常規(guī)病理組織處理PPT培訓(xùn)課件

1、常規(guī)病理組織處理 組織標(biāo)本離體后，要經(jīng)過固定、脫水、透明、浸蠟和包埋等一系列的后續(xù)處理。組織處理的每一個(gè)步驟都非常重要。因?yàn)闃?biāo)本的取材，部位的選擇等等，都或多或少地會(huì)影響到組織處理的程序、染色的效果以及最終的診斷是否合適組織結(jié)構(gòu)的保存、有效成分的保留，取決于組織處理所使用的試劑和各步驟處理的時(shí)間等因素。為病理診斷提供優(yōu)質(zhì)的切片需要技術(shù)人員在日常的工作中不斷積累熟練的技巧和經(jīng)驗(yàn)。一.固定 病理標(biāo)本的制作和組織處理都必須先進(jìn)行固定。如果固定不佳，制片的其它程序?qū)⒎浅＠щy，可以說沒有很好的固定就沒有很好的HE染色，就會(huì)造成診斷困難，甚至誤診，這足以證明固定的重要性概念：組織離體后，采用某些辦法使其細(xì)

2、胞內(nèi)物質(zhì)盡可能接近其生活狀態(tài)時(shí)的形態(tài)結(jié)構(gòu)和位置的過程。（應(yīng)用各種方法使病理標(biāo)本盡量保持其離體前狀態(tài)的過程）目的：防止組織細(xì)胞自溶和腐敗，保持細(xì)胞內(nèi)成分（蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物或酶類）與原有的結(jié)構(gòu)與生活時(shí)相仿。方法：1.物理學(xué)方法：如低溫冷凍，干冰 （dryice，即固態(tài)無水碳酸）冰凍真空脫水，石蠟滲入法。2.化學(xué)方法：采用各種化學(xué)溶液作固定液，使組織細(xì)胞進(jìn)入固定狀態(tài)。這是國(guó)內(nèi)最常用的方法。注意：1.組織離體及時(shí)固定（大標(biāo)本切開固定）2.組織塊大小適宜（1.51. 50.2厘米為宜）3.合理選擇固定液（免疫組化可以選擇多聚甲醛和中性緩沖甲醛；我病理科大標(biāo)本一般選擇中性緩沖甲醛，它可以兼顧常規(guī)染

3、色和免疫組化。小標(biāo)本選用AAF液）4.固定液的量為組織5倍以上（最少也要沒過組織）5.固定時(shí)間得當(dāng)：大標(biāo)本（6-12H）小標(biāo)本（3-6H），時(shí)間太短，影響組織固定的效果，對(duì)以后一系列的處理都有影響，切片質(zhì)量難以保證。組織長(zhǎng)時(shí)間的固定，福爾馬林會(huì)產(chǎn)生一種酸，影響核的染色。另外，長(zhǎng)時(shí)間的固定往往會(huì)出現(xiàn)福爾馬林色素，尤其是造血器官的標(biāo)本，更應(yīng)注意。固定時(shí)間過長(zhǎng)，可降低抗原的活性，影響組化。微小破碎組織，在包埋操作時(shí)易于識(shí)別操作，組織處理前可浸泡在1%伊紅液中5-10分鐘。伊紅的粉紅色在組織處理時(shí)可以保留，但是在隨后的切片染色中可以洗去不影響正常的染色。常用固定液的介紹和配制 1.10中性緩沖福爾馬林

4、 ：甲醛100ml，無水磷酸氫二鈉（Na2HPO4）13g磷酸二氫鈉（NaH2PO4H2O）4.0g， 蒸餾水900ml特點(diǎn)：滲透力強(qiáng)，收縮小，對(duì)抗原保存較好，此液固定效果比單純10福爾馬林要好。2.AAF液：95乙醇85ml，甲醛（濃）10ml，冰醋酸5ml。特點(diǎn)：此液除有固定作用外，兼有脫水作用，因此，固定后可直接入95乙醇脫水。其他還有很多固定液，不一一介紹，有些液體混合后使用比單獨(dú)使用效果更佳，作用互補(bǔ)，真正達(dá)到固定的目的。二.水洗1.固定后必須水洗（15-30min),流水沖洗最佳，特別是固定時(shí)間長(zhǎng)的組織。2.水洗不徹底后果：福爾馬林色素沉著、脫片、染色不鮮艷、免疫組化標(biāo)記中抗原抗體

5、結(jié)合力減弱等現(xiàn)象三.脫水概念：利用脫水劑將組織內(nèi)的水分置換出來，以利于有機(jī)溶劑的滲入。濃度與時(shí)間：脫水用的乙醇濃度一般從7075開始，然后依次8095100，即由低濃度逐步到高濃度。脫水的時(shí)間與組織大小、厚薄有很大關(guān)系、組織厚大，脫水時(shí)間要長(zhǎng)些；而小薄的組織脫水時(shí)間相對(duì)的可以短些。組織脫水時(shí)間在低濃度乙醇中可以長(zhǎng)些（如7080），而在高濃度乙醇中要短些，這是因?yàn)楦邼舛鹊囊掖紳B透力不強(qiáng)，延長(zhǎng)脫水時(shí)間無益，相反高濃度乙醇易使組織收縮、變脆，致使以后切片和觀察困難。 脫水劑的種類有很多種，如乙醇、丙酮、甲醇、異丙基醇等。丙酮是透明無色易燃液體，易與水、乙醇和大多數(shù)有機(jī)溶液相混合。其脫水快，但滲透差，

6、脫水時(shí)間長(zhǎng)易引起組織扭曲和變形。丙酮用于脫水可以去除組織中的脂肪。另外，堅(jiān)硬的組織也可以置入甘油乙醇混合液中浸泡處理。組織脫水不足的補(bǔ)救 組織脫水不足常影響后繼的透明與浸蠟, 表現(xiàn)為含蠟組織塊發(fā)軟，制成蠟塊后組織塊與周邊石蠟容易發(fā)生脫離，此種蠟塊往往難以切出組織薄片或即使強(qiáng)行切出也會(huì)出現(xiàn)組織擠壓、破碎，影響病理診斷。圖1組織脫水不足所制蠟塊, 切片鏡下觀察, 組織擠壓、破碎, 核染色不清 圖2 補(bǔ)救處理后, 組織平整、無破碎, 核染色清晰把蠟塊放入60度石蠟溶液中,使組織周圍石蠟完全溶解, (1)保持組織塊內(nèi)石蠟成份處于溶融狀態(tài)。同時(shí),在75度水浴槽內(nèi)先后放入盛有30 ml丙酮的A、B 兩組燒

7、杯(50 ml容積),時(shí)間差約為5 min,預(yù)熱丙酮。(2)待A丙酮完全沸時(shí), 放入組織塊, 此時(shí)丙酮內(nèi)逐漸有白色糊狀石蠟沉淀出現(xiàn), 組織塊有液泡冒出。(3)當(dāng)B丙酮完全沸時(shí), 迅速將組織塊從A丙酮換入其中, 處理10 min,此時(shí)丙酮內(nèi)石蠟沉淀明顯減少, 組織塊僅有少量或無液泡冒出。(4)取出組織塊, 立即投入75度石蠟溶液中, 直至組織塊無氣泡冒出, 約15 min。(5)常規(guī)包埋、切片、HE 染色。原理：本法以沸丙酮為介質(zhì)。其原理為: (1) 丙酮和石蠟不相溶，此特性保證了彼此單向置換，即以丙酮為溶液時(shí)，石蠟被置出；以石蠟為溶液時(shí)，丙酮被置出。(2)以75度作為脫蠟與浸蠟的適宜溫度，遠(yuǎn)高

8、于丙酮沸點(diǎn)(56-57)及石蠟溶點(diǎn)(58-60)，能使丙酮與石蠟有效而快速地進(jìn)行單向置換。(3)丙酮作為一種快速脫水劑，目前主要用于快速石蠟切片的制備 ，適宜溫度亦為75度。四. 透明概念：透明是組織經(jīng)脫水后，用能與脫水劑及石蠟混合的試劑，將脫水劑置換出來，使石蠟均勻滲透進(jìn)去，有的透明劑可使組織呈透明狀態(tài)，故稱得。常用的透明劑為二甲苯，但它易使組織收縮、變脆，故透明時(shí)間不宜長(zhǎng)二甲苯還能溶解脂肪，因此我們看到切片中的脂肪細(xì)胞胞漿是空泡狀，是二甲苯脫脂所致。 五. 浸蠟概念：浸蠟是組織經(jīng)透明后，置入熔化的石蠟中浸滲，一般為2-4小時(shí)。浸蠟時(shí)間過短，蠟沒有完全滲入組織中，組織過軟，切片困難；浸蠟時(shí)間

9、過長(zhǎng)，造成組織硬脆，切片也困難）目的：將石蠟均勻浸滲至組織中，使組織的硬度與石蠟的硬度相似，利于切片。浸蠟后的組織用包埋框?qū)⑵浒?。包埋用蠟的熔點(diǎn)要與最后一次浸的石蠟熔點(diǎn)相一致，這樣有利于切片。 浸蠟溫度應(yīng)與石蠟熔點(diǎn)想對(duì)應(yīng)，有條件的話（第一道石蠟可用48-50度熔點(diǎn)的石蠟），第二、三道石蠟用56-58度熔點(diǎn)的石蠟，溫箱溫度不宜高于62度。盡量不要在蠟里帶入二甲苯。 低熔點(diǎn)石蠟通常較柔軟，高熔點(diǎn)石蠟通常比較堅(jiān)硬，耐受切片。六.包埋包埋機(jī)一般由3個(gè)部分組成：自動(dòng)流蠟器、冷臺(tái)以及儲(chǔ)備底座和組織包埋盒的熱槽。石蠟經(jīng)過噴嘴自動(dòng)流入大小合適的包埋底座。組織在包埋底座中排列方向和位置，加蓋塑料包埋盒，形成一

10、個(gè)帶有組織的平行的蠟塊。注意：當(dāng)組織包埋時(shí)，組織的方向?qū)ψC明或顯示組織的形態(tài)是一個(gè)重要的問題。組織的定向或定位不應(yīng)該對(duì)組織切片有影響。錯(cuò)誤的定向可能會(huì)導(dǎo)致所需組織成分的破壞或錯(cuò)誤的診斷。大部分組織是平埋的，組織周邊的包埋介質(zhì)將對(duì)組織起到固定保護(hù)作用。以下組織需要特殊定向包埋：腔性結(jié)構(gòu)如動(dòng)脈、靜脈、脈管需橫切；皮膚、腸道、膽囊、膀胱和其它上皮類活檢組織，應(yīng)從底下開始切片，保證組織的上皮面最后切到，這樣可以減少對(duì)上皮的擠壓，損傷切片；肌肉活檢：橫向和長(zhǎng)縱向切片；多塊碎組織應(yīng)一個(gè)接一個(gè)排列，保證組織結(jié)構(gòu)在包埋時(shí)排列方向上的一致。過夜標(biāo)本處理實(shí)施 對(duì)許多科室來說，過夜處理是相對(duì)常用的一種處理模式。組織

11、固定浸泡于10%福爾馬林或AF液，梯度乙醇、二甲苯或二甲苯的替代物，以及石蠟浸透。使用自動(dòng)組織處理機(jī)制定程序時(shí)應(yīng)考慮影響處理程序的以下諸多因素：即實(shí)驗(yàn)室所需要的結(jié)束時(shí)間；使用的液體是否需要加熱；是否啟用加壓，真空功能；組織標(biāo)本數(shù)量的多少及體積的大小等1.固定4-6H 2.水洗20-30min3.75%乙醇2h4.85%乙醇2h5.95%乙醇6.100%乙醇7.100%乙醇1.5h8.二甲苯30min9.二甲苯30min10.浸蠟30min11.浸蠟1.5h12.浸蠟1.5h組織干燥處理： 組織處理的機(jī)器或設(shè)備發(fā)生故障時(shí)，導(dǎo)致組織在浸蠟之前發(fā)生干燥（干涸），組織可能會(huì)失去正常的形態(tài)，以下糾正處理

12、的方法有助于幫助組織得到可以滿足診斷需要的切片。組織干燥的修復(fù)方法：70%乙醇70ml，甘油30ml，二硫水楊酸鈉1g，組織在該溶液停留數(shù)小時(shí)或過夜。組織處理重新從脫水液開始直至完成。組織切片時(shí)可能有些困難，為防止組織脫片可使用涂膠載玻片。常見問題及處理方法討論：1.跳刀有波浪樣或搓衣板樣改變： 出現(xiàn)跳刀有波浪樣或搓衣板樣改變的現(xiàn)象一般都是由于組織太硬或切片刀不夠鋒利造成的; 也可能是由于切片機(jī)的零件松動(dòng)造成的。因此, 切片前要把切片機(jī)的有關(guān)螺旋擰緊, 沒有擰緊或包埋的蠟塊過硬時(shí)就會(huì)出現(xiàn)跳刀, 形成波浪樣或搓衣板樣改變的現(xiàn)象。同時(shí), 調(diào)整刀鋒與蠟塊的適宜角度, 也可以防止跳刀的現(xiàn)象出現(xiàn)2.切片

13、不全或有刮劃痕跡： 修片時(shí)深度不夠、組織沒有全部暴露于切面; 切片的刮劃痕跡是由于切片刀有缺口或者是包埋的組織有異物（線結(jié)）、鈣化組織、骨組織及包埋石蠟有沙粒造成的。因此, 修片時(shí)保證組織塊全部暴露于切面; 保證切片刀的鋒利沒刀口; 同時(shí)在組織取材時(shí)去除手術(shù)異物和鈣化組織; 骨組織要完全脫鈣。這樣可以保證切片的完整和平整美觀3.組織龜裂或有異物： 組織龜裂是由于烤片時(shí)溫度過高, 切片急速受熱切片過度伸張引起的; 由于展片用的水有異物而污染切片。因此, 攤片池的水要勤換, 防止異物污染; 同時(shí), 切片在空氣中略干燥后烤片, 烤箱溫度為65度為宜, 烤片時(shí)間15-30min為宜。對(duì)于腦組織切片必須

14、待切片完全晾干后才能烤片。（本科室因?yàn)橄瀴K數(shù)多，時(shí)間緊，故有不規(guī)范的地方）4.脫蠟不干凈, 可見片狀或點(diǎn)狀發(fā)白 石蠟切片必須經(jīng)過脫蠟才能染色, 脫蠟的好壞取決切片的溫度和二甲苯的溫度, 烤片時(shí)必須將切片放置溫箱加熱到切片的石蠟融化后立即入二甲苯中脫蠟, 或者將二甲苯稍加熱脫蠟, 這樣可以脫蠟更加完全, 更加徹底, 然后經(jīng)過梯度的泡洗, 把二甲苯洗干凈才能染色, 否則, 由于切片中石蠟或二甲苯的殘留, 染色劑與細(xì)胞不能有效接觸而不著色, 導(dǎo)致切片出現(xiàn)片狀或點(diǎn)狀發(fā)白5.切片過厚, 細(xì)胞核模糊不清; 由于切片刀不夠鋒利或者組織脫水不理想、組織塊冰凍不夠以及切片機(jī)準(zhǔn)確度不高都會(huì)導(dǎo)致組織切片過厚, 切片經(jīng)染色后細(xì)胞重疊, 細(xì)胞核模糊不清, 影響