Gateway講課稿

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。Gateway-Gateway技術(shù)提供以下可能：通過(guò)去除冗長(zhǎng)的亞克隆步驟節(jié)省您的時(shí)間將您的基因轉(zhuǎn)入到多個(gè)表達(dá)系統(tǒng)在任何您選擇的系統(tǒng)體外，細(xì)菌，酵母，昆蟲(chóng)，或哺乳動(dòng)物分析表達(dá)一種更好的克隆方法Gateway技術(shù)能夠克隆一個(gè)或多個(gè)基因進(jìn)入到任何蛋白表達(dá)系統(tǒng)（圖1）。這項(xiàng)強(qiáng)大的體外技術(shù)大大地簡(jiǎn)化了基因克隆和亞克隆的步驟，而同時(shí)典型的克隆效率高達(dá)95或更高。當(dāng)基因在目的表達(dá)載體之間快速簡(jiǎn)便的穿梭時(shí)，還可以保證正確的方向和閱讀框。Gateway也有助于進(jìn)行帶不同數(shù)目純化和檢測(cè)標(biāo)簽的表達(dá)。Gateway利用了位點(diǎn)特

2、異重組，所以在構(gòu)建入門(mén)載體后，不再需要使用限制性內(nèi)切酶和連接酶。一旦您擁有了一個(gè)入門(mén)克隆，就可以多次使用它，轉(zhuǎn)移您感興趣的基因到Gateway改造過(guò)的的各種表達(dá)載體（目的載體）。此外，由于在重組時(shí)DNA片段的閱讀框和方向保持不變，因而您不必再為新的表達(dá)克隆的測(cè)序擔(dān)心。在使用每一種新的表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，將會(huì)節(jié)省您更多的時(shí)間。圖1-Gateway技術(shù)的靈活性*目的基因克隆進(jìn)入門(mén)載體后，可以同時(shí)轉(zhuǎn)移目的基因到多個(gè)目的載體。一種強(qiáng)大而可靠的技術(shù)Gateway技術(shù)是克隆和亞克隆DNA序列的一項(xiàng)新穎的通用系統(tǒng)，便于功能基因的分析和蛋白質(zhì)的表達(dá)。一旦進(jìn)入這個(gè)多功能的操作系統(tǒng)，DNA片段可以通過(guò)位點(diǎn)特異的重組在載體

3、之間轉(zhuǎn)移。Gateway技術(shù)是基于已研究的非常清楚的嗜菌體位點(diǎn)特異重組系統(tǒng)（attBxattPattLxattR）。BP和LR兩個(gè)反應(yīng)就構(gòu)成了Gateway技術(shù)（表1和圖2）。BP反應(yīng)利用一個(gè)attBDNA片段或表達(dá)克隆和一個(gè)attP供體載體之間的重組反應(yīng)，創(chuàng)建一個(gè)入門(mén)克隆。LR反應(yīng)是一個(gè)attL入門(mén)克隆和一個(gè)attR目的載體之間的重組反應(yīng)。LR反應(yīng)用來(lái)在在平行的反應(yīng)中轉(zhuǎn)移目的序列到一個(gè)或更多個(gè)目的載體。Gateway技術(shù)也利用了ccdB選擇方法，確保高效率的分離重組克隆。典型的效率是95。需要了解更多的有關(guān)ccdB的信息，請(qǐng)參考術(shù)語(yǔ)表。表1-反應(yīng)和術(shù)語(yǔ)總結(jié)反應(yīng)反應(yīng)位點(diǎn)產(chǎn)物產(chǎn)物結(jié)構(gòu)BP反應(yīng)at

4、tBxattP入門(mén)克隆attL1-基因-attL2LR反應(yīng)attLxattR表達(dá)克隆attB1-基因-attB2完成構(gòu)建Gateway表達(dá)克隆僅需兩步（圖2）：創(chuàng)建入門(mén)克隆，通過(guò)PCR或傳統(tǒng)的克隆方法將目的基因克隆進(jìn)入門(mén)載體。混合包含目的基因的入門(mén)克隆和合適的目的載體及GatewayLRClonase酶，產(chǎn)生表達(dá)克隆。（表達(dá)克隆用來(lái)在合適的宿主中進(jìn)行蛋白的表達(dá)和分析。）圖2-Gateway技術(shù)總結(jié)在BP反應(yīng)中基因轉(zhuǎn)移形成入門(mén)克隆，在LR反應(yīng)中入門(mén)克隆可以作為反應(yīng)物產(chǎn)生最終的表達(dá)克隆。可以通過(guò)以下幾種方法構(gòu)建Gateway入門(mén)載體。無(wú)論您選擇何種方法，創(chuàng)建的入門(mén)載體都是用來(lái)與各種目的載體進(jìn)行重組

5、。圖3-Gateway定向TOPO克隆PCR克隆（定向TOPO克隆至入門(mén)載體或與供載體BxP重組）限制性內(nèi)切酶消化和連接進(jìn)入入門(mén)載體使用pCMVSPORT6或pEXP-AD502*構(gòu)建Gateway兼容cDNA文庫(kù)Gateway改造過(guò)的克隆資源*(*這些克隆資源和cDNA文庫(kù)兩邊加有attB位點(diǎn)。這些克隆可以通過(guò)與供載體及BPClonase酶反應(yīng)轉(zhuǎn)換到入門(mén)載體。請(qǐng)登錄HYPERLINK/t_blank/獲得已有克隆資源的更多信息。)PCR-定向(PCR-Directional)TOPO克隆定向TOPO克隆使得克隆PCR產(chǎn)物和其它的DNA分子更加快速和有效。進(jìn)行5分鐘的簡(jiǎn)單連接，產(chǎn)生90的重組子

6、。您不僅會(huì)比用連接酶介導(dǎo)的方法更快的獲得克隆，而且可以節(jié)省因第一次無(wú)結(jié)果而重復(fù)試驗(yàn)所額外浪費(fèi)的時(shí)間。定向TOPO克隆提供高效的一步法克隆策略，可以定向克隆平端PCR產(chǎn)物到入門(mén)載體。平端PCR產(chǎn)物定向克隆的效率90，從而簡(jiǎn)化了篩選。同時(shí)不再需要連接酶、PCR后續(xù)步驟或限制性內(nèi)切酶。目前有兩種定向TOPO克隆載體:pENTR/D-TOPO和pENTR/SD/D-TOPO（表2和圖3），它們具有有以下特點(diǎn)：位于PCR產(chǎn)物插入位點(diǎn)兩側(cè)的attL重組位點(diǎn)可以與Gateway目的載體進(jìn)行有效重組通用M13位點(diǎn)便于測(cè)序基于pUC的ori位點(diǎn)提供高產(chǎn)量質(zhì)粒大腸桿菌中卡那霉素（kanamycin）抗性基因篩選表

7、2-兩種pENTR/D-TOPO載體的簡(jiǎn)單比較入門(mén)載體特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)pENTR/D-TOPO無(wú)SD(Shine-Dalgarno)位點(diǎn)真核細(xì)胞中天然、N-或C-端融合；大腸桿菌中N-端融合；如果基因包含有SD序列，可在大腸桿菌中進(jìn)行C-端或天然蛋白表達(dá)pENTR/SD/D-TOPO含SD(Shine-Dalgarno)位點(diǎn)包含基因10和一個(gè)SD序列，可以有效的啟動(dòng)天然蛋白和融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)構(gòu)建入門(mén)載體的各種選擇A限制性內(nèi)切酶消化作為PCR克隆的替代方法，有5種Gateway入門(mén)載體可以使用傳統(tǒng)的限制酶切和連接的方法產(chǎn)生入門(mén)克隆。這些載體配合合適的目的載體，可以用于表達(dá)天然蛋白或帶有N端或C

8、端融合標(biāo)簽的重組蛋白。為了在真核細(xì)胞中有效地翻譯蛋白，所有的5個(gè)Gateway入門(mén)載體提供了Kozak序列。此外，pENTR11提供了SD(Shine-Dalgarno)序列，便于在大腸桿菌中有效的翻譯。BPCR重組克隆重組是從PCR產(chǎn)物創(chuàng)建Gateway入門(mén)克隆的另一種方法。這種方法是通過(guò)合并attB位點(diǎn)到上游和下游引物上，然后共同孵育擴(kuò)增PCR產(chǎn)物和pDONRTM載體(包含attP位點(diǎn))及GatewayBPClonaseTM酶混合物。接著轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌中，您將會(huì)獲得包含目的基因的入門(mén)克隆，同時(shí)目的基因兩側(cè)具有attL重組位點(diǎn)。這個(gè)入門(mén)克隆可以與任何Gateway目的載體進(jìn)行重組（參看圖2）

9、。CGateway改造過(guò)的cDNA文庫(kù)如果您已經(jīng)有了用Gateway兼容載體構(gòu)建的cDNA文庫(kù)，您就可以通過(guò)pDONRTM載體和BPClonaseTM酶混合物進(jìn)行一個(gè)簡(jiǎn)單的重組反應(yīng)，很容易地把單個(gè)克隆轉(zhuǎn)換成Gateway入門(mén)克隆。這樣就不再需要亞克隆和測(cè)序，為您節(jié)約數(shù)小時(shí)的時(shí)間。SuperScriptcDNA文庫(kù)使用pCMVSPORT（登錄獲得更多信息）構(gòu)建，有幾種的人組織來(lái)源可供選擇，這些文庫(kù)有很大一部分是全長(zhǎng)的插入片段，可以完全代表來(lái)源mRNA。如要了解Gateway兼容文庫(kù)的詳細(xì)列表，請(qǐng)登錄/fulllength.D入門(mén)克隆的切入點(diǎn)克隆資源您可以從與10000個(gè)與人類基因相關(guān)的35000

10、個(gè)克隆中進(jìn)行選擇，這些克隆的70以上是全長(zhǎng)序列的。這些克隆來(lái)源于使用特殊的高級(jí)cDNA文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)，oligodT引物，以及SuperScriptTMII反轉(zhuǎn)錄酶所構(gòu)建的文庫(kù)。許多克隆來(lái)源于I.M.A.G.E.協(xié)會(huì)，NCICGAP項(xiàng)目，ResGenTM庫(kù)或UltimateORF庫(kù)。克隆資源因?yàn)橐芽寺〉紾ateway改造過(guò)的載體，所以可以快速地將基因轉(zhuǎn)到各種表達(dá)系統(tǒng)中。圖4-進(jìn)入Gateway系統(tǒng)的各種路線*目前的克隆資源帶有attB位點(diǎn)，需要與pDONR質(zhì)粒重組觸手可及的最高級(jí)表達(dá)系統(tǒng)一旦您構(gòu)建好Gateway入門(mén)克隆，蛋白表達(dá)和分析的大門(mén)就會(huì)向您敞開(kāi)。使用Gateway技術(shù)，您可以進(jìn)入到幾乎

11、是無(wú)數(shù)種的表達(dá)系統(tǒng)。因?yàn)闆](méi)有一個(gè)單一的表達(dá)系統(tǒng)蛋白適合于每一種蛋白，優(yōu)化基因表達(dá)的最好方法是在多個(gè)系統(tǒng)中分析您的蛋白（圖5）。為了擴(kuò)展表達(dá)的選擇，Invitrogen已將Gateway技術(shù)合并到部分最高級(jí)的表達(dá)系統(tǒng)中。無(wú)論您選擇哪個(gè)系統(tǒng)體外，細(xì)菌，酵母，昆蟲(chóng)，或哺乳動(dòng)物都可以獲得Gateway目的載體。此外，你可以很容易地把你自己最喜歡的表達(dá)載體轉(zhuǎn)換成Gateway目的載體。圖5-在Gateway系統(tǒng)表達(dá)全長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框大腸桿菌GUS基因、人類MAP4和Eif-4E基因平行轉(zhuǎn)移進(jìn)目的載體，在Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞(桿狀病毒)或大腸桿菌BL21-SITM菌株表達(dá)天然蛋白、N-端His或N-端GST融合蛋白

12、。在所有的系統(tǒng)中均觀察到GUS良好的表達(dá)，而MAP4只在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)，Eif-4E只在大腸桿菌中表達(dá)。在Hartley,J.L.etal.(2000)GenomeResearch10(11):1788-95可以找到更多的細(xì)節(jié)。表3-Gateway技術(shù)入門(mén)選擇進(jìn)入Gateway使用PCR和BP重組使用限制性內(nèi)切酶和超螺旋載體12535019Gateway和pDONR221PCR克隆系統(tǒng)11813011pENTR1A入門(mén)載體12536017卡那霉素抗性pDONR22111816014pENTR2B入門(mén)載體12213013慶大霉素抗性pDONR20711817012pENTR3C入門(mén)載體使用TOP

13、O克隆11818010pENTR4入門(mén)載體K240020pENTR/D-TOPOCloningKit11819018pENTR11入門(mén)載體K2400480HTPpENTR/D-TOPOCloningKitGateway酶混合物K2400500HTPpENTR/D-TOPOCloningKit11789013GatewayBPClonase酶混合物K242020pENTR/SD/D-TOPOCloningKit11791019GatewayLRClonase酶混合物K2420480HTPpENTR/SD/D-TOPOCloningKit12538013GatewayLRClonasePlus酶混

14、合物K2420500HTPpENTR/SD/D-TOPOCloningKit體外表達(dá)Expresswayinvitro蛋白合成系統(tǒng)簡(jiǎn)化當(dāng)前市場(chǎng)上的體外（無(wú)細(xì)胞）表達(dá)系統(tǒng)。僅需兩小時(shí)，您就可以在一個(gè)反應(yīng)管中獲得高達(dá)50g的表達(dá)蛋白，而無(wú)須傳統(tǒng)細(xì)胞表達(dá)體系的煩瑣和花費(fèi)。僅需加入優(yōu)化構(gòu)建的超螺旋或線性DNA模板到Expressway反應(yīng)管，DNA模板由T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。每一個(gè)反應(yīng)管中包括大腸桿菌（E.coli）抽提物（可以同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯）和強(qiáng)大的ATP能量更新系統(tǒng)（保證連續(xù)高水平活躍蛋白表達(dá)的能量水平要求）。Gateway技術(shù)為進(jìn)行基因功能分析和蛋白表達(dá)提供了廣泛深入的方法。您可以通過(guò)把目的基因轉(zhuǎn)

15、移到優(yōu)化構(gòu)建的體外表達(dá)載體，pEXP1-DEST或pEXP2-DEST（表4）（包括在系統(tǒng)中），然后開(kāi)始體外蛋白合成。pEXP1-DEST或pEXP2-DEST載體中的T7啟動(dòng)子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）(僅pEXP1-DEST)以及T7終止子之間的間隔的序列搭配都為Expressway的蛋白表達(dá)專門(mén)優(yōu)化（圖6），從而用Expressway進(jìn)行蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)移的基因定向、閱讀框正確，并隨時(shí)可以用于表達(dá)。圖6pEXP1-DEST和pEXP2-DEST載體表4-Gateway體外蛋白合成目的載體產(chǎn)品目錄號(hào)組成描述pEXP1-DESTV960-01N-端6xHis,具有EK裂解酶識(shí)別位點(diǎn)的Xpress

16、TM表位體外表達(dá)最佳配置T7啟動(dòng)子產(chǎn)生重組蛋白6xHis提供ProBondTM樹(shù)脂快速純化V5表位提供方便的檢測(cè)表位激酶識(shí)別位點(diǎn)可以進(jìn)行裂解（pEXP1-DEST）pEXP2-DESTV960-02C-端V5-6xHis標(biāo)簽提供方便的檢測(cè)和純化大腸桿菌表達(dá)大腸桿菌提供了幾種有利于重組蛋白生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)，包括容易操作、生長(zhǎng)迅速和培養(yǎng)基要求簡(jiǎn)單。大腸桿菌非常適于表達(dá)用于抗體生產(chǎn)和結(jié)構(gòu)研究的蛋白。目前有很多具有不同啟動(dòng)子的大腸桿菌目的載體（表5），從而為您提供一系列表達(dá)選擇。Gateway目的載體也會(huì)為您提供N端或/和C端融合標(biāo)簽的選擇，從而簡(jiǎn)化表達(dá)蛋白的純化和檢測(cè)。5Gateway大腸桿菌表達(dá)目的載體

17、產(chǎn)品目錄號(hào)組成描述pBAD-DEST49*12283-016araBAD啟動(dòng)子N-端硫氧還蛋白C-端V5-6xHis毒性蛋白嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)節(jié)表達(dá)融合部分提供有效蛋白翻譯和增加可溶性V5表位檢測(cè)6xHis提供ProBond樹(shù)脂快速純化pET-DEST42*12276-010T7/Lac啟動(dòng)子C-端V5-6xHisT7啟動(dòng)子提供高產(chǎn)量的重組蛋白T7啟動(dòng)子下游lacO操縱子序列提供lac抑制子的結(jié)合lac抑制子（lacI）提供大腸桿菌中嚴(yán)謹(jǐn)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)V5表位檢測(cè)6xHis提供ProBond樹(shù)脂快速純化pDEST1411801-016無(wú)標(biāo)簽T7啟動(dòng)子提供高產(chǎn)量的重組蛋白簡(jiǎn)單柱純化（pDEST15和pDEST24

18、）6xHis提供ProBond樹(shù)脂快速純化(pDEST17*)pDEST1511802-014N-端GSTpDEST17*11803-012N-端6xHispDEST2412216-016C-端GST*6xHis標(biāo)簽來(lái)自Qiagen授權(quán)酵母表達(dá)酵母是最簡(jiǎn)單的真核生物之一?；蚪M了解清楚，生長(zhǎng)迅速，并且非常適于大規(guī)模發(fā)酵。由于酵母是真核細(xì)胞，它可以進(jìn)行高等真核細(xì)胞的一些翻譯后修飾，因而可以在廉價(jià)、易于操作的宿主中，為您提供一些哺乳動(dòng)物表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)。Invitrogen的Gateway酵母表達(dá)目的載體（表6）允許您利用酵母表達(dá)的優(yōu)勢(shì)生產(chǎn)目的蛋白。表6-Gateway酵母表達(dá)目的載體載體名稱目錄號(hào)特點(diǎn)

19、優(yōu)點(diǎn)pYES2-DEST5212286-019GAL4啟動(dòng)子C-末端V5-6xHisS.cerevisiae中高水平表達(dá)V5檢測(cè)表位6xHis進(jìn)行快速純化（ProBondresin）在酵母中進(jìn)行功能分析除了在酵母中表達(dá)蛋白，現(xiàn)在用于研究蛋白蛋白相互作用的ProQuest酵母雙雜交系統(tǒng)也是Gateway-改造過(guò)的（表7）。這種雙雜交系統(tǒng)允許您：通過(guò)重組反應(yīng)轉(zhuǎn)移目的基因到bait載體或prey載體使用基于GAL4轉(zhuǎn)錄因子重建系統(tǒng)確定相互作用篩選完整文庫(kù)或單一克隆通過(guò)提供低拷貝數(shù)質(zhì)粒，具有獨(dú)立啟動(dòng)子的三種報(bào)告基因，陽(yáng)性和陰性對(duì)照，及一組擴(kuò)展的酵母對(duì)照菌株降低假陽(yáng)性率?？焖俎D(zhuǎn)移DNA序列進(jìn)其它系統(tǒng)進(jìn)行

20、多種應(yīng)用表7-ProQuest雙雜交系統(tǒng)產(chǎn)品目錄號(hào)組成描述ProQuestTwo-HybridSystemwithGatewayTechnology10835-031系統(tǒng)包括：pEXP-AD502(未酶切)*pDEST32*pDEST22*pDBLeu確定兩個(gè)蛋白之間相互作用的完全酵母系統(tǒng)構(gòu)建cDNA或基因組文庫(kù)，確定與bait蛋白相互作用的蛋白構(gòu)建bait蛋白為第二個(gè)已知目的基因構(gòu)建prey蛋白使用傳統(tǒng)的方法構(gòu)建bait蛋白pEXP-AD502NotI-SalICut12211-017GAL4ADADH啟動(dòng)子進(jìn)行cDNA或基因組文庫(kù)定向克隆的激活結(jié)構(gòu)域融合載體組成型中等強(qiáng)度啟動(dòng)子構(gòu)建cDNA

21、或基因組文庫(kù)，確定與bait蛋白相互作用的蛋白*3個(gè)載體全部是Gateway-改造過(guò)的，而且具有att重組位點(diǎn)。昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)昆蟲(chóng)可以提供重組蛋白高水平、可溶性的表達(dá)。由于昆蟲(chóng)細(xì)胞是較高等的真核細(xì)胞，它可以提供很多哺乳動(dòng)物的翻譯后修飾及懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)。由于桿狀病毒和果蠅表達(dá)系統(tǒng)（DES）的改進(jìn)，蛋白在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)已經(jīng)大大簡(jiǎn)化。InvitrogenGateway昆蟲(chóng)表達(dá)目的載體允許您在您選擇的昆蟲(chóng)系統(tǒng)中生產(chǎn)蛋白，并且獲得您想要的表達(dá)結(jié)果。Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)通過(guò)應(yīng)用與bacmid的體內(nèi)重組，簡(jiǎn)化了桿狀病毒的表達(dá)。這將允許您快速、簡(jiǎn)便地生產(chǎn)可以在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的重組桿狀病毒載

22、體。目前有3種Gateway目的載體可以滿足Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用。這些載體允許裂解病毒系統(tǒng)中多角體(polyhedron)啟動(dòng)子控制下的天然蛋白、6xHis融合蛋白或GST融合蛋白的表達(dá)。果蠅表達(dá)系統(tǒng)（DES）允許在果蠅S2細(xì)胞中進(jìn)行非裂解穩(wěn)定或瞬時(shí)重組蛋白的表達(dá)。DES使用簡(jiǎn)單的載體及直接的轉(zhuǎn)染方法，然而卻生產(chǎn)高水平的重組蛋白。最早自轉(zhuǎn)染后兩天就能夠觀察到瞬時(shí)表達(dá)，而僅僅兩周就可以建立穩(wěn)定的多克隆細(xì)胞系。我們提供的產(chǎn)品正在不斷的擴(kuò)展。如需要廣泛的信息資源，請(qǐng)聯(lián)系技術(shù)服務(wù)或登錄HYPERLINK/gatewayt_blank/gateway表8-Gateway目的載體載體

23、名稱目錄號(hào)特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)桿狀病毒pDEST811804-010polyhedrin啟動(dòng)子,無(wú)標(biāo)簽（天然蛋白）Bac-to-Bac系統(tǒng)高水平表達(dá)快速、容易生產(chǎn)重組桿狀病毒ProBond樹(shù)脂快速純化（pDEST10*）簡(jiǎn)單的柱純化（pDEST20*）pDEST10*11806-015polyhedrin啟動(dòng)子,N-端6xHispDEST20*11807-013polyhedrin啟動(dòng)子,N-端GST穩(wěn)定昆蟲(chóng)表達(dá)pMT-DEST4812282-018金屬硫蛋白啟動(dòng)子C-端V5-6xHisDES系統(tǒng)金屬誘導(dǎo)的高水平表達(dá)V5表位檢測(cè)融合蛋白6xHis提供ProBond樹(shù)脂快速純化質(zhì)粒-基礎(chǔ)的系統(tǒng)提供昆蟲(chóng)細(xì)胞中

24、異源蛋白的表達(dá)pIB/V5-His-DEST12250-018OpIE2啟動(dòng)子GP64啟動(dòng)子C-端V5-6xHis與兩側(cè)加有attL位點(diǎn)的Gateway入門(mén)載體有效重組快速篩選穩(wěn)定細(xì)胞系目的基因組成性表達(dá)表達(dá)bsd抗性基因6xHis標(biāo)簽來(lái)自Qiagen授權(quán)。哺乳動(dòng)物表達(dá)哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)通常用來(lái)生產(chǎn)較高等的真核細(xì)胞蛋白。由于轉(zhuǎn)錄、mRNA加工和翻譯的信號(hào)是保守的，因而哺乳動(dòng)物細(xì)胞一般會(huì)產(chǎn)生正確加工的、有活性的蛋白。哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)是生產(chǎn)天然蛋白的理想表達(dá)系統(tǒng)，這些天然蛋白可以用于功能的研究和應(yīng)用。許多Invitrogen高級(jí)哺乳動(dòng)物載體已經(jīng)被改造，以使用Gateway技術(shù)（表9）。可以得到高水平

25、誘導(dǎo)和組成表達(dá)Gateway目的載體。這些載體提供各種N-或C-端融合標(biāo)簽，從而對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行方便和可靠的檢測(cè)和純化。表9-Gateway哺乳動(dòng)物目的載體載體名稱目錄號(hào)特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞調(diào)控表達(dá)pT-REx-DEST3012301-016CMV啟動(dòng)子,無(wú)標(biāo)簽（天然蛋白）CMV/TetO2啟動(dòng)子進(jìn)行四環(huán)素調(diào)控表達(dá)最高水平的誘導(dǎo)表達(dá)6xHis提供ProBond樹(shù)脂快速純化（pT-REx-DEST31*）pT-REx-DEST31*12302-014CMV啟動(dòng)子,N-端6xHis哺乳動(dòng)物細(xì)胞組成表達(dá)pDEST26*11809-019CMV啟動(dòng)子,N-端6xHispDEST2711812-013CM

26、V啟動(dòng)子,N-端GSTpcDNA-DEST40*12274-015CMV啟動(dòng)子,C-端V5-6xHisCMV啟動(dòng)子高水平組成型表達(dá)選擇標(biāo)簽進(jìn)行檢測(cè)、純化或用做報(bào)告子pcDNA-DEST4712281-010CMV啟動(dòng)子,C-端GFPpcDNA-DEST5312288-015CMV啟動(dòng)子,N-端GFPpcDNA3.1/nV5-DEST*12290-010pcDNA3.2-DEST12489-019pcDNAv6.2-DEST*12489-027pDEST12.211808-011CMV啟動(dòng)子,無(wú)標(biāo)簽（天然蛋白）pEF-DEST51*12285-011EF-啟動(dòng)子,C-端V5-6xHis來(lái)自于非病

27、毒啟動(dòng)子的高水平組成性表達(dá)V5表位簡(jiǎn)化融合蛋白檢測(cè)6xHis提供ProBond樹(shù)脂快速純化病毒表達(dá)pAD/CMV/V5-DESTV493-20CMV啟動(dòng)子Virapower腺病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行高水平瞬時(shí)表達(dá)可以選擇CMV或您自己的啟動(dòng)子選擇標(biāo)簽進(jìn)行檢測(cè)、純化或用做報(bào)告子pAD/pl-DESTV494-20無(wú)啟動(dòng)子PLenti6/V5-DESTV496-10CMV啟動(dòng)子Virapower慢病毒表達(dá)系統(tǒng)CMV啟動(dòng)子提供高水平表達(dá)V5表位簡(jiǎn)化融合蛋白檢測(cè)cDNA文庫(kù)構(gòu)建載體pCMVSPORT6Not-Salcut*12209-011CMV啟動(dòng)子cDNA定向克隆產(chǎn)生Gateway-兼容文庫(kù)*6xHis標(biāo)

28、簽來(lái)自Qiagen授權(quán)。*pCMVSPORT6包含attB位點(diǎn)，而且可以用限制性內(nèi)切酶和連接酶進(jìn)行傳統(tǒng)的克隆。使您的最喜歡的載體與Gateway兼容Gateway技術(shù)具有非常大的靈活性，它允許您把您最喜歡的載體作為目的載體。您可以使用Gateway轉(zhuǎn)換系統(tǒng)（圖6），很容易地把任何載體變成Gateway兼容載體。僅僅需要在您的載體的平末端限制性酶切位點(diǎn)插入一個(gè)包含attR重組位點(diǎn)的盒（cassette），用氯霉素抗性篩選轉(zhuǎn)換子。目前有三種平末端的盒，可以將任何表達(dá)載體轉(zhuǎn)化成目的載體，每個(gè)盒在5端含有attR1位點(diǎn)，后面帶氯霉素抗性基因(Cmr)和ccdB基因。attR2位點(diǎn)的盒的3端，每個(gè)盒在三

29、個(gè)可能的開(kāi)放閱讀框中的一個(gè)框架中連接N端和C端的融合蛋白。圖7-Gateway載體轉(zhuǎn)換盒產(chǎn)品名稱目錄號(hào)規(guī)格GatewayVectorConversionSystem11828-01920rxn克隆多個(gè)片段的前所未有的靈活性從以往來(lái)看，克隆多個(gè)片段到一個(gè)載體上一直是一個(gè)煩瑣和耗時(shí)的過(guò)程?？梢允褂玫南拗菩詢?nèi)切酶位點(diǎn)的局限和一次構(gòu)建只能有一個(gè)的結(jié)果限制了成功?，F(xiàn)在，多位點(diǎn)Gateway技術(shù)（MultiSiteGatewayTechnology）為您提供這種靈活性，可以使用不同的重組反應(yīng)組裝片段，同時(shí)利用重組克隆的優(yōu)勢(shì)，確保準(zhǔn)確、有效和定向的組裝。使用多位點(diǎn)Gateway技術(shù)：篩選來(lái)自不同啟動(dòng)子的表達(dá)

30、添加啟動(dòng)子/標(biāo)簽元件到當(dāng)前的Gateway入門(mén)克隆轉(zhuǎn)換編碼蛋白結(jié)構(gòu)域構(gòu)建生物學(xué)或生物化學(xué)途徑多位點(diǎn)Gateway載體構(gòu)建試劑盒（MultiSiteGatewayvectorconstructionkit）可以用于3個(gè)片段的克隆方案。當(dāng)您希望將不同的5和3片段添加到開(kāi)放閱讀框或基因從而獲得多重功能時(shí)，使用這個(gè)試劑盒組裝多個(gè)表達(dá)克隆（圖8）。多位點(diǎn)Gateway技術(shù)使得復(fù)雜的克隆方案變得更加簡(jiǎn)單和有效。圖8-多位點(diǎn)Gateway技術(shù)前所未有的靈活性產(chǎn)品名稱目錄號(hào)規(guī)格MultiSiteGatewayThree-fragmentVector12537-02320rxn實(shí)驗(yàn)室定制服務(wù)為了節(jié)省您在進(jìn)行Ga

31、teway克隆時(shí)的時(shí)間和精力，Invitrogen提供廣泛的定制服務(wù)。如果您打算使用定向TOPO克隆或重組的方法來(lái)克隆您的目的基因，Invitrogen可以為您合成PCR引物。我們可以幫助您設(shè)計(jì)準(zhǔn)確克隆和重組的引物，同時(shí)能保持基因的閱讀框。引物通過(guò)ParallelArraySynthesis技術(shù)合成，并且可以以兩種形式獲得2ml離心管凍干形式或進(jìn)行自動(dòng)操作的96-孔的凍干形式。需要更多細(xì)節(jié)請(qǐng)登錄HYPERLINK/other/link/Custom.htmt_blank/訂制服務(wù)。除了引物合成以外，Invitrogen提供還提供多種分子生物學(xué)服務(wù)，從而節(jié)省您寶貴的時(shí)間、精力和資源。利用我們訓(xùn)練

32、有素的科學(xué)家完成您的全部或部分項(xiàng)目，這樣將會(huì)增加您的能力和減少周轉(zhuǎn)時(shí)間。我們提供的一些服務(wù)包括：定制Gateway兼容表達(dá)載體PCR優(yōu)化、擴(kuò)增和克隆Gateway入門(mén)克隆重組進(jìn)入任何數(shù)量的Gateway目的載體具有高同量克隆能力的TOPO克隆測(cè)序表達(dá)的檢測(cè)和蛋白的生產(chǎn)Gateway開(kāi)放共享的系統(tǒng)購(gòu)買(mǎi)克隆技術(shù)產(chǎn)品（例如，TOPOcloning，TOPOTAcloning，TAcloning，TOPOTools，DrectionalTOPOcloning，ZeroBackground，GatewaycloningSystems和EchocloningSystems）就可以獲得如下的有限授權(quán)：您可以

33、根據(jù)隨產(chǎn)品的有限標(biāo)簽授權(quán)協(xié)議中所闡述的條款獲得使用產(chǎn)品的知識(shí)產(chǎn)權(quán)?？寺〖夹g(shù)產(chǎn)品和它們的使用是U.S.專利No.5,888,732；6,143,557；6,171,861；5,766,891；5,487,993；5,827,657；5,910,438；6,180,407；5,851,808；6,270,969和/或其它未定的U.S和外國(guó)專利的主體，它們被Invitrogen公司擁有和授權(quán)。使用這些產(chǎn)品要求Invitrogen公司許可。購(gòu)買(mǎi)這些產(chǎn)品可以獲得一些有限的不可以轉(zhuǎn)讓的權(quán)利。購(gòu)買(mǎi)這些產(chǎn)品的價(jià)格包括有限和不可以轉(zhuǎn)讓的權(quán)利，只能單獨(dú)使用所購(gòu)量的產(chǎn)品進(jìn)行內(nèi)部研究。Invitrogen保留其它所有

34、權(quán)利，產(chǎn)品購(gòu)買(mǎi)者不可以轉(zhuǎn)讓和出售所購(gòu)產(chǎn)品或成分或衍生物到第三方，產(chǎn)品購(gòu)買(mǎi)者無(wú)權(quán)對(duì)產(chǎn)品或組分或衍生物進(jìn)行所限定的商業(yè)目的使用。商業(yè)目的意味著某一團(tuán)體獲利的任何活動(dòng)。這些活動(dòng)包括，但并不限于：在生產(chǎn)中使用產(chǎn)品或組分或衍生物。使用產(chǎn)品或組分或衍生物提供服務(wù)、信息或數(shù)據(jù)。使用產(chǎn)品或組分或衍生物用于診斷目的。轉(zhuǎn)讓或出售通過(guò)產(chǎn)品或產(chǎn)品的組分或衍生物所制備的載體、克隆和文庫(kù)，或再一次出售產(chǎn)品或它的組分或衍生物，無(wú)論這一產(chǎn)品或它的組分或衍生物被再一次出售是否用于研究。術(shù)語(yǔ)表attL,attR,atttB，andattPGateway技術(shù)中使用的來(lái)源于嗜菌體重組位點(diǎn)。在LRClonase酶混合物介導(dǎo)的反應(yīng)中，attL總是與attR重組，LR反應(yīng)是入門(mén)克隆x目的載體反應(yīng)的基礎(chǔ)。attL和attR位點(diǎn)重組反應(yīng)后，在產(chǎn)物質(zhì)粒上形成attB和attP位點(diǎn)。在BPClonase酶混合物介導(dǎo)的反應(yīng)中，attB總是與attP重組，BP反應(yīng)是PCR克隆載體（pDONRTM）與包含有attB位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物、克隆資源或cDNA文庫(kù)克隆之間反應(yīng)