毒理學試驗方法與技術(shù)

1、毒理學實驗方法與技術(shù)作 者： 王心如 主編出版社：人民衛(wèi)生出版社 出版時間：2006-2-1字 數(shù)：302000版 次： 1頁 數(shù)： 203印刷時間： 2006-2-1開本：印次： 紙 張：膠版紙 I S B N ： 9787117056618 包 裝： 平裝所屬分類：圖書 醫(yī)學 醫(yī)藥衛(wèi)生教材第一章毒理學實驗基礎(chǔ)第一節(jié) 毒理學實驗的原則和局限性在描述毒理學的試驗中，有三個基本的原則：.化學物在實驗動物產(chǎn)生的作用，可以外推于人?；炯僭O(shè)為：人是最敏 感的動物物種；人和實驗動物的生物學過程包括化學物的代謝，與體重（或體 表面積）相關(guān)。這兩個假設(shè)也是全部實驗生物學和醫(yī)學的前提。以單位體表面積 計算在

2、人產(chǎn)生毒作用的劑量和實驗動物通常相近似。而以體重計算則人通常比實 驗動物敏感，差別可能達10倍。因此可以利用安全系數(shù)來計算人的相對安全劑 量。已知人致癌物都對某種實驗動物具有致癌性。實驗動物致癌物是否都對人有 致癌性，還不清楚，但此已作為動物致癌試驗的基礎(chǔ)。一般認為，如果某一化學 物對幾個物種實驗動物的毒性是相伺的，則人的反應也可能是相似的。.實驗動物必須暴露于高劑量，這是發(fā)現(xiàn)對人潛在危害的必需和可靠的方 法。此原則是根據(jù)質(zhì)反應的概念，隨劑量或暴露增加，群體中效應發(fā)生率增加。 毒理學試驗中，一般要設(shè)3個或3個以上劑量組，以觀察劑量-反應（效應）關(guān)系， 確定受試化學物引起的毒效應及其毒性參數(shù)。毒

3、性試驗的設(shè)計并不是為了證明化 學品的安全性，而是為了了解化學品可能產(chǎn)生的毒作用。僅僅檢測受試化學物在 人的暴露劑量是否引起毒效應是不夠的，盡管此劑量已超過人可能的暴露劑量。 當引起毒效應的最低劑量（LOAEL）與人的暴露劑量接近時，說明該化學物不安 全。當該劑量與人的暴露劑量有很大的距離（幾十倍，幾百倍或以上），才認為具 有一定安全性，此距離越大，安全性越可靠。如果在研究中所用的一系列的劑量 不能引起毒性效應，則認為所用劑量還不足夠高，應增加劑量，以確定受試化學 晶的毒性。但如果在試驗的最高劑量組的劑量與人可能的暴露劑量有足夠的安全 界限，則對于安全性評價來說未觀察到毒效應的研究是可以接受的。

4、在毒理學試 驗中實驗模型所需的動物總是遠少于處于危險中的人群。為了在少量動物得到有 統(tǒng)計學意義的可靠的結(jié)果，需要應用相對較高的劑量，以使效應發(fā)生的頻率足以 被檢測到。例如，低達0.01的癌癥發(fā)生率，這意味著在100萬人群中有100 人發(fā)生癌癥，此發(fā)生率太高，不能為公眾接受。在實驗動物直接檢測如此低發(fā)生 率將至少需要30000只動物。因此，在毒理學試驗中，對相對較少的實驗動物 必須以較高劑量進行試驗，然后根據(jù)毒理學原則外推估計低劑量的危險性。.成年的健康（雄性和雌性未孕）實驗動物和人可能的暴露途徑是基本的選 擇。成年的健康（雄性和雌性未孕）實驗動物是為了使實驗結(jié)果具有代表性和可重 復性。以成年的

5、健康（雄性和雌性未孕）實驗動物作為一般人群的代表性實驗模 型，而將幼年和老年動物、妊娠的雌性動物、疾病狀態(tài)作為特殊情況另作研究。 這樣可降低實驗對象的多樣性，減少實驗誤差。毒理學實驗結(jié)果的敏感性取決于 受試物處理引起毒效應強度和實驗誤差兩個因素，處理引起的毒效應強，實驗誤 差小，則實驗結(jié)果的敏感性增加，反映受試物處理的真實效應，反之亦然。實驗 設(shè)計是要規(guī)定實驗條件，嚴格控制可能影響毒效應的各種因素，保證實施質(zhì)量， 降低實驗誤差。只有這樣，才能保證試驗結(jié)果的準確性和可重現(xiàn)性。外源化學物 從不同途徑染毒實驗動物所表現(xiàn)的毒性可有很大差異，這是由于染毒部位解剖生 理特點不同，外源化學物吸收進入血液的速

6、度和量也不同，首先到達的器官和組 織也不同。因此，毒理學試驗中染毒途徑的選擇，應盡可能模擬人接觸該受試物 的方式。歷史上，環(huán)境污染物及某些藥物所引起的中毒和死亡多次發(fā)生，引起各 國的重視，推動了毒理學的發(fā)展，各國政府主管部門制訂和多次修訂了有關(guān)藥品 和各種化學品安全性評價的規(guī)范或準則，希望在嚙齒類和非嚙齒類的毒理學研究 能為有關(guān)候選新藥和各種化學品提供安全性證據(jù)，但以動物的資料預測人的毒性 的預測價值尚有待于研究。Lumley(1990)和Igarashi(1994)根據(jù)有限的臨床資料 報告對人的毒性約一半不能由臨床前(動物)毒性研究預測。Heywood(1983)報告 27個化學物(大多為藥

7、品)的靶器官毒性在大鼠和犬(或猴)之間的相符率僅20。 Olson等(1998)報告131種化學物對動物的毒性與人的毒性相符率，嚙齒類為 6，非嚙齒類(犬和猴)為28，合并達36，所有的物種相符率可達69。 按照目前的規(guī)范，進行毒理學安全性評價，可以在一定程度上提高新藥和各種化 學品的使用安全性，但仍不能完全排除對人健康危害的風險。WHO在臨床前 藥物安全性實驗原則的文件中指出雖然事先對生物活性物質(zhì)進行了最仔細徹底 的研究，但給人使用時總是不可避免地要冒一定的風險。這就是利用動物實驗的 局限性，即動物實驗的結(jié)果外推到人的不確定性。用實驗動物的毒理學試驗資料 外推到人群接觸的安全性時，會有很大的

8、不確定性。這是因為，外源化學物的毒 性作用受到許多因素的影響。首先，實驗動物和人對外源化學物的反應敏感性不 同，有時甚至存在著質(zhì)的差別。雖然在毒理學試驗中通常用兩種或兩種以上的動 物，并盡可能選擇與人對毒物反應相似的動物，但要完全避免物種差異是不可能 的。而且，實驗動物不能述說涉及主觀感覺的毒效應，如疼痛、腹脹、疲乏、頭 暈、眼花、耳鳴等，這些毒效應就難以或不可能發(fā)現(xiàn)。在動物實驗中，可觀察到 體征(sign)，而沒有癥狀(symptom)。第二，在毒理學試驗中，為了尋求毒作用 的靶器官，并能在相對少量的動物上就能得到劑量-反應或劑量效應關(guān)系，往往 選用較大的染毒劑量，這一劑量通常要比人實際接觸

9、的劑量大得多。有些化學物 在高劑量和低劑量的毒性作用規(guī)律并不一定一致，如大劑量下出現(xiàn)的反應有可能 是由于化學物在體內(nèi)超過了機體的代謝能力，這就存在高劑量向低劑量外推的不 確定性。第三，毒理學試驗所用動物數(shù)量有限，那些發(fā)生率很低的毒性反應，在 少量動物中難以發(fā)現(xiàn)。而化學物一旦進入市場，接觸人群往往會很大。這就存在 小數(shù)量實驗動物到大量人群外推的不確定性。第四，實驗動物一般都是實驗室培 育的品系，一般選用成年健康動物，反應較單一，而接觸人群可以是不同的人種、 種族，而且包括年老體弱及患病的個體，在對外源化學物毒性反應的易感性上存在很大差異。以上這些都構(gòu)成了從毒理學動物試驗結(jié)果向人群安全性評價外推時

10、 的不確定因素。第二節(jié) 毒理學毒性評價試驗的基本目的毒理學實驗的常規(guī)部分是毒性評價或安全性評價試驗。為了對受試物的毒性 進行全面的測試，增強測試結(jié)果的可靠性，權(quán)威機構(gòu)規(guī)定了評價程序，以保證毒 性評價研究可以達到普遍能接受的最低要求和原則。由于受試物的多樣性，試驗 程序應該有一定的靈活性。對毒理學試驗的原理和設(shè)計思路的深入理解，有助于 研究者對評價程序的實施，在發(fā)現(xiàn)新的現(xiàn)象或線索時，可進一步設(shè)計新的實驗來 證實，并研究其機制。毒性評價或安全性評價方面的基本目的包括以下幾點： 1.受試物毒作用的表現(xiàn)和性質(zhì) 在急性和慢性毒性試驗中，觀察受試物對機體的 有害作用，對每個實驗動物進行全面的逐項的觀察和記

11、錄。發(fā)現(xiàn)有害作用是進行 劑量-反應（效應）研究的前提。.劑量-反應（效應）研究 劑量-反應（效應）研究是毒性評價和安全性評價的基礎(chǔ)。 通過對不同有害作用的劑量-反應（效應）研究，可以得到該受試物的多種毒性參 數(shù)。在急性（致死性）毒性試驗中，應該得到LD50,也可以得到LDo和MTD。在 急性非致死性毒性試驗中，應該得50到急性可觀察到有害作用的最低劑量 （LOAEL）和未觀察到有害作用的劑量（NOAEL）。在亞急性、亞慢性及慢性毒性試 驗中，應該得到相應的LOAEL和NOAEL。在致突變、致癌和致畸等特殊毒性 試驗中，劑量-反應（效應）研究將為確定受試物是否具有這些特殊毒性提供依據(jù)。 在致畸試

12、驗也可得到LOAEL和NOAEL；在致突變、致癌試驗中，盡管認為是 無閾值的，但也可得到表觀的LOAEL和NOAEL。.確定毒作用的靶器官 確定受試物有害作用的靶器官，是毒理學研究的重要目 的，以闡明受試物毒作用的特點，并為進一步的機制研究和毒性防治提供線索。 4.確定損害的可逆性 一旦確認有害作用存在，就應研究停止接觸后該損害是否 可逆和消失，器官和組織功能是否能恢復，還是像化學致癌作用那樣停止接觸后 損害繼續(xù)發(fā)展。毒性的可逆性關(guān)系到對人的危害評價，如果受損的器官組織能夠 修復并恢復正常功能，則可能接受較高危險性的接觸水平。當然，毒理學研究還 可能有其他的目的和要求，例如毒作用的敏感檢測指標

13、和生物學標志、毒作用機 制研究、受試物的毒物動力學和代謝研究、中毒的解救措施等。對這些要求，應 擴展常規(guī)試驗的設(shè)計以包括有關(guān)的項目，或者另外設(shè)計和進行靶器官毒理學研究 及機制毒理學研究。第三節(jié)動物實驗的職業(yè)道德實驗動物(Laboratoryanimal)包括所有脫離自然環(huán)境而用于研究、教學和試驗的 脊椎動物。要預防和治療人類的疾病、要認識生命過程，生物學實驗是必不可少 的。實驗動物對醫(yī)學的發(fā)展有不可忽視的貢獻。所有的研究人員要尊重生命，善 待實驗動物。關(guān)于人類對待動物的倫理學爭論由來已久。18世紀哲學家 JeremyBethan指出：問題既不是它們能否思考，也不是它們會不會說話，而是 它們痛苦

14、不痛苦。也出版了很多有關(guān)動物的倫理學的書籍和文章。19世紀以來 興起了動物保護主義，各國成立各種動物保護組織，其中有一部分是主張絕對禁 止動物實驗的激進派?？茖W家和大多數(shù)民眾則主張對動物實驗加以規(guī)范，通過立 法保障動物福利。英國1822年通過了馬丁法，禁止虐待動物；1876年通過了 禁止虐待動物法；1986年通過了科學實驗動物法。美國1873年聯(lián)邦法中有人 道地對待動物的條文；1966年通過了動物福利法。我國實驗動物管理條例 規(guī)定對實驗動物必須愛護，不得戲弄或虐待。對于那些人為造成喪失獨立生存能 力的生物和那些用于研究、教學的試驗的動物，我們都負有道義上的責任。使用 有知覺動物作研究時，其前提

15、必須期望該研究對最終能使人類或動物的健康和福 利得到改進的認識有重大的貢獻。遵守下列原則：給予人道主義的管理和處理 使痛覺和不適感減少到最低限度；避免不必要的使用實驗動物。合適的建筑 設(shè)備固然重要，但更重要的是管理體制和使用實驗動物的各級人員的知識水平和 對動物的關(guān)心程度。應貫徹英國WilliamRussell和RexBrursh(1959)4ThePrinciplesOfHumaneExperimentalTechnique提倡的 3R 原則，即替代 (replacement)、減少(reduction)和優(yōu)化(refinement)。替代是指應用無知覺材料 的科學方法來代替使用活的有知覺脊

16、椎動物的方法。減少是指在能保證獲取一定 數(shù)量與精確度的數(shù)據(jù)信息的前提下，減少動物的使用數(shù)量。優(yōu)化是指在必須使用 動物時，要盡量減少非人道程序的影響范圍和程度。第四節(jié) 實驗動物的選擇和管理毒理學的動物實驗是以實驗動物作為研究對象的，為獲得可靠的研究結(jié)果， 先決條件是正確地選用實驗動物。（一）實驗動物物種的選擇外源化學物的固有毒性往往在人和不同物種實驗動物之間表現(xiàn)不同，物種差 別可以表現(xiàn)在量和質(zhì)的差別。因此，需要對實驗動物物種進行選擇。一般認 為，從動物實驗結(jié)果外推到人，定性外推的可靠性高于定量外推，毒效學預 測優(yōu)于毒動學預測。對實驗動物物種選擇的基本原則是：在代謝、生物化學 和毒理學特征與人最接

17、近的物種；自然壽命不太長的物種；易于飼養(yǎng)和實驗 操作的物種；經(jīng)濟并易于獲得的物種。在選擇實驗動物時存在固有的限制。 可利用的物種不多，主要原因包括經(jīng)濟（購買和飼養(yǎng)的費用）、實驗動物的壽命、 行為和生活能力、處置，也許最重要的是對該物種正常生理和病理的資料， 以及對所研究的毒性的敏感性。要利用對受試物在代謝、生物化學和毒理學 特征與人最接近的物種，這就需要了解實驗動物物種和人對受試化學物的吸 收、生物轉(zhuǎn)化等資料，但這往往并不切合實際，因為首先需要進行一系列的 比較研究，而對人體的資料在動物試驗之前是很難得到的。實際上沒有一種 實驗動物完全符合上述物種選擇的原則，目前常規(guī)選擇物種的方式是利用兩 個

18、物種，一種是嚙齒類，另一種是非嚙齒類。常用實驗動物的生物學和生理 學參數(shù)見表1-1。系統(tǒng)毒性研究最常用的嚙齒類是大鼠和小鼠，非嚙齒類是犬。 豚鼠常用于皮膚刺激試驗和致敏試驗，兔常用于皮膚刺激試驗和眼刺激試驗。 遺傳毒理學試驗多用小鼠，致癌試驗常用大鼠和小鼠，致畸試驗常用大鼠、 小鼠和兔。遲發(fā)性神經(jīng)毒性試驗常用母雞。一般認為，如以與人相同的接觸 方式、大致相同的劑量水平，在兩個物種有毒性反應，則人有可能以相同的 方式發(fā)生毒性反應。當不同物種的毒性反應有很大的差異時，必須研究外源 化學物在不同物種的代謝、動力學及毒作用機制，然后才可將實驗結(jié)果外推 到人。（二）實驗動物品系的選擇品系（strain）

19、是實驗動物學的專用名詞，指用計劃交配的方法，獲得起源于共 同祖先的一群動物。實驗動物按遺傳學控制分類可分為：近交系：指全同胞兄妹或親子之間連 續(xù)交配20代以上而培育的純品系動物。如小鼠有津白工、津白H、615、 DBA/1、DBA/2、BALB/C、C3H、C57B/6J、A 和 A/He 等。雜交群動物（雜 交1代，F(xiàn)）,指兩個不同的近交系之間有目的進行交配，所產(chǎn)生的第一代動 物。封閉群：一個種群在5年以上不從外部引進新血緣，僅由同一品系的 動物在固定場所隨機交配繁殖的動物群。如昆明種小鼠、NIH小鼠、LACA小 鼠、F344大鼠、Wistar大鼠、SD（Sprague-Dauley）大鼠等

20、。根據(jù)實驗動物遺 傳的均一性排序，近交系最高、雜交群次之、封閉群較低。不同品系實驗動 物對外源化學物毒性反應有差別，所以毒理學研究要選擇適宜的品系，對某 種外源化學物毒理系列研究中應固定使用同一品系動物，以求研究結(jié)果的穩(wěn) 定性。表常用實驗動物生物學和生理學益數(shù)參數(shù)然犬滿竟大鼠。、鼠豚R第成估估宜i依1 奇布（年j圮3. 5153.33. 70.5必鳴耳1.0.43310.12京清韓bl用）目連35。32C3CG351美3C-也料消耗成甌區(qū)力1504CCICCISC10iiL2IC成體代遞|1亞SC-SGno13CMC-ICC250體溫也）3S.S犯.938禹的73d.237.-13&634 0

21、呼物惠率霜2C-25H35Ei國9C-331次;ni時詞 C&j(10-3Cj3、3CJ心電晦F曲區(qū)“囚的Mi喃(35-13-ICOL2C-取325MC-3CC明口血壓咂加呼159/1371 四,IOC，ISS/IOC-IIG./SC13C/K，1W75ii； Kic-a-i *梅國11OCk22OCL2aICO我1.而1CC2.0廉乳時體/出切如亞003CXK.:-1C-L225C35開疆伏）M互當天HTZT1010*1211M與當天15妊娠樂j155S3&33121也18性冏期（為25221門H15M&4Y比-194硝F那處17段1T1M3I,1T1YIT忙乳年都

22、珈124昌5Z32三度年齡i月i同10S 7上7232名而物年J*7。4E1131生型季行任何時間保戟2-It月冬季任何時曲1任何時間任何時間任何時的任行時間所需面和陶g53a0.40. i他抬環(huán)境溫度i 口1325152515MWFE國25國25小容量而L*7a75&53函3C-u55凝丸時間於聞L2C-3CC14scH3ECU將紅細胞）42蕓隹42孤羽423C-ilg/ioaiil)12.1S.0ii.a13.fi14.31S.012. 412 0遺傳毒理學一般利用嚙齒類動物，主要是小鼠或大鼠。如果有合適的理由， 其他物種也可接受。在致癌試驗中對大鼠和小鼠常選擇有關(guān)病理損害的自發(fā) 發(fā)生率低

23、的品系。(三)對實驗動物微生物控制的選擇1、實驗動物的選擇按微生物控制分類，實驗動物分為四級，見表1-2。對于 毒性試驗及毒理學研究應使用二級(或二級以上)的動物，以保證實驗結(jié)果的可 靠性。(1)普通動物(conventionalanimal, CVA)：是實驗動物中在微生物控制 上要求最低的動物。飼養(yǎng)在開放系統(tǒng)的動物室內(nèi)?？諝馕磧艋?，飼喂全價顆 粒飼料，可飲自來水。房舍要求有防鼠和防止昆蟲人內(nèi)的設(shè)施。人員進入要 穿工作服，專用鞋帽。(2)悉生動物(gnotobioticanimal，GNA)：又稱清潔動物。 飼養(yǎng)在屏障系統(tǒng)中，空氣要經(jīng)過凈化，飼養(yǎng)室要保持正壓，進入室內(nèi)的一切 物品要經(jīng)過消毒滅

24、菌，工作人員進入要洗澡和穿滅菌工作服，動物飲滅菌水。表一比驗動物微生物等級標推等級軻養(yǎng)環(huán)境要求J較普理動物開放系統(tǒng)電段有隹染冷人的疾病11鰻活生動物界障系統(tǒng)除工較標準外.種系清楚，段有該動物特有的疾病111線無特定病原體幼物屏障或嗣密系魄除11羲標準外，面物為例腹聲或子宮切除產(chǎn)，按波系(SPF)要求繁坦，在雨雷器內(nèi)或?qū)恿魇覂?nèi)飼養(yǎng)，可有不致病給苣叢.沒有致病病原體n耀無花匈物罔璃系統(tǒng)在全封閉無苣條件下飼養(yǎng)的核系動物.而捌體外不帶有任何微生物即寄生蟲包括細大部分病毒無特定病原體動物(specificpathogenfreeanimal，SPF)：飼育在屏障或隔離系統(tǒng)中，是通過無菌動物、悉生動物、S

25、PF動物獲得的?；\具、飼料飲水 要經(jīng)過特殊處理，并有嚴格的檢疫、消毒、隔離制度。無菌動物(germfreeanimal，GFA)：此種動物在自然界中并不存在，是在隔 離器中經(jīng)人工剖宮產(chǎn)取得仔體，用無菌母體代乳或人工哺乳，經(jīng)凈化培育得 到。2.實驗動物設(shè)施的分類開放系統(tǒng)(opensystem)：飼育環(huán)境與外界相同，有強力通風設(shè)施、飼料、 飲水和墊料要求不被污染，應防鼠和防昆蟲措施。屏蔽系統(tǒng)(barriersystem)潔凈度萬級：飼育環(huán)境是密閉的。送人的空氣需 經(jīng)過濾，潔凈度達萬級，飼料、飲水和墊料要需經(jīng)滅菌，飼養(yǎng)人員進入要經(jīng) 過淋浴、穿無菌工作服、戴口罩、手套。隔離系統(tǒng)(isolationsy

26、s_tem)潔凈度百級：是以一個隔離器(isolator)為主體 及其客觀存在附屬裝置組成的飼養(yǎng)系統(tǒng)，送入的全新風要經(jīng)百級以上潔凈度 過濾，一切物品都有要經(jīng)嚴格滅菌后經(jīng)傳遞倉送入，飼養(yǎng)人員不得入內(nèi)。(四)個體選擇實驗動物對外來化學物的毒性反應還存在個體差異，應注意實驗動物的個體 選擇。.性別 同一物種、同一品系的實驗動物雌雄兩性通常對相同外源化學物毒性 反應類似，但雌雄兩性對化學物的毒性敏感性上存在著差別。一般來說，對 于初次試驗的受試物，應該采用兩種性別。如實驗中發(fā)現(xiàn)存在性別差異，則 應將不同性別動物的實驗結(jié)果分別統(tǒng)計分析。如果已知不同性別的動物對受 試物敏感性不同，應選擇敏感的性別。.年齡

27、和體重 毒理學試驗選用實驗動物的年齡取決于試驗的類型。急性試驗 一般選用成年動物；慢性試驗因?qū)嶒炛芷陂L，應選用較年幼的或初斷乳的動 物，以使實驗周期能覆蓋成年期。實驗動物的年齡應由其出生日期來定，但 實際工作中常以動物的體重粗略地判斷動物的年齡，作為挑選適齡動物的依 據(jù)。同一試驗中，組內(nèi)個體間體重差異應小于10，各組間平均體重差異不 應超過5。.生理狀態(tài) 在毒理學試驗中動物如出現(xiàn)妊娠，則影響體重及其他指標的檢測 結(jié)果，并且性激素對外源化學物代謝轉(zhuǎn)化有影響，故應選用未產(chǎn)未孕的雌性 動物。雌雄動物應分籠飼養(yǎng)。但在某些試驗如顯性致死試驗、致畸試驗及繁 殖試驗等，則需有計劃地合籠交配。.健康狀況 實驗

28、動物的健康狀態(tài)對毒理學試驗結(jié)果有很大的影響，因此應選 用健康動物。上述對于實驗動物微生物控制的選擇實際上是選擇健康狀況的 一個重要指標，健康個體的選擇還包括了其他方面。健康動物應發(fā)育正常、 體形健壯、無外觀畸形，被毛濃密、有光澤、順貼而不蓬亂、行動靈活、反 應敏捷、眼睛明亮有神、表皮無潰瘍和結(jié)痂，天然孔道干凈無分泌物等。為確保選擇健康動物，一般在實驗前觀察57天。對于大鼠和犬的亞慢性和 慢性試驗，可在實驗前采血進行血液學和血液生化學檢查，異常的動物應剔 除；對犬應常規(guī)驅(qū)除腸道寄生蟲。（五）實驗動物的管理我國實驗動物的政府管理機構(gòu)是在國家科技部和?。ㄊ校?、自治區(qū)科技廳領(lǐng)導下 的各行業(yè)或系統(tǒng)、各行

29、政區(qū)域、各單位的實驗動物管理委員會。自1988年國 務院批準實驗動物管理條例以來，發(fā)布了多項國家和地方法規(guī)，并制定 了有關(guān)的國家標準，其中強制性國標為GB14922-2001實驗動物微生物學和 寄生蟲學監(jiān)測等級（嚙齒類的兔類）、GBl4923-2001實驗動物哺乳類動物 的遺傳質(zhì)量控制、GB149242001實驗動物全價營養(yǎng)飼料、GB14925-2001 實驗動物環(huán)境及設(shè)施。在毒理學實驗中所用的實驗動物應有動物合格證、 實驗動物生產(chǎn)許可證、飼料合格證、實驗動物使用許可證等。進行動物實驗 的人員應經(jīng)培訓，取得資格認可（上崗證）。對實驗動物的管理應遵循上述的法規(guī)和標準，特別注意：.動物的管理動物的

30、健康、動物的接收、適應、飼養(yǎng)、鑒別和記錄。對所有 實驗動物都須記錄每只或每群動物的來源、處理以及其他有關(guān)資料。.環(huán)境條件的控制 氣候（溫度、濕度、通風、光照），其他條件（噪音、氣味、 墊料、群體密度和空間限制）、飼料、飲水、運動等。.設(shè)施的管理清潔衛(wèi)生、廢棄物處理、害蟲控制、節(jié)假日和突發(fā)事件的管理。第五節(jié)實驗動物的準備（一）動物實驗前的準備實驗動物在購進之后，應雌雄分開飼養(yǎng)。一般應進行57天的檢疫， 在此期間應多次觀察動物，及時剔除不健康的動物。觀察期結(jié)束，將實驗動物按實驗設(shè)計的要求進行標記和分組。實驗動物分組的原則要求所有的動物分配到各劑量組和對照組的機會均等，避免主觀選擇傾 向，減少偏性，

31、以保證結(jié)果的準確可靠。正確的分組方法是隨機分組。 實驗動物按性別、體重順序編號，然后利用統(tǒng)計學的隨機數(shù)字表，按 完全隨機分組法或配伍組隨機分組法，將實驗動物分配到各劑量組和 對照組。然后應計算各組實驗動物體重的均值和標準差，必要時可將 實驗動物適當調(diào)組，以使各組實驗動物體重的均值的差別不超過允許 范圍。常用實驗動物性別鑒別：對小鼠和大鼠，最簡單的方法是看性 器官與肛門的距離。雌鼠的性器官與肛門間距離極短，界限不清。成 年雌鼠有明顯可見的乳頭。雄鼠的性器官與肛門間距離較長，兩者間 有毛。成年雄鼠可見睪丸。家兔：兔呈仰臥位，自尾向前觀察，肛門 位于尾的基部之下，肛門前有一個泄殖孔。成年雄兔可見兩睪

32、丸。而 雌兔在肌門前面有兩個相距極近的孔分別為尿道口和陰道口。成年雌 兔有五對乳頭。（二）實驗動物的抓取和固定方法正確地抓取和固定動物，是為了不損害動物，不影響觀察指標，并防 止被動物咬傷，保證實驗順利進行。抓取固定動物的方法依實驗內(nèi)容 和動物種類而定。抓取固定動物前，必須對各種動物的一般習性有所 了解，抓取固定時既要大膽敏捷，又要小心仔細，不能粗暴。.小鼠的抓取固定方法小鼠的抓取法有兩種：一種是用右手提起尾 部，放在鼠籠蓋或其他粗糙面上，向后上方輕拉，此時小鼠前肢緊緊 抓住粗糙面，迅速用左手拇指和示指捏住小鼠頸背部皮膚并用小指和 手掌尺側(cè)夾持其尾根部固定手中，另一種抓法是只用左手，先用拇指和

33、示指抓住小鼠尾部，再用手掌尺側(cè)及小指夾住尾根，然后用拇指及 示指捏住其頸部皮膚（圖1-1）。小鼠的固定可用固定器方法（圖1-3）。1.5cm2,5c HL圖小最附加時Id r?4汕國J-2大前附排值同足獷口也1H小找門周刊器門立方迂.大鼠的抓取固定方法抓大鼠時若操作不熟練者，最好戴上防護手 套（帆布或硬皮質(zhì)均可）。如是灌胃、腹腔注射、肌肉和皮下注射，可 采用與小鼠相同的手法，即用拇、示指捏住鼠耳頭頸皮膚，余下三指 緊捏住背部皮膚，置于掌心中，調(diào)整大鼠在手中的姿勢后即可操作（圖 1-2）。大鼠的固定可用固定器方法（圖1-4）。大鼠手術(shù)操作應對大鼠進行麻醉和固定。麻醉的大鼠可置于大鼠實驗板上（仰臥

34、位），用橡皮筋固定好四肢（也可用棉線），為防止蘇醒時咬 傷人和便于頸、胸部實驗操作，應用棉線將大鼠兩上門齒固定于實驗 板上。大鼠靜脈注射的固定器見圖1-4。.兔的抓取固定方法兔的抓取 一般以右手抓住兔頸部的毛皮提起，然后左手托其臀部或 腹部，讓其體重重量的大部分集中在左手上（圖 1-5），這樣可避免抓 取過程中的動物損傷。不應采用抓雙耳或抓提胯部的方法。兔的固定 分為盒式、臺式兩種。盒式固定適用于兔耳采血、耳血管 注射等情況；若做血壓測量、呼吸等實驗和手術(shù)時，則需將兔固定在 兔臺上，四肢用粗棉繩活結(jié)綁住，拉直四肢，將繩綁在兔臺四周的固 定木塊上，頭以固定夾固定。（三）實驗動物的編號標記對各種實

35、驗動物的標記方法如下：小鼠：剪趾（胎鼠/新生鼠）、耳打 孔、刺紋、植入；大鼠：剪趾（胎鼠/新生鼠），耳打孔、刺紋、耳標 記、植入；豚鼠：耳打孔、耳標記、刺紋、植入；兔：耳標記、 刺紋、植入：犬和猴：刺紋、項圈、植入。對嚙齒動物或白色家兔 等的標記常用染色法，可用苦味酸（黃色）、品紅（紅色）的酒精飽和溶 液在動物不同部位被毛上染色標記。如給小鼠或大鼠標記110號， 可將小鼠或大鼠從頭頂1號、右前肢2號、右腰3號、右后肢4號、 尾根5號、左后肢6號、左腰?號、左前肢8、背中9號的順序標記 19號，第10號不作標記（圖1-6）。用一種顏色可編46個鼠（189 號，不染色為10號，染兩處按低號計。如3

36、號和4號兩處染色，應 為34，不是43。棄去個位號與十位號重復的號，如無11、22、99號等）。如用紅色表示十位數(shù)黃色表示個位數(shù)，可標出1-99號。由于被毛上顏色會逐步消失，故需重復染色。耳緣孔口標記法見圖1-7。實驗動物分配到各實驗組和對照組必須遵循隨機的原則，以保證實驗 中非處理因素均衡一致。按性別，將動物稱體重、編號，再按體重從 大到小排序，可利用衛(wèi)生統(tǒng)計學中提供的隨機數(shù)字表或隨機排列 表進行隨機分組。限于篇幅，在此不贅述。為日常工作需要，作者自 編了分成4組（3個劑量組和1個陰性對照組）或5組（3個劑量組，陰 性對照組和陽性對照組各1個）的配伍組隨機分組表，見表1-3。配伍 組隨機分組

37、法應按性別，將動物稱體重、編號，再按體重從大到小排 序，以分4組（分別為ABCD）為例，將動物按體重順序4個為1區(qū)組。 在下表分4組列中任指定1行開始，依次標于各配伍區(qū)組的動物編號 下。如第5行，第1區(qū)組4個動物分別分到ACBD,以下區(qū)組則為 DBCA、CABD、BDAC等。各動物據(jù)此分配到4組。分組后，再統(tǒng) 計各組動物體重的均數(shù)，必要時在組間進行調(diào)整。表LT配色組隨機分組表分4殂:SCAD2DKEiACDfl4CHID5ACfiD6DBCA?e血8SUC白CADEltiAllDC二BKB12UliijCli6AK14jlDCBDCli. CUli 131rB ABIC DG1B tDAB 皿

38、口 15cLiA CE11 D?J5C-5 6 7 y O 1 2 S 4 1 11 11229221DEBCAECUlitC?EBD2ECEDAACE15DU EAC13aCULVBJitEBC跖心4ACBDEDC電BC11EA5甌lCCB?JlDAECBD6ECliyDChEllXBE1O?UlitCEEDfiACAEDCEECllE?JiCPEZ13CA1J0ACDE15EEADCDABECItiBDCBADUDjCCEBDA11G1BEB此AEBEACB D12DClitEG.D15EAD1EEGW15EH CAEtAEUE11ABODEEtDABLiEtlLl1315coiAEJUC

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40、A11E CBUBG1ECfiDAEBAECfiED13CAC111BAECU13CAUSEDDAC13CEUSDABE Dj1CBDfiAECfiADECElilCDCj111D1511ECACfibE!CDH1E11UKEADCfiCKU1EADDCDEU3C第六節(jié) 受試物和樣品的準備第七節(jié) 實驗動物染毒途徑和技術(shù)第八節(jié)實驗動物生物標本采集及處死第九節(jié) 毒理學試驗的統(tǒng)計學第十節(jié) 優(yōu)良實驗研究規(guī)范第二章 一般毒性試驗第一節(jié) 急性毒性試驗一、經(jīng)口急性毒性試驗二、經(jīng)呼吸道急性毒性試驗三、經(jīng)皮膚急性毒性試驗第二節(jié) 局部毒性試驗第三節(jié) 蓄積毒性實驗第四節(jié) 亞慢性和慢性毒性實驗一、亞慢性毒性實驗二、慢

41、性毒性試驗第三章特殊毒性試驗第一節(jié)致突變實驗方法一、鼠傷寒沙門菌回復突變試驗二、哺乳動物細胞基因突變試驗三、動物骨髓細胞染色體畸變分析四、小鼠骨髓細胞微核試驗五、單細胞凝膠電泳技術(shù)第二節(jié)致癌試驗一、哺乳動物細胞體外惡性轉(zhuǎn)化試驗（未解決的小節(jié)） 二、哺乳動物短期致癌試驗（未解決的小節(jié)）三、哺乳動物長期致癌試驗（未解決的小節(jié)）第三節(jié)、發(fā)育毒性和致畸作用試驗一、三段生殖毒性試驗（未解決的小節(jié)）二、大鼠體外全胚胎培養(yǎng)試驗（未解決的小節(jié)）第四章 血液毒理學研究方法（未解決的小節(jié)）第一節(jié) 特殊血液學檢測一、網(wǎng)織紅細胞計數(shù)二、紅細胞滲透脆性試驗三、高鐵血紅蛋白含量測定四、變性珠蛋白小體測定（煌焦油藍沉淀法）五、血液細胞的化學染色六、血液細胞的免疫細胞化學