生物工程下游技術第8章非線性色譜原理

1、生物工程下游技術第8章非線性色譜原理1、制備型液相色譜 preparative liquid chromatography 獲得高純物質(zhì)（色譜純）的有效方法。 半制備柱（內(nèi)徑8mm，長度15 30cm），一次制備量.1mg；7/15/20222.制備HPLC概述主要結(jié)構(gòu)單元輸液部:輸液泵 shimadzu LC-6AD(適用于分析-半制備,再循環(huán)半制備)分離部:制備柱內(nèi)徑2050mm，柱長50cm。檢測部:檢測器 shimadzu SPD-M10Avp餾分部:餾分收集器 shimadzu FRC-10A色譜柱的柱容量（柱負荷） 對分析柱：不影響柱效時的最大進樣量； 對制備柱：不影響收集物純度時

2、的最大 進樣量； 超載：進樣量超過柱容量。柱效迅速下降，峰變寬。 超載可提高制備效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%為宜。制備HPLC概述柱容量制備HPLC概述制備HPLC與 分析HPL比較目的 填料流量流通池 聯(lián)系 制備HPLC樣品中特定成分的高純度獲取，大量、廉價的制備 20以上為佳 0.1-150ml/min 最大允許流速可為150mL/min在進行制備HPLC之前，常先進行分析HPLC實驗，對分析方法進行優(yōu)化、放大應用到制備HPLC中。 分析HPLC 定性分析：檢測的靈敏度定量分析：分離度、再現(xiàn)性 3-5 0.001-9.999ml/min一般的分析池的最大允許流速僅為5 mL/

3、min，或者10mL/min3. 制備型液相色譜儀 制備型液相色譜：結(jié)構(gòu)與分析型一樣，但泵流量大、進樣量大、采用制備柱；柱后餾分收集器。 制備柱：內(nèi)徑2050mm，柱長50cm。7/15/2022基本概念Cs=KCm線性色譜:流動相中的樣品濃度(Cm)與固定相中的樣品濃度(Cs)呈線性關系.非線性色譜:Cm與Cs不存在線性關系的色譜.分析色譜大多屬于線性色譜;制備色譜大多屬于非線性色譜固定相流定相對應塔板界面VsCsVmCm非線性色譜的特點樣品的保留值可變:非線性色譜的保留值隨樣品及其濃度的不同而變化;峰形的不對稱性:不是高斯正態(tài)分布;色譜峰的峰高與濃度不是線性關系:峰高增加的速率隨濃度的增加

4、而下降.非線性色譜理論基礎研究對象：樣品在固定相和流動相中的濃度處于非線性關系下，各種實驗參數(shù)對色譜分離過程的影響，建立起柱參數(shù)、溶質(zhì)性質(zhì)及操作條件之間的定量關系。首先要了解Cs與Cm之間的函數(shù)關系，也即要研究吸附等溫線及相應的吸附模型吸附等溫線：一定溫度下物質(zhì)分子在兩相界面上進行的吸附過程達到平衡時它們在兩相中濃度之間的關系。分類：凸形、凹形、S形、H形、階梯形凹形凸形Cm線形CsSigtR峰形tRm圖8. 分布等溫線類型及對色譜峰形和保留時間的影響 通常出現(xiàn)于大多數(shù)小分子化合物它反映了溶質(zhì)分子在固體表面達到飽和時生成了單分子吸附層，隨著溶質(zhì)濃度的增加，吸附等溫線的曲率逐漸減小，最后為零即達

5、到飽和態(tài)?！巴衔病盚型等溫線是凸形等溫線的特殊狀態(tài)，它代表了一類很容易在固體表面吸附的物質(zhì)，而且很容易達到飽和，這類吸附主要是一些分子量大的聚合物，如聚乙烯、聚苯乙烯凹形吸附等溫線是適用于在低濃度下已吸附的被吸附分子又能吸附在液相中的分子，從而生成多分子吸附層的那些物質(zhì)，所以這種吸附等溫線的曲率隨濃度的增加而增加。S形等溫線實際上是凸形與凹形兩種等溫線疊加的產(chǎn)物，它代表了被吸附的分子之間具有很強的作用力，能進一步吸附其他分子，而溶質(zhì)分子與固相表面的作用力相對較弱，或者與表面覆蓋率無關。？問題：各種類型等溫線代表的溶質(zhì)在兩相間具哪些分配特性？問題：從吸附等溫線能提供哪些非線性色譜性質(zhì)的信息？吸附

6、等溫線可以提供以下信息：預測代表該吸附等溫線的組分在非線性色譜中色譜峰的形狀；為非線性色譜分離與純化物質(zhì)選擇最佳條件；反映被分離物質(zhì)分子與固定相表面的作用，從而研究分子的構(gòu)型及吸附狀態(tài)。建立分子結(jié)構(gòu)-吸附之間的定量關系，從而由分子結(jié)構(gòu)預測吸附性能。吸附等溫線的測定A、靜態(tài)測量法q與C之間的關系（q：溶質(zhì)在吸附劑上的濃度；C：溶液濃度）：q=C.V/G（V為溶液體積，G為吸附劑量）優(yōu)點：方便簡單，不需要特殊的儀器缺點：測量緩慢，平衡時間長，平衡點不容易判斷，數(shù)據(jù)不易測準，對比較昂貴的生物樣品不合適。B、動態(tài)法常用的有4種方法:前沿分析法(FA)特征點前沿分析(FACP)特征點洗脫(ECP)平臺洗

7、脫(EP)非線性色譜基本理論（P146147）吸附平衡熱力學；吸附平衡動力學;色譜基本物料平衡方程。色譜基本物料平衡方程可以解釋為何不同的吸附等溫線會產(chǎn)生不同形狀的非線性色譜峰非線性色譜固定相非線性色譜中粗和細的顆粒都在使用，原則上細顆粒填料的柱效高，價格比較貴。粗顆粒填料柱效低，但價格便宜，而且柱壓低適合制備柱。從材料看目前有：硅膠類和有機樹脂類?？讖酱笮。簩Σ煌锎蠓肿臃蛛x有各自不同的合適孔徑大小色譜柱及填充技術最長柱長！原因：超過-無法得到均勻填充床；柱效不是與柱長永遠成比例增長；高壓泵的容量的限制。色譜柱及填充技術填充方式：干法：適用于直徑30um的顆粒；濕法：適用于直徑20um的顆

8、粒。 在用溶劑平衡時，先使材料沉淀，用傾瀉法除去懸浮的細顆粒，否則由于細顆粒的堵塞，溶劑的流速將顯著降低。 為防止出現(xiàn)死空間而降低柱效，可對制備柱采用壓縮技術樣品溶解與進樣技術增加溶質(zhì)的溶解度：溶劑的性質(zhì)必須適應于所用的固定相；使大量的樣品溶液導入色譜柱后不馬上擴散在反相色譜中，溶解樣品的溶劑極性必須大吸附色譜中恰恰相反，溶劑的極性必須小于流動相疏水作用色譜中，溶劑的離子強度不能小于流動相的離子強度進樣：必須保證大量樣品溶液能均勻分布在柱的截面上，使軸向擴散及局部超載降至最低。（1）采用帶樣品管的六通進樣閥；（2）用高壓泵直接輸送樣品非線性色譜的3種展開方式1.超載洗脫：與傳統(tǒng)的洗脫方法差別不大。但樣品在固定相上的負載超過了線性洗脫色譜的容量，展開時濃度逐漸稀釋，形成較寬而平坦的峰。優(yōu)點：產(chǎn)率高，省時，節(jié)省溶劑缺點：柱效不如線性洗脫高，溶劑不斷稀釋，后期純化麻煩。非線性色譜的3種展開方式2.前沿分析：樣品溶液不是作為一部分進入色譜柱，而是連續(xù)不斷地輸入色譜柱，即它本身起了流動相的作用。洗脫展開峰是以一個個臺階的方式展示的。適合濃縮痕量組分