藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀

1、第四章 藥物定量分析與分析方法驗證藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀第一節(jié) 定量分析樣品的前處理方法一、概述 有機金屬藥物：金屬原子直接與碳原子以共價鍵相連，結合比較牢固，如醋酸苯汞、汞撒利含金屬的有機藥物：金屬原子不與碳原子直接相連，通常為有機酸及酚的金屬鹽或配位化合物 。例：酒石酸銻鉀、葡萄糖酸銻鈉藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀處理方法主要分為兩大類: 不經有機破壞的處理 經有機破壞的處理藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀二、不經有機破壞的分析方法(一)直接測定法 金屬原子不直接與碳原子相連的含金屬有機藥物某些CM鍵結合不牢固的有機金屬藥物 例：富馬酸亞鐵的含量測定。藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀

2、(二)經水解后測定法1、堿水解后測定法 適用范圍：含鹵素有機藥物結構中鹵素原子結合不牢固的藥物，如鹵素和脂肪碳鏈相連。加NaOH，加熱回流含有機結合的鹵素間接銀量法測定有機藥物方法原理：藥物水解無機的鹵素離子藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀例：三氯叔丁醇的含量測定 藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀2、水解后測定法例：硬脂酸鎂的含量測定Mg(C17 H35COO)2 + H2SO4 定量、過量2NaOH + H2SO4Na2SO4 + 2H2O MgSO4 + 2 C17 H35COOH過量剩余藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀(三)經氧化還原后測定法 例：泛影酸、膽影酸等的含量測定1、酸性或堿性還原后

3、測定鹵素結合在芳環(huán)上藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀例：含銻藥物具有氧化性2、利用藥物中可游離的金屬離子的氧化性測定含量 利用藥物中可游離出的金屬離子的氧化性，在酸性溶液中氧化碘化鉀，析出碘，再用硫代硫酸鈉滴定析出的碘，以測定含量。藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀三、經有機破壞的分析方法 適用于金屬原子與碳原子結合牢固的有機金屬藥物，使有機結合狀態(tài)的金屬及鹵素轉變?yōu)榭蓽y定的無機化合物，再選用適當的方法測定。藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀（一）濕法破壞（1） 硝酸-高氯酸法 適用于血、尿、組織等生物樣品的破壞，有機金屬藥物經破壞后，得到的無機金屬離子一般呈高價態(tài)。 本法不能用于含氮雜環(huán)藥物的破壞干法

4、灼燒法藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀（2） 硝酸-硫酸法 適用于大多數有機物質的破壞，破壞得到的無機金屬離子均為高價態(tài)。 不能用于含堿土金屬有機藥物的破壞藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀（3） 硫酸-硫酸鹽法 加入濃硫酸作為氧化劑 加入硫酸鹽提高硫酸的沸點，增強硫酸的氧化破壞能力，且防止硫酸的分解損失。 用于含砷或銻有機藥物的破壞，破壞得到的無機金屬離子多為低價態(tài)藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀注意點： 破壞操作要放在通風櫥中進行 試劑不含有被測金屬離子或干擾測定的組分 做空白試驗 破壞在凱氏燃燒瓶（硅或硼玻璃）中進行藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀 (二)干法破壞1、高溫熾灼法目的： 將有機物灼燒

5、灰化以達分解的目的適用范圍：濕法不易破壞完全的有機藥物，以及某些不能用硫酸進行破壞的有機藥物 限制：對于含易揮發(fā)性金屬（如汞、砷等）有機藥物不適用 注意事項：（1）加熱或灼燒時，應控制溫度在420以下（2）一定要灰化完全（3）經本法破壞后，所得灰分往往不易溶解，但不要輕易棄去藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀2、氧瓶燃燒法： 氧瓶燃燒法：將有機藥物放在充滿氧氣的密閉的燃燒瓶中進行燃燒，有機結構部分分解為CO2和H2O，用適當的吸收液吸收燃燒所產生待測物質（已轉化為不同價態(tài)的氧化物）, 然后根據待測物質的性質, 然后采用相應的方法進行鑒別、檢查或測定.藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀特點： 適用于含鹵

6、素、硫、氮、硒等有機藥物的分析 簡便、快速、破壞完全，尤其適用于微量樣品的分析藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀 （1）儀器裝置 燃燒瓶 一般為不同體積的磨口、硬質玻璃錐形瓶，瓶塞嚴密、空心、底部熔封一根直徑為lmm鉑絲，鉑絲下端是網狀或螺旋狀，長度約為瓶身長度的2/3藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀 樣品制備：稱樣用材料及稱樣方法 無灰濾紙：用于固體樣品 紙袋：適用于液體樣品藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀 吸收液A.作用：將樣品經燃燒分解所產生的各種價態(tài)的鹵素、硫、氮、硒等，定量地吸收并轉變?yōu)楸阌跍y定的價態(tài)藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀B.吸收液的選擇待測元素燃燒產物吸收液氟氟化氫水氯氯化氫水Na

7、OH溶液溴單質溴、溴化氫水NaOHSO2飽和溶液碘單質碘、 少量I5+、I3+、I-1硝酸銀法：I-1，水NaOHSO2飽和溶液間接碘量法：水NaOH溶液硫三氧化硫濃H2O2水液硒SeO2(少量SeO3)硝酸溶液藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀、操作方法A、固定已稱好樣品的無灰濾紙或紙袋B、燃燒瓶中加入規(guī)定量及種類的吸收液C、用水把瓶口濕潤，小心急速通入氧氣，立即用表面皿蓋好藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀D、點燃濾紙或紙袋尾部，迅速放入裝有吸收液的燃燒瓶中，擰緊瓶蓋，用少量水封口E、待燃燒完全、無黑色碎片后，充分混合，使生成的煙霧被完全吸收后，放置15分鐘，再用少量水沖洗瓶塞和鉑絲，合并洗液和吸

8、收液。 用同樣的方法作空白試驗藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀（2）注意事項按規(guī)定方法操作 根據供試品的取用量選擇不同的燃燒瓶 待分解樣品量 燃燒瓶的體積 35mg（微量分析） 150 250ml 20 30mg（半微量分析） 300 500ml 50 60mg 1000ml 0.6 0.7g或更多 2000ml或特殊結構的燃燒瓶藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀正確選用燃燒瓶的目的在于： 樣品能在足夠的氧氣中燃燒分解完全 有利于將燃燒分解產物較快地吸收到吸收液中 防止爆炸的可能性藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀燃燒瓶要潔凈，不能殘留有機溶劑，不能用有機潤滑劑涂抹瓶塞要有防爆措施氧氣要充足，確保燃燒完

9、全，產物不能有黑色炭化物燃燒產生的煙霧要被完全吸收 充分振搖和放置都是為了保證吸收完全例：碘產生紫色煙霧；氯、氟產生白色煙霧，煙霧顏色完全消失后，即表示吸收完全測定含氟有機化合物時要用石英燃燒瓶藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀4、應用 含鹵素、硫、磷、氟及硒等有機藥物的鑒別、雜質的檢查及含量測定例 碘苯酯的含量測定 ChP（2005）原理 碘苯酯為有機碘化物，用氧瓶燃燒分解，轉變?yōu)榈饣?，繼而氧化為游離的碘，并被定量地吸收于吸收液（氫氧化鈉），生成碘化物與碘酸鹽，加入溴-醋酸溶液，使全部轉變?yōu)榈馑猁}，過量的溴以甲酸及通空氣去除。加入碘化鉀，使與碘酸鹽反應析出游離碘，用硫代硫酸鈉液滴定，碘與淀粉結

10、合所顯的藍色消失即為終點藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀碘苯酯（有機碘化物）氧瓶燃燒碘化物氧化碘化物與碘酸鹽游離碘紫色煙霧氫氧化鈉吸收液加溴-醋酸液碘酸鹽過量，以甲酸及通空氣除去碘化鉀游離碘硫代硫酸鈉淀粉 終點藍色消失溶液中要標定藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀例： 氧瓶燃燒法中的裝置有：磨口硬質玻璃錐形瓶 B. 磨口軟質玻璃錐形瓶C. 鉑絲D. 鐵絲E. 鋁絲藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀例：選擇氧瓶燃燒法所必備的實驗物品磨口硬質玻璃錐形瓶 B. 鉑絲C. 普通濾紙D. 氫氣 E. 無灰濾紙藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀第二節(jié) 定量分析方法的特點一、容量分析法（一）特點原理： aA + xX c

11、C + dD 標準溶液被測物質藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀容量分析的化學反應必須滿足的條件：（1）反應要有一定的化學計量關系，并且要能定量地完成（2）反應速度要快，即反應在瞬間完成（3）必須要有合適的確定滴定終點的方法 滴定分析法:酸堿滴定法;沉淀滴定法 配位滴定法;氧化還原法； 非水溶液滴定法等藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀（二）計算1、滴定度的定義 滴定度：指每1 ml規(guī)定濃度的滴定液相當于被測物質的量，以 T 表示，中國藥典以mg表示 例：每1ml的滴定液（0.5mol/l）相當于72.06mg苯甲酸鈉藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀2、滴定度（T）的計算aA + bB cC + dD

12、待測物滴定液式中：m滴定液的摩爾濃度，mol/l M-待測物的毫摩爾質量（分子量） a、b分別為被測物、滴定液的摩爾數定義藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀3、 含量計算（1）直接滴定法實際滴定度（或校正滴定度）T的計算 T=T*F 其中每1 ml標準溶液相當于被測物質的量藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀(2)間接滴定法1）生成物滴定法 計量滴定液消耗的量，計算供試品的含量 計算同直接滴定法 藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀 2）回滴定法（剩余滴定法） 原理：先在待測樣品溶液中加定量、過量的滴定液A，使它和樣品反應，等反應結束后，再用另一種滴定液B來回滴剩余的滴定液A。不

13、做空白的含量計算 特點：A、B兩種滴定液均需標定藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀做空白的含量計算方法 特點：僅需標定滴定液B的濃度藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀例1：酸堿滴定法測定煙酸片含量。取本品（規(guī)格：0.1g/片）10片，精密稱定為1.584 0g，研細，精密稱取片粉0.332 9g,（約相當于煙酸0.2g），加新沸過的冷蒸餾水50mL，置水浴上加熱，并時時振搖，使煙酸溶解后，冷卻至室溫，加酚酞指示劑3滴，用氫氧化鈉滴定液（0.100 5 mol/L)滴定，消耗16.90mL。 1mL氫氧化鈉滴定液（ 0.1mol/L）相當于12.31mgC6H5NO2。問：本品是否符合中國藥典規(guī)定的含量

14、限度（中國藥典規(guī)定，本品含C6H5NO2應為標示量的95.0%105.0%)藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀二、光譜分析法紫外可見分光光度法1、比耳朗伯定律（BeerLambert定律）A=E*C*L Beer定律說明吸收和濃度的關系 Lambert定律說明吸收和厚度的關系吸收系數：一定波長下，溶液濃度為1mol/l，液層厚度為1cm時，物質的吸收度-定性依據 104，物質有強吸收 102104 ，物質具有中等強度吸收 100，物質有弱吸收藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀 ：一定波長下，溶液濃度為1%（W/V），液層厚度為1cm時，物質的吸收度- -定量依據 兩者間的關系： 或 藥物定量分析與分析

15、方法驗證優(yōu)秀2、對溶劑的要求 溶劑的截止波長：使用范圍不能小于截止使用波長 溶劑的純度：檢查所用溶劑在檢測波長處是否符合要求藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀3、含量測定 測定要求:空白對照：配制供試品溶液的同批溶劑吸收池：1cm石英吸收池吸收波長：該品種項下規(guī)定波長2nm之內吸收值:0.30.7 (0.20.8)藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀（1）對照品比較法供試品的濃度為：原料藥：藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀（2）吸收系數法 按規(guī)定方法配制供試品，在規(guī)定的波長及吸收厚度下，測定吸收度，計算再按在相同條件下，標準對照品測到的 計算含量：注意：此法對儀器要求高，必須

16、注意校正和檢定 吸收系數 100藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀（3）計算分光光度法 一般不宜用作含量 測定（當測定波長處于吸收曲線陡升或陡降部位時，對測定影響大）（4）比色法 供試品本身無吸收或有吸收但干擾大，可加入適當的顯色劑后測定。 此法影響因素較多，實驗平行操作藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀例：對照品比較法測定卡馬西平含量。精密稱取本品0.050 3g,置100mL量瓶中，加乙醇溶解并稀釋到刻度，搖勻，精密量取2mL，置100mL量瓶中，加乙醇稀釋到刻度，搖勻，作為供試品溶液；另精密稱取卡馬西平對照品適量，用乙醇制成1mL中含10.3g的溶液，作為對照品溶液。取上述兩種溶液，用1cm吸收

17、池在285 nm波長處測定，測得供試品溶液吸光度為0.435，對照品溶液A值為0.440。問本品是否符合中國藥典規(guī)定的含量限度（中國藥典規(guī)定，本品按干燥品計算，含C15H12N2O應為標示量的97.0%103.0%)藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀三、色譜分析法（一）高效液相色譜法1、對儀器的一般要求 固定相種類 流動相組成： 注意：使用C18時，流動相中含有的有機溶劑比例應不低于5 檢測器 藥典中規(guī)定的固定相種類、流動相組成及檢測器類型不能隨意改變 藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀2、系統(tǒng)適用性試驗 試驗指標：理論塔板數、分離度、 重復性、拖尾因子（1）色譜柱的理論塔板數(n)（2）分離度(R)

18、 注意：峰寬的概念（3）重復性： 5次連續(xù)進樣，RSD應不大于2.0藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀（4）拖尾因子（T）用峰高法定量：0.951.05用峰面積法定量：藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀3、測定法（大多數采用峰面積法）（1）內標法加校正因子測定供試品中主成分含量按各品種項下的規(guī)定，精密稱?。ɑ蛄咳。┧幬飳φ掌泛蛢葮宋镔|，分別配成溶液，精密量取中在所配溶液，配制成測定校正因子用的藥品對照品（含內標）進樣，記錄譜圖，得峰高（H）或峰面積（A）R表示藥物對照品 S表示內標物藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀配制含有內標的供試品溶液，進樣，記錄譜圖，得峰面積（或峰高） 特點：如果在配制測定校正因子

19、和供試品溶液時用同一份內標物溶液，內標物質不必精密稱定或量取。 內標物不易尋找藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀2、外標法測定供試品中主成分含量兩種方法：標準曲線法和單點外標法（1）標準曲線法 藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀注意兩點： 理論上講標準曲線應該過原點，但由于存在系統(tǒng)誤差，會偏離原點，即A=a CX +b 如果供試品為片劑，則含量應該為標示量的百分含量，計算方法為 藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀（2）單點外標法： 藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀 特點：簡單，但要求進樣量準確，操作條件穩(wěn)定藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀(二)氣相色譜法1、對儀器的一般要求 色譜

20、柱種類：毛細管柱或填充柱 載氣：氮氣 檢測器：氫火焰離子化檢測器，檢測溫度一般高于柱溫，不得低于150度 藥典中規(guī)定的固定液品種、檢測器類型及特殊指定的色譜柱材料不能隨意改變藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀2、色譜系統(tǒng)適用性試驗：3、測定方法（1）內標法加校正因子測定供試品中主成分含量（2）外標法測定供試品中主成分含量（3）標準加入法測定供試品中主成分含量藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀 精密稱取待測成分對照品適量，配成對照品溶液，精密量取一定量加入到供試品溶液中，根據外標法或內標法測定含量。注意： 采用手工方式進樣，建議使用內標法定量 采用自動進樣，可用內標法或外標法 采用頂空進樣，用標準加入法

21、定量，可消除基質效應的影響藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀例：HPLC外標法測定阿司匹林泡騰片含量。測定方法：取本品（規(guī)格：0.1g）10片，精密稱定為1.576 0g ,研細，精密稱取0.041 2g(約相當于阿司匹林25mg)，置100mL具塞錐形瓶中，精密加乙腈甲醇甲酸（40 : 59 : 1）溶液50mL，強力振搖10min使阿司匹林溶解，迅速濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，精密量取10L注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取阿司匹林對照品適量，精密稱定，加乙腈甲醇甲酸（40:59 : 1）溶液溶解制成1mL中含有0.52mg的溶液，作為對照品溶液，同法測定。測得供試品溶液峰面積Ax為154 7

22、56（三次測定均值），對照品溶液峰面積Ar為155 076 （三次測定均值），按外標法以峰面積計算本品含量。問本品是否符合中國藥典規(guī)定的含量限度（中國藥典規(guī)定，本品含阿司匹林C9H8O4應為標示量的90.0%110.0%)藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀第三節(jié) 藥品質量標準分析方法驗證目的：證明所采用的分析方法適合于相應的檢測要求，方法驗證過程和結果均應記載在藥品標準起草和修訂說明中用途： 藥品質量標準起草時，分析方法需經驗證 藥物合成方法變更、制劑的組分變更、原分析方法進行修訂時，分析方法需經驗證藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀需驗證的分析項目1. 鑒別試驗2. 雜質定量或限度檢查3. 原料或制

23、劑中有效成分含量測定4. 制劑中其它成分（降解產物、防腐劑等）的測定5. 溶出度、釋放度等功能檢查中的溶出量等的測試方法藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀藥品質量標準分析方法驗證內容有： 準確度、精密度（重復性、中間精密度和重現(xiàn)性）、專屬性、檢測限、定量限、線性、范圍和耐用性藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀一、準確度 定義：表示分析結果與真實值接近的程度。準確度一般以百分回收率表示。1.含量測定方法的準確度 （1）原料藥的含量測定 藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀（2）制劑的含量測定藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀2、雜質定量測定的準確度 可向原料藥或制劑中加入已知量雜質進行測定 3、數據要求 在規(guī)定范

24、圍內，至少用9次測定結果進行評價 例如制備3個不同濃度的樣品，各測定3次藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀要求：（1）加入的對照品濃度應為高、中、低三個濃度，每個濃度測定三次，（2）UV和HPLC法： 98%-102%（3）容量分析法： 99.7%-100.3%藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀二、精密度 精密度是指在規(guī)定的條件下，同一個均勻樣品，經過多次取樣測定所得結果之間的接近程度。（一）精密度的表示方法 可用偏差、標準偏差或相對標準偏差 (變異系數) 表示藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀1.偏差 測量值與平均值的差稱為偏差，用D表示。偏差越大，精密度越低。 根據分析所用的方法不同，允許的相對偏差不同藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀2.標準偏差 標準偏差是偏差平方的統(tǒng)計平均值，又稱為均方根偏差。當測定次數n為有限次時，標準偏差（s）藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀3.相對標準偏差（RSD） *容量分析 法：0.2%（n=5）*UV法：1%（n=35）*HPLC法：2%（n=35）變異系數,通常用百分數表示 藥物定量分析與分析方法驗證優(yōu)秀（二）重復性、中間精密度和重現(xiàn)性1.重復性 在規(guī)定的范圍內，至少用9次測定結果進行評價（三個不同濃度的樣品，各測定3次）2.中間精密度3.重現(xiàn)性4.準確度和精密度的關系例：4個人對同一個樣品進行測定，每人測6次 藥物定量分析與分析方