分子生物學(xué)常用實驗方法與基本儀器操作課件

1、分子生物學(xué)常用實驗方法與基本儀器操作 分子生物學(xué)發(fā)展簡史近半個世紀以來Nobel medal Half a pound of 23-karal gold. 2.5 inches across分子生物學(xué)發(fā)展簡史近半個世紀以來分子生物學(xué)發(fā)展簡史1.1支撐學(xué)科的掘起 Matthias Schleiden Theodor Schwann生物體由細胞組成 所有組織的最基本單元-形狀相似，高度分化的細胞 細胞的發(fā)生與形成是生物界普遍和永久的規(guī)律Cytology分子生物學(xué)發(fā)展簡史遺傳因子假說 (Hypothesis of the inherited factor G. J. Mendel 1866. ) 生

2、物性狀由遺傳因子控制 親代傳給子代的是遺傳因子(A,a.) 遺傳因子在體細胞內(nèi)成雙(AA,aa) 在生殖細胞內(nèi)為單（A,a） 雜合子體細胞內(nèi)具有成雙的遺傳因子(Aa) 等位的遺傳因子獨立分離 非等位遺傳因子間自由組合地分配到配子中分子生物學(xué)發(fā)展簡史 For his discoveries concerning the role played by the Chromosome in heredity, demonstrated that genes are on the chromosome 1933年，獲得諾貝爾生物學(xué)獎Thomas Hunt Morgan分子生物學(xué)發(fā)展簡史 早期的遺傳學(xué)家們

3、研究基因Forward Genetics ：在不知基因化學(xué)本質(zhì)前提下分析突變體在世代間的傳遞規(guī)律研究基因特性和染色體定位描述基因突然和染色體變異效應(yīng) 二十世紀中葉遺傳學(xué)家們不再滿足于基因的抽象觀念，開始聚焦提示基因的本質(zhì)和作用機制分子生物學(xué)發(fā)展簡史時間得主得獎原因1946年詹姆斯B薩姆納發(fā)現(xiàn)了酶可以結(jié)晶1946年約翰霍華德諾思羅普溫德爾梅雷迪思斯坦利制備了高純度的酶和病毒蛋白質(zhì)1958年弗雷德里克桑格對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組成的研究，特別是對胰島素的研究1958年喬舒亞萊德伯格發(fā)現(xiàn)細菌遺傳物質(zhì)的基因重組和組織1959年阿瑟科恩伯格發(fā)現(xiàn)核糖核酸和脫氧核糖核酸的生物合成機制塞韋羅奧喬亞研究遺傳物質(zhì)-基因的本

4、質(zhì)，理解基因調(diào)控生化代謝過程分子生物學(xué)分子生物學(xué)簡史1.2 分子生物學(xué)第一個重要發(fā)現(xiàn)George Beadle & Edward Tatum1941年，提出“One Gene- One Enzyme”假說，說明基因的生化作用本質(zhì)是控制酶的合成獲得1958年諾貝爾生物學(xué)獎分子生物學(xué)發(fā)展簡史Oswald Avery1.3 DNA是遺傳物質(zhì)1928-1944年的肺炎鏈球菌遺傳轉(zhuǎn)化研究證明DNA是轉(zhuǎn)化因子第一個動搖了“蛋白質(zhì)是基因”的理念，奠定了“DNA是遺傳物質(zhì)”的理論基礎(chǔ)。1952年，M.Delbruck & S.E. Luria & A.Hershey對噬菌體繁殖過程展開深入研究，確定DNA是主

5、要遺傳物質(zhì)。獲得1969年諾貝爾生物學(xué)獎。HrersheyDelbruckLuria分子生物學(xué)發(fā)展簡史1.4 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的揭示 Francis Crick James Watson1953，DNA Double Helix model 1962，NP分子生物學(xué)發(fā)展簡史1.5 破譯遺傳密碼 R. Holley H.G. Khorana M. Nirenberg 破解遺傳密碼并闡釋其在蛋白質(zhì)合成中的作用1968 NP分子生物學(xué)發(fā)展簡史1.6 mRNA的發(fā)現(xiàn)和operon的提出基因通過RNA嚴格地控制著蛋白質(zhì)的合成命名為信使RNA（mRNA）暗示了“三聯(lián)體遺傳密碼”以外的“空間調(diào)控密碼”的存在

6、，為分子生物學(xué)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)1965 NPF. Jacob & J. Monod & A. Lwoff 分子生物學(xué)發(fā)展簡史中心法則：從DNA流向DNA(DNA自我復(fù)制);從DNA流向RNA，進而流向蛋白質(zhì)(轉(zhuǎn)錄和翻譯);從RNA流向RNA(RNA自我復(fù)制);從RNA流向DNA(逆轉(zhuǎn)錄)1975 NP分子生物學(xué)發(fā)展簡史1.8 學(xué)科互促共進DNA分子的克隆技術(shù)基因的定點誘變技術(shù)PCR的DNA擴增技術(shù)細胞與組織培養(yǎng)技術(shù)使分子生物學(xué)從觀察性-驗證性的科學(xué)發(fā)展成干涉性-創(chuàng)造性的科學(xué)分子生物學(xué)發(fā)展簡史 Werner Arber Daniel Nathans Hamilton O. Smith 發(fā)現(xiàn)限制性

7、內(nèi)切酶及其在分子遺傳學(xué)方面的應(yīng)用1978 NP分子生物學(xué)發(fā)展簡史對核酸中DNA堿基序列的確定方法The Nobel Prize in Chemistry 1980Walter Gilbert Frederick Sanger Paul Burg1958 NP：胰島素結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)發(fā)展簡史Kary B. Mullis 發(fā)展了以DNA為基礎(chǔ)的化學(xué)研究方法，開發(fā)了聚合酶鏈鎖反應(yīng)（PCR）對分子生物學(xué)家研究工作的影響程度超過了其他任何技術(shù)，它的應(yīng)用領(lǐng)域幾乎超過了其他任何技術(shù)。1993 NP in Chemistry分子生物學(xué)發(fā)展簡史1.9 現(xiàn)代分子生物學(xué)研究對象的變換研究策略的創(chuàng)新研究內(nèi)容的拓展分子生

8、物學(xué)發(fā)展簡史研究對象的變換以果蠅，豌豆為揭示生命奧秘的材料系統(tǒng) 高等真核生物宏觀與微觀的結(jié)合40年代以病毒，細菌原核生物系統(tǒng)為試材，Cistron，one gene one enzyme，operon, 等新理論不斷被發(fā)現(xiàn)，新概念不斷被提出，生物學(xué)開始騰飛. 1969 Nobel Delbruck 1969 Nobe medall HersheyLuria 分子生物學(xué)發(fā)展簡史時間得主得獎原因1983巴巴拉麥克林托克發(fā)現(xiàn)可移動的遺傳元素1989悉尼奧爾特曼&托馬斯切赫發(fā)現(xiàn)了RNA的催化性質(zhì)1993理察羅伯茨&菲利普夏普發(fā)現(xiàn)斷裂基因1995愛德華路易斯&克里斯汀紐斯林-沃爾哈德&艾瑞克威斯喬斯發(fā)現(xiàn)

9、早期胚胎發(fā)育中的遺傳調(diào)控機理1997史坦利布魯希納發(fā)現(xiàn)朊病毒傳染的一種新的生物學(xué)原理2001利蘭哈特韋爾&蒂姆亨特&保羅納斯發(fā)現(xiàn)細胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子2002悉尼布倫納&H羅伯特霍維茨&約翰E蘇爾斯頓發(fā)現(xiàn)器官發(fā)育和細胞程序性死亡的遺傳調(diào)控機理2006安德魯法厄&克雷格梅洛發(fā)現(xiàn)了RNA干擾雙鏈RNA引發(fā)的沉默現(xiàn)象分子生物學(xué)發(fā)展簡史研究策略的創(chuàng)新（ Genomics ）1990. 10. 1. HGP 20世紀Reductionism21世紀Holism分子生物學(xué)發(fā)展簡史Gene + ome+ ics Transcriptome Proteome Metabolome Phenotypome揭示生

10、命現(xiàn)象的本質(zhì)分子生物學(xué)發(fā)展簡史研究內(nèi)容的拓展19401965分子生物學(xué)的核心問題：DNA作為遺傳物質(zhì)的三大基本屬性問題得以基本的闡明分子生物學(xué)發(fā)展史上劃了個階段性的句號分子生物學(xué)研究在已建立的基本理論框架中進行全方位的“解謎”分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器1. 高壓滅菌分子生物學(xué)的前期準備滅菌(sterilization) 殺滅物體上所有微生物的方法。因此，滅菌比消毒要求高，包括殺滅病原微生物和非病原微生物、細菌的繁殖體和芽胞。無菌(asepsis) 不含活菌的意思。防止細菌進入人體或其它物品的操作技術(shù)，稱為無菌操作。分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器1.1 滅菌方法一、物理消毒滅菌法（一）熱力滅菌法

11、1.干熱滅菌法：火焰灼燒滅菌和熱空氣滅菌。原理是加熱使蛋白質(zhì)變性，與水的含量有關(guān)，當環(huán)境和細胞含水量越大，凝固越快。（1）焚燒：被污染的紙張、實驗 室有傳染性的動物尸體、無經(jīng)濟價值的物品可以燒掉。 （2）燒灼：火焰灼燒適用于接種環(huán)、 接種針和金屬用具如鑷子等，試管口和瓶口，涂 布用玻璃棒。分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器1.1 滅菌方法（3）干烤：干烤滅菌法需在干烤箱進行，靠熱空氣進行滅菌。這種方法適用于玻璃器皿、金屬器械以及不能遇水的油脂、凡士林等滅菌。滅菌時一般加熱至160170 2小時可達到滅菌的目的。在裝滿物品的干烤箱內(nèi)，不同部位的溫度差可達3040，故溫箱內(nèi)最好裝有鼓風(fēng)機使溫度均勻。箱內(nèi)

12、物品不宜裝得太多，以免影響空氣的流通。（4）紅外線：紅外線烤箱，供小件器械(鑷子、剪刀等)以及玻璃注射器等迅速滅菌用。注意事項：1）培養(yǎng)基、橡膠制品、塑料制品不能用此法；2）溫度控制在180；3）物品不能太擠；4）溫度降至70時才開箱門。分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器1.1 滅菌方法（2）煮沸消毒法：煮沸5分鐘，可殺滅所有的細菌繁殖體。但殺死芽胞則需一至數(shù)小時。如在水中加入1%碳酸鈉即可提高沸點，增強殺滅芽胞作用，同時又可防止金屬器械生銹。如水中加25%石炭酸，則1015分鐘后可破壞芽胞，所以許多醫(yī)療器械如手術(shù)刀、剪、鑷子、膠管、注射器等，常用煮沸消毒。2. 濕熱滅菌法: 原理：因為濕熱中菌體吸

13、水，蛋白質(zhì)容易凝固。蛋白質(zhì)凝固時所需溫度與其含水量成反比關(guān)系，即蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低；濕熱的蒸氣有潛熱存在。濕熱的穿透力比干熱大。所以效果比同溫度下干熱好。（1）巴氏消毒法(pasteurization)：常用于牛奶和酒類等物品的消毒。具體的消毒方法有兩種：一是以61.162.8消毒30分鐘；另一方法是以71.7，消毒1530秒鐘。 分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器1.1 滅菌方法（3）流通蒸氣消毒法：用阿諾氏滅菌器或普通蒸氣籠進行。因此在正常大氣壓下，故溫度不會超過100。普通細菌的繁殖體1530分鐘可殺死。但芽胞不易消滅。（4）間歇滅菌法：有些物質(zhì)不能加熱至100以上，例如含血清

14、的培養(yǎng)基等，為了消滅其中的細菌芽胞，須用間歇滅菌法。方法是用阿諾滅菌器或用蒸籠加熱100維持30分鐘，每天進行一次，連續(xù)三天。第一次加熱后，細菌的繁殖體即被殺滅，而芽胞還能存活，為了使芽胞發(fā)芽成繁殖體，將被滅菌的物品取出放在室溫37溫箱內(nèi)過夜，第二天再加熱一次，則可殺死由芽胞生成的繁殖體。為了達到徹底滅菌，照上法再進行第三次加熱，這樣所有的芽胞將被殺滅。應(yīng)用間歇滅菌法，在間歇期必須提供芽胞發(fā)芽所需條件。（5）高壓蒸氣滅菌法：設(shè)備：高壓滅菌器 時間長短根據(jù)滅菌物品的種類和數(shù)量不同有所變化。 適用于培養(yǎng)基等的滅菌，在1.05kg/cm2蒸氣壓下，溫度達121.3，維持1520分鐘，可殺滅包括細菌芽

15、胞在內(nèi)的所有微生物。高壓蒸氣滅菌器就是根據(jù)這一原理制成的，常用于一般培養(yǎng)基、生理鹽水、手術(shù)敷料、工作服、橡膠物品等耐高溫、耐濕熱等物品的滅菌，也可用于玻璃器皿的滅菌。分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器1.1 滅菌方法殺滅幾類主要微生物的濕熱條件微生物營養(yǎng)細胞孢子或芽孢酵母菌50-60，5分鐘70-80，5分鐘霉菌62，30分鐘80，30分鐘細菌 （中溫細菌）50-70，10分鐘2-800分鐘，100；或 120，5-12分鐘病毒60，30分鐘分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器1.1 滅菌方法(二)電磁波輻射殺菌法1. 紫外線：原理：紫外線波長在200300nm，具有殺菌作用，以265-266殺菌力強。此段

16、波長易被細胞中核酸吸收；這與DNA的吸收光譜范圍一致。缺點：穿透力不大。距照射物1.2m為宜。紫外線釋放的能量較低，故穿透力較弱，普通玻璃、紙張、塵埃、水蒸氣等均能阻擋紫外線。應(yīng)用：只能用于無菌操作臺的空氣消毒，或用于不耐熱物品的表面消毒。 注意事項：殺菌波長的紫外線對人體皮膚、眼睛有損傷作用，使用時應(yīng)注意防護。2. 電離輻射：包括高速電子、X射線和射線等。在足夠劑量時，對各種細菌均有致死作用。其機制在于產(chǎn)生游離基，破壞DNA。分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器1.1 滅菌方法(三)濾過除菌法：是用物理阻留的方法將液體或空氣中的細菌除去。所用的器具是濾菌器(filter)。濾菌器含有微細小孔，只允許

17、液體或氣體通過，而大于其孔經(jīng)的細菌等顆粒不能通過。 濾過除菌主要用于一些不耐高溫滅菌的血清、毒素、抗生素，以及空氣等的除菌。 目前過濾除菌采用兩類器具，一類叫深層濾器，另一類是濾膜。 濾膜一般由醋酸纖維素、硝酸纖維素、多聚碳酸酯、聚偏氟乙烯等合成纖維材料制成。 濾膜的孔徑一般為0.2微米，它可以濾除絕大多數(shù)微生物的營養(yǎng)細胞。 過濾法的最大缺點是不能濾除病毒。注意事項： 1、壓力適當； 2、無菌條件下進行； 3、防止?jié)B透現(xiàn)象。 分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器1.1 滅菌方法 我們來看一下濾膜滅菌是如何工作的。如下圖所示，在一個漏斗形容器上部放置數(shù)片濾膜。右圖是整個過濾系統(tǒng)。待除菌的液體裝在三角瓶中

18、（1），用蠕動泵（2）將液體抽到過濾器（3）內(nèi)，濾過的液體進入事先滅菌的瓶子中。如果是滅菌少量液體，可以采用一種簡單的的濾器。分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器1.2 常用滅菌設(shè)備 凡耐高溫的普通培養(yǎng)基、藥品、耗材等，均可用此法滅菌。為保證滅菌效果和安全，器內(nèi)要加入足量的水，裝入的物品不要過擠，冷空氣必須排盡，注意壓力表的工作情況，防止壓力表失靈而造成事故。手提式高壓蒸汽滅菌器 分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器1.2 常用滅菌設(shè)備 干烤箱是用兩層金屬板制成的方形箱，中間充滿石棉，箱底有熱源(電爐)，并附有溫度計和自動溫度調(diào)節(jié)器。滅菌時，打開通氣口，加熱到80時，關(guān)閉通氣口，待溫度上升。到160-170時

19、，保持2h。最高溫度不得超過180，超過180棉塞和包裝紙會被烤焦。滅菌后，待溫度下降40以下，再開箱取物。否則，冷空氣突然進入，玻璃器材會炸裂。干烤箱 耐高溫的玻璃器材、瓷器等常用此法滅菌，如培養(yǎng)細菌用的試管、平皿、吸管等。注意：1）玻璃器皿不可有水。有水的玻璃器皿在干熱滅菌中容易炸裂。2）物品不能堆得太滿、太緊 , 以免影響滅菌效果。3）禁放易燃易焦物品，不得充當溫箱使用。4）玻璃吸管和玻璃平皿等應(yīng)放入金屬筒內(nèi)，再放入干烤箱內(nèi)滅菌。分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器1.2 常用滅菌設(shè)備 高壓滅菌器是一種用于實驗室實驗、滅菌或燒煮的高壓加熱蒸氣作用的容器。電動鎖系統(tǒng)：僅用觸摸控制器就可以輕易和安全

20、地開啟箱蓋。安全雙向檢測聯(lián)鎖裝置：通過檢測內(nèi)壓力和箱內(nèi)溫度來鎖住箱蓋， 確保使用時具有更大的安全性。雙向傳感系統(tǒng)監(jiān)控空氣排除狀態(tài)：為了避免殘留空氣影響到滅菌結(jié)果.自動排氣裝置：采用最新的自動排除蒸汽的裝置以達到不用沸騰就能對液體基質(zhì)進行滅菌； 在滅菌完成后，可以預(yù)先設(shè)定速率逐漸地釋放蒸汽。瓊脂處理方法：允許使用者更大幅度地加快融化瓊脂或?qū)ο鋬?nèi)進行預(yù)熱。自動編排啟動程序：內(nèi)置定時器可設(shè)定一段時間程序， 以使高壓滅菌器自動啟動一個滅菌周期（最長可維持一個星期）。記憶（儲存）支持系統(tǒng)：可以改變各種參數(shù)（如滅菌、排氣、加熱等參數(shù)）， 且一旦發(fā)生改變（甚至發(fā)生停電故障）上述參數(shù)仍能被保留下來。全自動電子

21、高壓滅菌鍋HV系列分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器高壓滅菌器使用的注意事項一不能使用此高壓蒸汽滅菌器消毒任何有破壞性材料和含堿金屬成份的物質(zhì)。消毒這些物品將會導(dǎo)致爆炸或腐蝕內(nèi)膽和內(nèi)部管道，以及破壞墊圈。危險物品清單如下： 1.爆炸物質(zhì) 乙二醇二硝酸酯（硝化甘醇），硝酸甘油，硝化纖維素（硝化纖維素濾器）和所有含硝酸根的酯類。 三硝基苯，黃色炸藥，苦味酸和所有易燃易爆的硝基 過乙酸，甲烷基，乙基，甲醇，過氧化氫， 過氧化物，苯甲酰，苯甲酰基及有機過氧化物。2.可燃性物質(zhì) 金屬鋰、鉀、鈉、黃磷、磷、硫化物、紅磷。 明膠、碳化鈣（電石）、氧化鈣（石灰），鎂粉，連二亞硫酸鈉（保險粉）。3.氧化劑氯化鉀，氯化

22、鈉，氯化銨和其他氯化物。（粉劑） 高氯酸鉀，高氯酸鈉，高氯酸銨和其他高氯化物。硝酸鉀，硝酸鈉，硝酸銨和其他硝酸物。過氧化鉀，過氧化鈉，過氧化鋇和其他無機過氧化物。亞氯酸鈉和其他亞氯化物，次氯酸鈣和其他次氯酸物。4.易燃物質(zhì) 二乙醚，醚，汽油，乙醛（醋醛），氧化丙稀，環(huán)氧丙烷，二硫化碳,甲醇，乙醇，二甲苯，芐基， 乙酸芐酯，燈油，火油，汽油，異戊醇，乙酸（醋酸），其他燃點在30 65 之間的類似物質(zhì).5.易燃的氣體（氫氣，乙炔，次乙基，甲烷）乙烷，丙烷，丁烷和其他在15 及一個大氣壓下的氣體。分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器高壓滅菌器使用的注意事項二.含有鹽分的液體漏出或溢出時，一定要及時擦干凈，沿

23、著蓋子的密封圈要徹底擦干，否則會腐蝕容器和管道。三.當滅菌室有壓力時，聯(lián)鎖手柄不能拉開，不可強制開門。在打開蓋子前，確認壓力已歸于“0/npa”以下。四.絕對不許擅自改造這個產(chǎn)品。五.不要在爆炸性氣體附近使用該儀器。六.不要隨意去動電源線，不要把重物壓在電源線上，損壞的電線或金屬絲暴露會導(dǎo)致斷電或著火。七.除蒸餾水外，不要倒任何液體于容器內(nèi)。八.不要使用此高壓蒸汽滅菌器用于其他目的的消毒和高壓未溶解的瓊脂。（粉劑）九.檢查蓋子的墊圈有無異物粘連，如有異物要及時清除，否則會導(dǎo)致蒸汽泄漏。十.請使用配套的工具，不要使用其他籃筐于滅菌器內(nèi)。十一.滅菌結(jié)束后，請在70以下拿出，高壓后取物品時注意燙傷。

24、十二.如有異常發(fā)生（有聲音發(fā)出，聞到氣味，冒煙），請立即切斷電源。聯(lián)系工程師，排除異常后再 繼續(xù)使用。十三.移動此儀器請將蓋子鎖上。移動蓋子時，不要拉蓋子的手柄，否則蓋子會變形，難以蓋嚴。分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器高壓滅菌器使用的注意事項十四.特別注意：1.滅菌器應(yīng)由經(jīng)過培訓(xùn)合格的人員操作。2.不能完全依靠自動水位保護，應(yīng)經(jīng)常注意水位，以免燒壞電熱管?！?個水位要注意”!3.每周在夾層有壓力時拉動安全閥手柄數(shù)次，以確保安全閥工作正常。4.每日班后將滅菌器的置物板拿開，用布抹干滅菌室，保持滅菌室干燥。5.每日班后將蒸汽發(fā)生器內(nèi)的水帶壓力排放完，以減少水垢。分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器2.DNA

25、基本操作技術(shù)核酸凝膠電泳技術(shù)細菌轉(zhuǎn)化與目標DNA分子的增殖聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)實時定量PCR基因組DNA文庫構(gòu)建分子生物學(xué)實驗常用實驗方法2.1 核酸凝膠電泳技術(shù)1.電泳：是指帶電粒子在電場中向與其自身帶相反電荷的電極移動的現(xiàn)象。 2.電泳基本原理3.影響電泳速度的主要因素 電場強度、溶液的pH值、溶液離子強度、電滲現(xiàn)象、溫度的影響、支持物的影響分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器操作注意4.3 凝膠電泳的簡介電泳的分類3.分類 3.1 按使用目的命名，如： 核酸電泳 血清蛋白電泳 制備電泳 DNA測序電泳3.2 按分離的原理區(qū)分： 區(qū)帶電泳(zone EP，ZEP) 移界電泳(moving bounda

26、ry EP，MBEP) 等速電泳(isotachophoresis，ITP) 等電聚焦(isoelectric cusing，IEF) 3.3 按有無固體支持物區(qū)分：根據(jù)電泳是在溶液中進行還是在固體支持物上進行，分為自由電泳和支持物電泳兩大類。 3.3.1 按支持介質(zhì)不同劃分，如： 紙電泳 醋酸纖維薄膜電泳 瓊脂糖凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳3.3.2 按支持介質(zhì)形狀不同劃分，如： 薄層電泳 水平電泳 柱電泳 垂直電泳分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器毛細管電泳技術(shù)傳統(tǒng)電泳最大的局限是難以克服由高電壓引起的焦耳熱。1967年Hjerten最先提出在直徑為3mm的毛細管中做自由溶液的區(qū)帶電泳（Capi

27、llary Zone Electro-phoresis, CZE）。 但他沒有完全克服傳統(tǒng)電泳的弊端?，F(xiàn)在所說的毛細管電泳技術(shù)（CE）是由Jorgenson和Lukacs在1981年首先提出，他們使用了75mm的毛細管柱，用熒光檢測器對多種組分實現(xiàn)了分離。1984年Terabe將膠束引入毛細管電泳，開創(chuàng)了毛細管電泳的重要分支：膠束電動毛細管色譜（MEKC）。1987年Hjerten等把傳統(tǒng)的等電聚焦過程轉(zhuǎn)移到毛細管內(nèi)進行。同年，Cohen發(fā)表了毛細管凝膠電泳的工作。近年將液相色譜固定相引入毛細管電泳中，又發(fā)展了電色譜，擴大了電泳的應(yīng)用范圍。分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器電泳儀的使用方法1.將電泳

28、槽兩個電極與電泳儀的直流輸出端聯(lián)接，注意極性不要接反。2.接通電源，緩緩旋轉(zhuǎn)電壓調(diào)節(jié)鈕直到達到的所需電壓為止，設(shè)定終止時間，此時電泳即開始進行。3.完畢后，應(yīng)將各旋鈕、開關(guān)旋至零位或關(guān)閉狀態(tài)，并撥出電泳插頭。例如：聚丙烯酰胺凝膠電泳操作 制備瓊脂糖凝膠 瓊脂糖凝膠電泳操作視頻分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器電泳常見問題及對策分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器電泳儀使用注意事項如果輸出端接多個電泳槽，則儀器顯示的電流數(shù)值為各槽電流之和，此時應(yīng)選擇穩(wěn)壓輸出，以減小各槽的相互影響。注意保持儀器的清潔，不要遮擋儀器后方進風(fēng)通道。嚴禁將電泳槽放在儀器頂部，避免緩沖液灑進儀器內(nèi)部。本儀器輸出電壓較高，使用中應(yīng)避免接

29、觸輸出回路及電泳槽內(nèi)部，以免發(fā)生危險。長期不用儀器，應(yīng)放置在干燥通風(fēng)的清潔環(huán)境中保存。特別注意：溴化乙錠（EB）：為致癌劑，414實驗室的所有電泳系統(tǒng)不得使用EB。包括制膠和跑膠過程都不得加入EB。用含EB的溶液進行浸泡時應(yīng)戴手套，浸泡后轉(zhuǎn)移至拍照過程中應(yīng)放在容器內(nèi)或者保鮮膜上，嚴禁在轉(zhuǎn)移過程中出現(xiàn)滴水現(xiàn)象，盡量減少地面與臺面污染。建議使用熒光染料。瓊脂糖膠嚴禁倒入水池，以免產(chǎn)生堵塞。準備轉(zhuǎn)化態(tài)細胞42熱沖擊電轉(zhuǎn)化加入外源DNA細胞復(fù)蘇平板篩選CaCl210%甘油藍白斑篩選+ 抗生素 + IPTG + X-gal 要靈活運用，根據(jù)不同情況設(shè)計篩選策略！2.2 細菌轉(zhuǎn)化與目標DNA分子的增殖分子

30、生物學(xué)實驗常用方法與儀器分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器2.3聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)2.3.1 PCR技術(shù)簡介2.3.2 熱循環(huán)儀的原理及發(fā)展狀況分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器2.3.1 PCR技術(shù)簡介何謂PCR？ 簡單的說，PCR就是利用DNA聚合酶對特定基因做體外或試管內(nèi) (In Vitro) 的大量合成?；旧纤抢肈NA聚合酶進行專一性的連鎖復(fù)制.目前常用的技術(shù),可以將一段基因復(fù)制為原來的一百億至一千億倍。 PCR原理 PCR的要素 基本的PCR須具備：1.要被復(fù)制的DNA模板 (Template) 2.界定復(fù)制范圍兩端的引物(Primers). 3.DNA聚合酶 (Taq. Polymears

31、e) 4.合成的原料及水。 PCR的反應(yīng)包括三個主要步驟 1). Denaturation 2). Annealing of primers, and 3). Extension of primers。 Denaturing是將DNA加熱變性，將雙股的DNA加熱后轉(zhuǎn)為單股DNA以做為復(fù)制的模板. Annealing則是令Primers于一定的溫度下附著于模板DNA兩端。 最后在DNA聚合酶(e.g. Taqpolymerase) 的作用下進行引物的延長 (Extension of primers)及另一股的合成。 分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器2.3.2 熱循環(huán)儀的原理及發(fā)展狀況第一代：手動/機

32、械手式水浴基因擴增儀用三個恒溫水浴箱，分別將三個水浴溫度恒定在三個溫度：PCR的高溫變性溫度（如94）低溫復(fù)性溫度（如58），適溫延伸溫度（如72）。再用一個裝有PCR標本試管的提籃，用手工/機械在不同溫度的水浴箱中依次水浴，標本在每個水浴箱中恒溫的時間用秒表計時。這樣PCR標本就能完成下述形式的熱循環(huán)： 94 30S 58 45S 72 60S 40次循環(huán)優(yōu)點：溫度變化快，時間準確缺點：操作繁瑣早期機型分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器 2.3.2 熱循環(huán)儀的原理及發(fā)展狀況 第二代：自動化控制型定性基因擴增儀 與上述水浴式擴增儀相比，也有人稱該種擴增儀為干式基因擴增儀，它是最具代表性的擴增儀，包括

33、后續(xù)介紹的第三代、第四代都是以第二代為基礎(chǔ)集成了定量檢測部分。 （1）變溫金屬塊作恒溫裝置 加熱方式有電熱發(fā)熱、半導(dǎo)體發(fā)熱，制冷方式有半導(dǎo)體制冷和壓縮機制冷等多種方式。 特點是產(chǎn)品質(zhì)量和性能較穩(wěn)定，最常見的方式。（2）空氣驅(qū)動循環(huán)恒溫裝置 本系統(tǒng)力求降低部件的成本，用空氣作為熱傳導(dǎo)媒介。裝置包括機箱（外殼）、熱源、冷空氣源、控制器和輔助電器元件等部分。 優(yōu)點：不用金屬的精密加工，成本降低。整個系統(tǒng)沒有液體流動，不用致冷液，因而安全程度高。 缺點：單純靠外部空氣制冷，受環(huán)境溫度影響。分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器3.2 熱循環(huán)儀的原理及發(fā)展狀況 第三代：終點定量/半定量 第二代的定性PCR只能判斷

34、陰性陽性，而無法評價特定核酸的濃度及定量分析，定量PCR至少能達到定性PCR無法實現(xiàn)的下列功能： 潛伏期病毒濃度探測 感染程度 致病病原體數(shù)量變化測定 抗病毒藥物療效評估 恢復(fù)期病毒載量檢測終點定量PCR技術(shù)是從定性向?qū)崟r定量過渡的一個中間產(chǎn)品，而PCR終點產(chǎn)物熒光定量儀進口產(chǎn)品較少，國產(chǎn)儀器較多西安天隆的TL988，上海棱光的DA620型等 分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器3.2 熱循環(huán)儀的原理及發(fā)展狀況第四代：實時定量PCR儀自動分析軟件實時熒光定量試劑實時定量PCR儀通用電腦PCR-DNA/RNA實時熒光定量檢測系統(tǒng)分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器2.3.2 熱循環(huán)儀的原理及發(fā)展狀況傳統(tǒng)的48孔

35、/96孔板式定量PCR儀 創(chuàng)新概念的離心式實時定量PCR儀 Rotor-Gene 6000 定量PCR儀3D演示分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器2.3.2 熱循環(huán)儀的原理及發(fā)展狀況Smart CyclerII獲得過1998年美國研發(fā)R&D100金獎。Smart CyclerII的機型小巧，只有16個樣品槽，它的獨到之處在于這16個樣品槽分別擁有獨立的智能升降溫模塊，也就是說這16個樣品槽相當于16臺獨立的定量PCR儀！第三類的熒光定量PCR儀以Cepheid公司的Smart CyclerII為代表分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器2.4 實時定量PCR定義：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號的變化對PCR過程進行實時監(jiān)控，以此實現(xiàn)對初始模板的定量分析分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器3. 凝膠成像檢測3.1 常見凝膠成像設(shè)備3.2 凝膠成像系統(tǒng)操作程序分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器3.1 常見凝膠成像設(shè)備Gene genius 凝膠成像系統(tǒng)分子生物學(xué)實驗常用方法與儀器3.1 常見凝膠成像設(shè)備ChemiDoc XR