背景為淺黃色，AgNOR顆粒為深棕色。固定劑的選擇 由于AgNOR技術(shù)在組織病理學(xué)上的應(yīng)用日益廣泛，Smith等(1988)及時(shí)研究了一系列固定劑對AgNOR的影響。他們發(fā)現(xiàn)乙醇類固定劑效果最佳，10甲醛溶液固定劑效果是滿意的，10中性甲醛溶液的效果接近于乙醇類固定劑。一般說來，可選用的固定液為：乙醇、丙酮、10甲醛溶

33、液、10中性甲醛溶液，Carnoys固定液、Clarks固定液。不應(yīng)選用的固定液為：升汞甲醛溶液、HellyS固定液、Zenkers固定液、戊二醛苦味酸固定液。AgNOR的形態(tài)分型:1. 單一型 為境界清楚邊緣光滑的圓形顆粒,顆粒周圍常有一空暈.顆粒位于核中央或偏位,此型在良性病變中多見2彌散型 在核漿內(nèi)散在分布、大小不一的顆粒。數(shù)目一般可多達(dá)1020個(gè)，甚至更多。顆粒形態(tài)可為圓點(diǎn)狀、條塊狀或不規(guī)則形，有時(shí)亦可見相互重疊的現(xiàn)象。此型在惡性腫瘤中多見。3聚集型 耷核漿內(nèi)散在分布大小不一的顆粒，顆粒常聚集成團(tuán)塊狀、條索狀或不規(guī)則形，無法明確計(jì)數(shù)。4核仁內(nèi)型 胞核內(nèi)有一個(gè)或數(shù)個(gè)核仁，核仁大小不一，大者直徑可達(dá)256扯m，核仁周邊常有空暈。每個(gè)核仁內(nèi)有境界清晰或不清晰的顆粒，數(shù)量不等。 5混合型 上述各型均可相互混合，混合所占的比例大致相同。 計(jì)數(shù)方法:為了便于與修改后的標(biāo)準(zhǔn)化方案比較，1993年的“上海方案”的計(jì)數(shù)原則如下： ， 1每例涂片至少計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞，切片至少計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。計(jì)數(shù)細(xì)胞內(nèi)每一個(gè)可辨別的顆粒。 2直徑25m的團(tuán)塊或顆粒按5個(gè)顆粒計(jì)算。 3最后按單位細(xì)胞核內(nèi)的AgNOR數(shù)計(jì)算。 4除計(jì)數(shù)外，尚須注明形態(tài)分型。 AgNOR顆粒形態(tài)的