第10章基因分析的基本策略ppt課件

1、 從上世紀(jì)70年代以來，與DNA、RNA操作相關(guān)的各種分子生物學(xué)技術(shù)不斷開展，到目前曾經(jīng)構(gòu)成了一個(gè)龐大而復(fù)雜的技術(shù)體系?；虿僮饕殉蔀獒t(yī)學(xué)研討的重要手段。簡單地說，基因操作就是一切涉及到DNA、RNA操作的技術(shù)。 本章主要討論如何對基因進(jìn)展定性、定量分析；在隨后的2章里分別引見基因功能研討的技術(shù)和基因工程的有關(guān)內(nèi)容。第十一章 基因分析的根本戰(zhàn)略1、需求進(jìn)展基因的DNA序列分析:序列測定2、基因的染色體上定位：原位雜交技術(shù)3、研討基因在基因組中的拷貝數(shù)：Southern Blot4、研討基因表達(dá)程度：Northern Blot、逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR技術(shù)5、研討基因表達(dá)產(chǎn)物的程度：Western Bl

2、ot、流式細(xì)胞儀 FACS 對一個(gè)知或未知基因的內(nèi)容進(jìn)展研討步驟：第一節(jié) 利用DNA定性、定量分析可從不同角度對基因和基因組進(jìn)展研討一、DNA序列測定可以提示基因和基因組一級構(gòu)造變化DNA測序技術(shù)： 1、雙脫氧鏈終止法(Sanger法) 2、化學(xué)裂解法 3、PCR測序技術(shù) 4、全自動(dòng)DNA測序儀 這些技術(shù)的發(fā)明,都依賴于高分辨率的聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)1968年華裔生物化學(xué)、生物學(xué)家吳瑞博士DrRay Wu 獨(dú)創(chuàng)性地設(shè)計(jì)出一種嶄新的引物一延伸測序戰(zhàn)略，并于1971年初次勝利地測定了噬菌體兩個(gè)COS末端的完好序列；1977，F(xiàn).Sanger在該戰(zhàn)略的根底上，開展出了快速測定DNA序列的末端中止法

3、；K.Mullis采用他的方法，完善了PCR擴(kuò)增DNA的方法；M.Smith發(fā)明了堿基定點(diǎn)突變技術(shù)。這三位科學(xué)家全都獲得了諾貝爾獎(jiǎng)。引物延伸測序戰(zhàn)略Sanger雙脫氧鏈終止法引入了雙脫氧核苷三磷酸2,3-ddNTP作為鏈終止劑。 2,3-ddNTP脫氧核糖的3位短少羥基，它可以與多核苷酸鏈的3羥基構(gòu)成磷酸二酯鍵，但卻不能與下一個(gè)核苷酸縮合，導(dǎo)致多核苷酸鏈的延伸終止。假設(shè)在DNA的合成反響中，參與一種少量的ddNTP，那么多核苷酸鏈的延伸將在隨機(jī)的位點(diǎn)終止，生成一系列長短不一的核苷酸鏈。在4組獨(dú)立的DNA合成反響中，分別參與4種不同的ddNTP，結(jié)果生成的4組核苷酸鏈將分別終止于各個(gè)A，G，C，

4、T的位置上。對這4組核苷酸鏈進(jìn)展高分辨變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，就可讀出序列。雙脫氧測序方法原理反響：同時(shí)參與引物和模板、DNA聚合酶I、一種ddNTP、以及 四種dNTP有一種帶放射性標(biāo)志。變性膠電泳分別反響混合物。放射自顯影術(shù)，檢測單鏈DNA片段的放射性。結(jié)果判讀，從放射性X光底片上，直接讀出DNA的核酸順序。The DNA sequencing method developed by Sanger.根本步驟：1、先將DNA的末端之一標(biāo)志放射性同位素32P、35S；2、再將DNA樣品分別進(jìn)展多組具堿基特異性、隨機(jī)的、不完全的化學(xué)修飾；3、采用修飾堿基敏感的特異化學(xué)試劑在修飾堿基位置斷開DNA

5、鏈；4、經(jīng)過具有可分辨鏈長短僅一個(gè)核苷酸之差的聚丙烯胺凝膠電泳，將DNA斷裂片段按分子大小別分開；5、根據(jù)放射自顯影膠片上顯示的末端標(biāo)志片段分布情況，直接讀出DNA序列?；瘜W(xué)裂解法Maxam-Gilbert 1977反響體系 堿基修飾 堿基修飾 主鏈斷裂 斷裂點(diǎn) 試劑 反響 試劑 G 硫酸二甲酯 鳥嘌呤甲基化 六氫吡啶 GG+A 甲酸 脫嘌呤作用 六氫吡啶 G/AC+T 肼 嘧啶開環(huán) 六氫吡啶 C/TC 肼加鹽 胞嘧啶開環(huán) 六氫吡啶 C在化學(xué)修飾反響中，經(jīng)過控制反響溫度和反響時(shí)間，只需一小部分堿基被修飾，隨后進(jìn)展斷裂反響也是定量。5-GATCACTACTG-35*-GATCACTACTG-35

6、*G5* GATCACTACTG5*G5*GA5*GATCA5*GATCACTA5*GATCACTACTG5*GAT5*GATC5*GATCAC5*GATCACT5*GATCACTAC5*GATCACTACT5*GATC5*GATCAC5*GATCACTACGG+AC+TCG A/G C/T C5*G5*GA5*GAT5*GATC5*GATCAC5*GATCACTAC5*GATCA5*GATCACT5*GATCACTA5*GATCACTAC5*GATCACTACT5* GATCACTACTG硫酸二甲酯甲酸肼肼加鹽DNA自動(dòng)測序儀 上述兩種方法都不順應(yīng)大規(guī)模DNA測定需求。存在操作步驟繁瑣、效率

7、低、速度慢的缺陷，特別是讀結(jié)果的讀片過程。 1987年發(fā)明了一種準(zhǔn)確快速的DNA測序方法，即激光測序法和配套的自動(dòng)測序儀。用熒光染料結(jié)合引物。隨后又發(fā)明了終止標(biāo)志系統(tǒng)法。1、提示基因和基因組一級構(gòu)造變化在醫(yī)學(xué)研討中具有重要意義。2、經(jīng)過DNA序列分析，可以鑒定基因和基因組變異。3、經(jīng)過DNA序列分析，可以鑒定分析人工重組的基因。4、經(jīng)過DNA序列測定對定點(diǎn)突變進(jìn)展確認(rèn)。 DNA序列測定的意義分析基因拷貝數(shù)變化一、Southern blot 檢測基因拷貝數(shù)變化 Southern blot 印跡雜交是指DNA與DNA的雜交，將電泳分別的待測DNA片段轉(zhuǎn)印并結(jié)合到一定的固定支持物上，然后用標(biāo)志的DN

8、A探針檢測待測DNA的一種方法。 1975年英國愛丁堡大學(xué)的Southern建立了該方法， Southern印跡雜交由此得名。Southern blot步驟1待測核酸樣品的制備：提取基因組DNA，并用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化水解基因組DNA，成大小不一的DNA片段。2待測DNA樣品的電泳分別。3凝膠中核酸的變性：DNA在制備與電泳過程中DNA片段一直堅(jiān)持雙鏈構(gòu)造。電泳終了后DNA變性并轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)墓潭ㄖС治锷喜鸥蛇M(jìn)展Southern blot。變性通常用堿變性法。4 Southern 轉(zhuǎn)膜：將凝膠中的DNA進(jìn)展堿變性并將pH恢復(fù)中性后，即可將凝膠中DNA轉(zhuǎn)移到固定支持物上。固定支持物：硝酸纖維素

9、NC膜、尼龍膜、化學(xué)活化膜和濾紙等。轉(zhuǎn)移方法：毛吸管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)印跡法、真空轉(zhuǎn)移法。5知序列的DNA探針的制備6 Southern雜交：在將固定于膜上的DNA片段與探針進(jìn)展雜交前，必需先進(jìn)展一個(gè)預(yù)雜交的過程。由于可以結(jié)合DNA的膜同樣可以和探針DNA結(jié)合，在進(jìn)展雜交實(shí)驗(yàn)前，必需將膜上一切能與DNA結(jié)合的位點(diǎn)全部封鎖。7雜交結(jié)果的檢測：采用核素標(biāo)志的探針或發(fā)光劑標(biāo)志的探針進(jìn)展雜交時(shí)，在雜交洗膜后，將濾膜和X線片裝入暗盒，感光后，經(jīng)沖洗，在X線片上可見黑色條帶。提取DNA限制性內(nèi)切酶消化瓊脂糖凝膠電泳堿變性轉(zhuǎn)移到NC膜與DNA或RNA探針雜交放射自顯影DNA印跡雜交Southern blott

10、ing檢測靶分子為DNA, 檢測靶分子能否含有目的基因1、對某種生物體基因組拷貝數(shù)研討，需求完好提 取出基因組，并需求適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶酶切；2、通常要研討的基因序列是知的。3、探針序列的選擇和探針信號(hào)的選擇。Southern blot 檢測基因拷貝數(shù)本卷須知二、采用PCR技術(shù)也可以分析基因拷貝數(shù)原理： 細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制是一個(gè)復(fù)雜過程。參與復(fù)制的有多種要素。PCR是在試管中進(jìn)展的DNA復(fù)制反響，PCR原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類似，但反響體系相對簡單。PCR反響體系： 耐熱的Taq DNA聚合酶、化學(xué)合成的寡聚核苷酸引物、4種dNTP、以及適宜的緩沖液體系。PCR反響的根本過程：變性、退火、延伸

11、PCR技術(shù)對擴(kuò)增的模板濃度雖然很低，擴(kuò)增產(chǎn)量以一個(gè)恒定的指數(shù)率上升，但經(jīng)過25至30個(gè)循環(huán)，產(chǎn)量會(huì)到達(dá)一個(gè)平臺(tái)期，同時(shí)PCR過程中，還會(huì)出現(xiàn)“試管效應(yīng)，因些對不同樣本量的比較無法直接用PCR技術(shù)來鑒定。 近年來，隨著PCR技術(shù)的不斷改良，如差別顯示PCR和實(shí)時(shí)PCR的發(fā)明，可以用于基因拷貝數(shù)的分析。根據(jù)Poly A序列起點(diǎn)前2個(gè)堿基除AA外只需12種能夠性的特征，設(shè)計(jì)合成了12種下游引物，稱3-錨定引物；同時(shí)為擴(kuò)增出polyA上游500bp以內(nèi)一切能夠性的mRNA序列，在5端又設(shè)計(jì)了20種10bp長的隨機(jī)引物。這樣構(gòu)成的引物對進(jìn)展PCR擴(kuò)增能產(chǎn)生出20000條左右的DNA條帶，其中每一條都代表

12、一種特定mRNA種，這一數(shù)字大體涵蓋了在一定發(fā)育階段某種細(xì)胞類型中所表達(dá)的全部mRNA。 1差別顯示PCR用于基因拷貝數(shù)分析 將差別表達(dá)條帶中的DNA回收，擴(kuò)增至所需含量，進(jìn)展Southern blot或Northern blot或直接測序，從而對差別條帶鑒定分析，以便最終獲得差別表達(dá)的目的基因。差別顯示PCR方法依然存在幾個(gè)難以處理的問題： (1)反復(fù)率低，至少有20%的差別條帶不能被準(zhǔn)確反復(fù)；(2)假陽性率可以高達(dá)90%；(3)獲得的差別表達(dá)序列極少包含編碼信息。2代表性差別分析技術(shù) 該技術(shù)是將差減雜交與PCR有機(jī)結(jié)合構(gòu)成的一種方法.主要步驟:1、將對照組(driver)和待測組(test

13、er)mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA片段群,接上接頭進(jìn)展第一次PCR擴(kuò)增;2、將兩組PCR產(chǎn)物片段群用限制性內(nèi)切酶酶切,構(gòu)成平均長度256bp的長度；3、將接頭消化, 在tester組末端接上新的接頭,tester組和driver組按1:100比例混合，過量的driver可與tester中互補(bǔ)的部分構(gòu)成雙鏈；4、復(fù)性, 按新接頭序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)展第2輪PCR，只需tester和tester雜合體才干和引物配對, 大量擴(kuò)增；實(shí)時(shí)PCR根據(jù)PCR反響動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)設(shè)計(jì)的分析方法。在PCR反響的初始階段，反響體系中的模板的產(chǎn)物濃度較低，而引物是過量的，產(chǎn)物和模板復(fù)性不會(huì)構(gòu)成與引物競爭，此時(shí)產(chǎn)物含量呈指數(shù)添加。

14、當(dāng)PCR產(chǎn)物積累后，產(chǎn)物的復(fù)性可以競爭引物與模板的結(jié)合，產(chǎn)物添加減慢，最后進(jìn)入平臺(tái)期。所以對樣品中的cDNA進(jìn)展定量分析的最正確時(shí)期是反響早期。3實(shí)時(shí)PCR用于基因拷貝數(shù)分析 實(shí)時(shí)PCR原理是：在PCR反響體系中參與一種雙色熒光標(biāo)志的寡核苷酸探針，并根據(jù)探針上熒光信號(hào)的變化計(jì)算模板DNA含量。如：TaqMan系統(tǒng)。在寡核苷酸探針的5端標(biāo)志一個(gè)報(bào)告熒光染料，3端標(biāo)志一個(gè)猝滅染料。當(dāng)光源照射到探針時(shí)，被激活的報(bào)告熒光染料將能量轉(zhuǎn)移給附近的猝滅染料而不發(fā)光。當(dāng)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增時(shí)，聚合酶遇到結(jié)合在模板上的熒光探針時(shí)，利用聚合酶所具有的5-3外切酶作用，將兩種染料分別，因此根據(jù)報(bào)告熒光所發(fā)射的熒光強(qiáng)度與被

15、切探針成正比，由此可以計(jì)算出PCR產(chǎn)物的含量。實(shí)時(shí)PCR技術(shù)特別適宜于低拷貝基因的定量。實(shí)時(shí)PCR需求包括熱循環(huán)儀、計(jì)算機(jī)、光學(xué)儀器用于熒光激發(fā)和搜集器、數(shù)據(jù)處置和分析軟件。ROMA分析基因拷貝數(shù)ROMA代表性寡核苷酸陣列分析：是將RDA與芯片微距陣分析技術(shù)相結(jié)合。利用人類基因組序列預(yù)測并設(shè)計(jì)了能與代表性片段雜交的寡核苷酸探針，制成芯片，然后與RDA挑選出來的代表性差別PCR產(chǎn)物在芯片上進(jìn)展雜交，用計(jì)算機(jī)分析雜交結(jié)果。核酸堅(jiān)持在細(xì)胞或組織切片中，經(jīng)適當(dāng)方法處置細(xì)胞或組織后，將標(biāo)志的核酸探針與細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)展雜交，稱為原位雜交。原位雜交不需求從組織提取核酸，對組織中含量極低的靶序列有很高的

16、靈敏度，并可完好堅(jiān)持組織與細(xì)胞形狀，更能準(zhǔn)確反映出組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能形狀。三、原位雜交技術(shù)可以分析基因在染色體上位置 根據(jù)檢測對象不同可將原位雜交分為細(xì)胞內(nèi)原位雜交和組織切片原位雜交。同時(shí)原位雜交既可檢測DNA，也可檢測RNA，所用探針不同而已。核酸探針根據(jù)標(biāo)志方法的不同可粗略分為放射性探針和非放射性探針兩類。放射性同位素標(biāo)志探針具有放射性既污染環(huán)境，又對人體有害，且受半衰期限制等缺陷，非放射性探針可以用生物素、地高辛 、熒光素標(biāo)志探針。一固定：堅(jiān)持細(xì)胞構(gòu)造，最大限制地堅(jiān)持細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA的程度；使探針易于進(jìn)入細(xì)胞或組織。最常用的固定劑是多聚甲醛，其它的固定劑如戊二醛。二玻片和組織切

17、片的處置：包括玻片處置、細(xì)胞組織切片的處置、降低背景、預(yù)雜交。三雜交：調(diào)整探針的濃度0.55.0ng/l 、探針長度50100個(gè)堿基、雜交的溫度和時(shí)間。根本方法四雜交后處置：包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。五顯示：根據(jù)核酸探針標(biāo)志物的種類分別進(jìn)展放射自顯影或利用酶檢測系統(tǒng)進(jìn)展不同顯色處置。六結(jié)果分析真核生物的RNA包括mRNA、tRNA、rRNA、snRNA、snoRNA、dsRNA、微小RNA等。目前在上述RNA研討中，以mRNA研討最為熱點(diǎn)。它的研討可以提示基因的構(gòu)造、基因的活性、或基因的變異等。mRNA研討常用的方法有Northern blot、原位雜交、實(shí)時(shí)PCR、RNA酶維

18、護(hù)實(shí)驗(yàn)、cDNA芯片技術(shù)和RT-PCR。第二節(jié) 利用RNA定性定量分析可 從不同角度提示基因表達(dá)活性 Northern blot印跡雜交是指待測RNA樣品經(jīng)電泳分別后轉(zhuǎn)移到固定支持物上，然后與標(biāo)志的核酸探針進(jìn)展固-液相雜交。原理同Southern blot。但因Northern blot印跡雜交法檢測的是RNA，在外界環(huán)境中極易被環(huán)境中的RNA酶所降解，因此制備RNA樣品時(shí)，所需器皿均需求特殊處置。同時(shí)作為監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)RNA含量不夠準(zhǔn)確，只能作為定性分析RNA方法。一Northern blot定性分析RNA RT-PCR是一種以mRNA為模板的體外擴(kuò)增cDNA的技術(shù)。其根本程序是：提取細(xì)胞總RN

19、A，然后將其中的mRNA在體外逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板，進(jìn)展特定基因的PCR擴(kuò)增。由于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有平臺(tái)效應(yīng)，故RT-PCR也普通用于RNA的定性分析。將陽性參照基因作為內(nèi)參照與待測RNA在一個(gè)反響體系中進(jìn)展擴(kuò)增，可以對RNA進(jìn)展相對定量分析。參照基因： -肌動(dòng)蛋白-actin、3-磷酸甘油醛脫氫酶、rRNA基因等。二RT-PCR用于定性、定量分析RNA三、RNA酶維護(hù)實(shí)驗(yàn)了解基因轉(zhuǎn)錄后的選擇性剪接RNA酶維護(hù)實(shí)驗(yàn)：可用于mRNA定量、 mRNA末端定位、 mRNA剪切部位確定內(nèi)含子在相應(yīng)基因中的位置。RNA酶維護(hù)實(shí)驗(yàn)：全新的mRNA定量分析方法 其根本原理是將標(biāo)志的特異RNA探

20、針32P或生物素與待測的RNA樣品液相雜交，標(biāo)志的特異RNA探針按堿基互補(bǔ)的原那么與目的基因特異性結(jié)合，構(gòu)成雙鏈RNA；未結(jié)合的單鏈RNA經(jīng)RNA酶A或RNA酶T1消化構(gòu)成寡核糖核酸，而待測目的基因與特異RNA探針結(jié)合后構(gòu)成雙鏈RNA，免受RNA酶的消化，故該方法命名為RNA酶維護(hù)實(shí)驗(yàn)。RPA有Northern Blot無法比較的優(yōu)勢： 1.探針與目的基因的雜交在液相環(huán)境完成，反響更加完全。 2.RPA比Northern Blot靈敏15150倍。3.RPA通量高，同時(shí)檢測多個(gè)基因，可評價(jià)他們在同一情況下的差別表達(dá)。 4.一次RPA就能完成10 多次Northern Blot的任務(wù)，加快研討速度 。監(jiān)測大量基因表達(dá)的最好方法之一是cDNA微陣列技術(shù)，利用這種技術(shù)可以同時(shí)測定成千上萬個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄活性。根本原理：運(yùn)用知核酸序列作為探針與互補(bǔ)的靶核酸序列雜交，經(jīng)過隨后的信號(hào)檢測進(jìn)展定性或定量分析基因的表達(dá)情況。特點(diǎn)：能在同一時(shí)間內(nèi)平行分析大量的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，進(jìn)展大量的信息挑選和檢測分析。三、 cDNA微陣列 cDNA芯片可 同時(shí)分析大量 基因的轉(zhuǎn)錄活性 研討蛋白質(zhì)的技術(shù)普通多采用免疫印記技術(shù)Western blot或免疫組化染色對蛋白質(zhì)進(jìn)展分析。目前在1、研討轉(zhuǎn)基因的活性。2、研討