第六章.重組DNA技術(shù)課件

1、第6章重組DNA技術(shù)及其應(yīng)用.1一、重組DNA技術(shù)概述1.重組DNA技術(shù)的相關(guān)概念克隆: 作名詞時(shí)指含有某目的DNA片段的重組DNA分子或含有該重組分子的無性繁殖系。 作動(dòng)詞時(shí)是指基因的分離與重組過程。重組DNA技術(shù)是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達(dá)出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序，也稱為分子克隆技術(shù)。因此，供體、受體、載體是重組DNA技術(shù)的三大基本元件。.2一、重組DNA技術(shù)概述2.重組DNA技術(shù)的基礎(chǔ)DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)、遺傳信息傳遞的中心法則、遺傳密碼，為基因工程奠定了理論基礎(chǔ) 酶學(xué)、細(xì)菌學(xué)、病毒學(xué)的

2、發(fā)展，為基因工程提供了必要的工具 兩項(xiàng)關(guān)鍵性技術(shù)（DNA的體外切割與連接技術(shù)；DNA的核酸序列分析技術(shù)）的問世，從根本上解決了DNA的結(jié)構(gòu)分析問題.3二、重組DNA技術(shù)的基本步驟（1）獲得目的基因（2）與克隆載體連接，形成新的重組DNA分子（3）用重組DNA分子轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，并能在受體細(xì)胞中復(fù)制和遺傳（4）對(duì)轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定（5）對(duì)獲得外源基因的細(xì)胞或生物體通過培養(yǎng)，獲得所需的遺傳性狀或表達(dá)出所需要的產(chǎn)物.4.5二、重組DNA技術(shù)的基本步驟1. 目的基因的獲取已知基因的獲取： PCR、化學(xué)合成法未知基因的獲?。?基因文庫分離法、直接分離法.6PCR：polymerase chain react

3、ion，在體外模擬細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的DNA復(fù)制過程二、重組DNA技術(shù)的基本步驟1. 目的基因的獲取 之 PCR法（1）變性（denaturation）：模板DNA經(jīng)熱變性，雙鏈被解開，成為兩條單鏈。（2）退火（annealing）：溫度下降，變性DNA復(fù)性，使寡核苷酸引物即與模板DNA中所要擴(kuò)增序列兩端的堿基配對(duì)。（3）延伸（extension）： 在適宜條件下（包括DNA聚合酶和核苷酸單體），引物3 端向前延伸，合成與模板堿基序列完全互補(bǔ)的DNA鏈。.7PCR的基本原理1234522557294時(shí)間（min）溫度（）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上

4、DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95.8PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)9550引物1引物2DNA引物.9PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶.10PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72第1輪結(jié)束95第2輪開始.11PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)955072TaqTaqTaqTaq.12PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72第2輪結(jié)束.13PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)重復(fù)30輪后23

5、0=1,073,741,824模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增理想拷貝數(shù)=2n n 循環(huán)次數(shù)實(shí)際拷貝數(shù)=(1+x)n X 平均效率,約為0.85 n 循環(huán)次數(shù) .14二、重組DNA技術(shù)的基本步驟1. 目的基因的獲取 之 PCR法特點(diǎn)：靈敏度高；簡便、快速；對(duì)標(biāo)本的純度要求低；需要知道目的基因的全部序列或兩端序列。PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性由一對(duì)上下游引物所決定，引物的好壞往往是PCR成敗的關(guān)鍵。.15二、重組DNA技術(shù)的基本步驟2. 目的基因的獲取 之 基因文庫分離法 基因文庫：又稱DNA文庫，是指某個(gè)生物的基因組DNA或cDNA片段與適當(dāng)?shù)妮d體在體外重組后，

6、轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并通過一定的選擇機(jī)制篩選后得到大量的陽性菌落(或噬菌體)，所有菌落或噬菌體的集合即為該生物的基因文庫。 根據(jù)構(gòu)建方法或材料來源的不同，基因文庫分為：基因組文庫（含有全部基因）cDNA文庫（含有全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因） .16二、重組DNA技術(shù)的基本步驟2. 目的基因的獲取 之 基因文庫分離法基因文庫的構(gòu)建.17二、重組DNA技術(shù)的基本步驟2. 目的基因的獲取 之 基因文庫分離法基因特異性：常來自結(jié)構(gòu)基因，因此僅代表某種生物的一小部分遺傳信息，且只代表那些正在表達(dá)的基因的遺傳信息時(shí)空特異性：不同代謝階段（或發(fā)育階段）的基因表達(dá)譜不相同；不同器官或組織中基因的表達(dá)也不相同不均勻性：

7、在同一個(gè)cDNA文庫中，不同類型的cDNA分子的數(shù)目是大不相同的各cDNA均可獲得表達(dá)：一般選用的載體都是表達(dá)型的cDNA文庫的特點(diǎn)：.18相對(duì)于cDNA文庫，基因組文庫的優(yōu)點(diǎn)：cDNA克隆只能反映著mRNA的分子結(jié)構(gòu)，沒有包括基因組的間隔序列；cDNA文庫中，不同克隆的分布狀態(tài)總是反映著mRNA的分布狀態(tài)，即：高豐度mRNA的cDNA克隆，分離基因容易；低豐度mRNA的cDNA克隆，分離基因困難；從cDNA克隆中，不能克隆到基因組DNA 中的非轉(zhuǎn)錄區(qū)段序列，不能用于研究基因編碼區(qū)外側(cè)調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)與功能。2. 目的基因的獲取 之 基因文庫分離法二、重組DNA技術(shù)的基本步驟.19從基因文庫中篩

8、選目的基因密集鋪板雜交挖取鋪板鋪板目的重組克隆探針雜交、PCR檢測(cè)、酶切檢測(cè)等方法二、重組DNA技術(shù)的基本步驟.20二、重組DNA技術(shù)的基本步驟2. 重組DNA中的常用載體載體：vector，可供外源DNA插入并攜帶重組DNA分子進(jìn)入適當(dāng)宿主細(xì)胞的DNA分子。具有針對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn) 具有較高的外源DNA的載裝能力 具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn) 具有合適的篩選標(biāo)記安全，不含有有害基因.21二、重組DNA技術(shù)的基本步驟2. 重組DNA中的常用載體克隆載體轉(zhuǎn)錄載體表達(dá)載體原核載體真核載體穿梭載體質(zhì)粒、噬菌體載體、噬菌粒、黏粒、

9、人工染色體載體等.22二、重組DNA技術(shù)的基本步驟2. 重組DNA中的常用載體質(zhì)粒.23二、重組DNA技術(shù)的基本步驟2. 重組DNA中的常用載體質(zhì)粒（克?。?24二、重組DNA技術(shù)的基本步驟2. 重組DNA中的常用載體質(zhì)粒（表達(dá)）.25二、重組DNA技術(shù)的基本步驟2. 重組DNA中的常用載體質(zhì)粒（穿梭、表達(dá)）.26二、重組DNA技術(shù)的基本步驟3. 目的基因與載體的酶切和連接1）限制酶由細(xì)菌產(chǎn)生、能夠識(shí)別并切割雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列的核酸內(nèi)切酶。識(shí)別序列：多為4-8bp的回文序列切割產(chǎn)生的末端：粘性末端 平末端5突出3突出.27二、重組DNA技術(shù)的基本步驟3. 目的基因與載體的酶切和連接

10、1）限制酶同裂酶：來源不同，識(shí)別序列相同。 切割方式有同識(shí)同切、同識(shí)異切GGATCCCCTAGGBamH與 Bst IGGTACCCCATGGGGTACCCCATGGKpnAsp718.28二、重組DNA技術(shù)的基本步驟3. 目的基因與載體的酶切和連接1）限制酶同尾酶：來源不同，識(shí)別序列不同，但形成的粘性末端相同。Bam HBgl GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A.29二、重組DNA技術(shù)的基本步驟3. 目的基因與載體的酶切和連接2）連接酶催化兩個(gè)DNA分子間磷酸二酯鍵的形成。DNA 連接酶.30二、重組DNA技術(shù)的基

11、本步驟3. 目的基因與載體的酶切和連接2）連接酶.31二、重組DNA技術(shù)的基本步驟3. 目的基因與載體的酶切和連接2）連接酶類型：大腸桿菌 DNA 連接酶：黏端連接效率高，平端連接效率極低。T4 DNA 連接酶：既可連接黏端，也可連接平端，但后者連接效率低很多。.32二、重組DNA技術(shù)的基本步驟3. 目的基因與載體的酶切和連接3）連接方式 之 粘末端相連 BamH IEcoR IBamH IEcoR IDNA ligase.33二、重組DNA技術(shù)的基本步驟3. 目的基因與載體的酶切和連接3）連接方式之 粘末端相連 EcoR IEcoR IEcoR IEcoR IDNA ligase.34二、重

12、組DNA技術(shù)的基本步驟3. 目的基因與載體的酶切和連接3）連接方式之 平末端相連 過程與單一酶切的兩個(gè)片段的連接相同，但只能用T4 DNA ligase 對(duì)于一個(gè)片段是粘末端，另一個(gè)片段是平末端的連接，先將粘末端進(jìn)行末端修飾（用Klenow 聚合酶或者T4 DNA 聚合酶平端化）后再行連接.35二、重組DNA技術(shù)的基本步驟3. 目的基因與載體的酶切和連接4）連接條件溫度與時(shí)間：16，12-16小時(shí) 4 ，24-48小時(shí)片段與載體比例：粘末端約為3:1， 平末端適當(dāng)提高，可至10:1 .36二、重組DNA技術(shù)的基本步驟4. 重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞1）受體對(duì)載體的復(fù)制和擴(kuò)增沒有嚴(yán)格的限制不存在

13、特異的內(nèi)切酶體系降解外源DNA重組缺陷型，不會(huì)產(chǎn)生體內(nèi)重組容易導(dǎo)入重組DNA分子符合重組DNA操作的安全標(biāo)準(zhǔn)分 原核受體、真核受體.37二、重組DNA技術(shù)的基本步驟4. 重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞2）導(dǎo)入方法 之 原核生物CaCl2法：Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙。 電穿孔法：瞬時(shí)高壓擊穿細(xì)胞膜，形成微孔，外源DNA進(jìn)入細(xì)胞。切斷電場(chǎng)后，微孔可自行復(fù)原。.38二、重組DNA技術(shù)的基本步驟4. 重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞2）導(dǎo)入方法 之 真核生物酵母：醋酸鋰法植物：農(nóng)桿菌介導(dǎo)法動(dòng)物：脂質(zhì)體法、磷酸鈣共沉淀法、顯微注射法等.39二、重組DN

14、A技術(shù)的基本步驟5. 重組子的篩選與鑒定轉(zhuǎn)化子就是摻入或?qū)胪庠碊NA后獲得了新的遺傳標(biāo)志的細(xì)菌細(xì)胞或其他受體細(xì)胞。陽性克隆子或目的重組子（ positive clone ）：含有目的基因的重組子。.40二、重組DNA技術(shù)的基本步驟5. 重組子的篩選與鑒定1)抗藥性篩選: 這是利用載體DNA分子上的抗藥性選擇標(biāo)記進(jìn)行的篩選方法。.41 2)插入失活篩選法 經(jīng)過上述抗藥性篩選獲得的大量轉(zhuǎn)化子中既包括需要的重組子，也含有不需要的非重組子。為了進(jìn)一步篩選出重組子，可利用質(zhì)粒載體的雙抗藥性進(jìn)行再次篩選。 二、重組DNA技術(shù)的基本步驟5. 重組子的篩選與鑒定.42二、重組DNA技術(shù)的基本步驟5. 重組子

15、的篩選與鑒定3)顯色反應(yīng)選擇法(-互補(bǔ)法) 將含有-半乳糖苷酶基因（LacZ）的調(diào)控序列和氨基端（N端）146個(gè)氨基酸編碼序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至可編碼-半乳糖苷酶羧基端（C端）部分序列的宿主細(xì)胞中，可使各自無活性的片段實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)，產(chǎn)生具有酶學(xué)活性的蛋白，從而使轉(zhuǎn)化的宿主菌在含有IPTG/X-gal的培養(yǎng)基上產(chǎn)生藍(lán)色菌落，這種現(xiàn)象就稱為-互補(bǔ)。.43顯色反應(yīng)選擇法(-互補(bǔ)法).44 4)限制性核酸內(nèi)切酶分析 當(dāng)載體與外源基因進(jìn)行連接時(shí)，都需要對(duì)其進(jìn)行酶切，而且這些內(nèi)切酶都是已知的，因此可以從初步篩選出來的陽性重組菌中提取質(zhì)粒DNA，然后用已知的內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，如果出現(xiàn)與預(yù)知的大

16、小一致的電泳片段，就證明已經(jīng)有目的基因插入到載體中。二、重組DNA技術(shù)的基本步驟5. 重組子的篩選與鑒定.451.空質(zhì)粒（線性化）2.重組質(zhì)粒（線性化）3.重組質(zhì)粒（雙酶切）4.目的片段（PCR產(chǎn)物） M 1 2 3 4 二、重組DNA技術(shù)的基本步驟5. 重組子的篩選與鑒定M 1 2M.DNA Marker；1.重組質(zhì)粒（雙酶切）2.重組質(zhì)粒（線性化）.46二、重組DNA技術(shù)的基本步驟5. 重組子的篩選與鑒定 5)Southern Blotting 將轉(zhuǎn)化細(xì)胞的DNA經(jīng)過酶切后，瓊脂糖凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或尼龍膜上； 用目的基因的標(biāo)記探針同固定在膜上的DNA片段雜交，經(jīng)放射自顯影或其它

17、顯色方法確定出與探針互補(bǔ)的電泳帶。.47 1975年，M.Grunstein和D.Hosnese根據(jù)檢測(cè)重組子DNA分子的核酸雜交技術(shù)原理，對(duì)Southern印跡技術(shù)作了一些修改，提出了菌落原位雜交技術(shù)。二、重組DNA技術(shù)的基本步驟5. 重組子的篩選與鑒定6） 菌落原位雜交法.48二、重組DNA技術(shù)的基本步驟5. 重組子的篩選與鑒定 通過對(duì)PCR產(chǎn)物的電泳分析，確定目的基因是否插入到載體中。7) PCR篩選法普通PCR（質(zhì)粒為模板）菌落PCRM 1 2 3M: DNA Marker1：陽性對(duì)照2：樣本3：陰性對(duì)照.49二、重組DNA技術(shù)的基本步驟5. 重組子的篩選與鑒定8) 免疫沉淀篩選法在培

18、養(yǎng)基中加入目標(biāo)蛋白的特異性抗體然后涂布轉(zhuǎn)化液經(jīng)培養(yǎng)后，目的重組子菌落會(huì)分泌出目標(biāo)蛋白，與特異性抗體發(fā)生免疫沉淀反應(yīng)，在菌落周圍形成白色圓斑此法簡便快速，但靈敏度低，抗體消耗量大。培養(yǎng).50二、重組DNA技術(shù)的基本步驟5. 重組子的篩選與鑒定9) 核苷酸序列測(cè)定法最終鑒定，精確.51分離、擴(kuò)增、鑒定、研究、整理生物信息資源大規(guī)模生產(chǎn)生物活性物質(zhì)設(shè)計(jì)、構(gòu)建生物的新性狀甚至新物種三、重組DNA技術(shù)的應(yīng)用分離、擴(kuò)增、鑒定、研究、整理生物信息資源大規(guī)模生產(chǎn)生物活性物質(zhì)設(shè)計(jì)、構(gòu)建生物的新性狀甚至新物種.52對(duì)于生物學(xué)自身的意義反向遺傳學(xué)的誕生：表型 基因型 基因 蛋白結(jié)構(gòu)、功能分子生物學(xué)：基因表達(dá)調(diào)控、信

19、號(hào)傳遞途徑等 高等生物發(fā)育和分化基因組全序列的測(cè)定與分析： X174-DNA全序列測(cè)定 人類基因組計(jì)劃 水稻基因組作圖等克隆、突變、PCR等.53分離、擴(kuò)增、鑒定、研究、整理生物信息資源大規(guī)模生產(chǎn)生物活性物質(zhì)設(shè)計(jì)、構(gòu)建生物的新性狀甚至新物種三、重組DNA技術(shù)的應(yīng)用.54.55分離、擴(kuò)增、鑒定、研究、整理生物信息資源大規(guī)模生產(chǎn)生物活性物質(zhì)設(shè)計(jì)、構(gòu)建生物的新性狀甚至新物種三、重組DNA技術(shù)的應(yīng)用.56在農(nóng)牧業(yè)中的應(yīng)用.57增加農(nóng)作物產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值人體必需氨基酸：甲攜來一本亮色書 甲（甲硫氨酸）、攜（纈氨酸）來（賴氨酸）、一（異亮氨酸）本（苯丙氨酸）、亮（亮氨酸）色（色氨酸）、書（蘇氨酸）豆科種子缺

20、乏含硫氨基酸 禾谷類糧食都缺乏賴氨酸.58提高農(nóng)作物抗逆性能轉(zhuǎn)魚抗寒基因的番茄轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的甜椒.59生物固氮的基因工程氮?dú)饧s占空氣總體積的百分之八十 氮又是植物生長的主要肥料 合成銨在高溫高壓下進(jìn)行，轉(zhuǎn)化率也低(僅為220) 根瘤菌可將游離態(tài)的氮?dú)廪D(zhuǎn)化為氮肥山東大學(xué)聶延富教授培養(yǎng)出了世界上第一個(gè)人工小麥根瘤，根瘤內(nèi)產(chǎn)生接種的細(xì)菌并顯示出固氮活性 .60轉(zhuǎn)基因作物種植面積.61運(yùn)用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)，可培育畜牧業(yè)新品種生長快、肉質(zhì)好的轉(zhuǎn)基因魚(中國)乳汁中含有人生長激素的轉(zhuǎn)基因牛(阿根廷).62在醫(yī)藥衛(wèi)生上的應(yīng)用生產(chǎn)基因工程藥品胰島素 人生長激素干擾素 白細(xì)胞介素2粒細(xì)胞集落刺激因子 粒細(xì)

21、胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子紅細(xì)胞生成素EPO 組織纖維溶酶原激活劑生長激素 促生長素抗血友病因子 脫氧核糖核酸酶葡糖腦苷脂酶 鼠單克隆抗體.63基因工程藥品的生產(chǎn)許多藥品的生產(chǎn)是從生物組織中提取的。受材料來源限制產(chǎn)量有限，其價(jià)格往往十分昂貴。微生物生長迅速，容易控制，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。若將生物合成相應(yīng)藥物成分的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞內(nèi)，讓它們產(chǎn)生相應(yīng)的藥物，不但能解決產(chǎn)量問題，還能大大降低生產(chǎn)成本。.64胰島素胰島素從豬、牛等動(dòng)物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰島素，其產(chǎn)量之低和價(jià)格之高可想而知。將合成的胰島素基因?qū)氪竽c桿菌，每200L培養(yǎng)液就能產(chǎn)生10g胰島素！使其價(jià)格降低了3

22、0%-50%!.65干擾素從人血中提取干擾素，300L血才提取1mg！通過基因工程的方式創(chuàng)造了能合成人干擾素的大腸桿菌，每1Kg的培養(yǎng)液可提取20-40mg干擾素。.66基因工程制藥產(chǎn)業(yè)化特點(diǎn)高技術(shù)：高層次人才，高新技術(shù)手段，多學(xué)科滲透高投入：在國外，一個(gè)生物藥品平均要投入1-3億美元，并隨著開發(fā)難度的增大,有逐步增高的趨勢(shì)長周期：國際上，一個(gè)新的生物藥品需要6-8年時(shí)間高風(fēng)險(xiǎn): 一個(gè)新藥品的開發(fā)，經(jīng)過一系列的程序-研發(fā)、中試、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、I-III期臨床實(shí)驗(yàn)，上市和嚴(yán)格的藥政監(jiān)督管理。每一步都可能失敗，而前功盡棄高回報(bào): 開發(fā)成功一個(gè)新的生物藥品, 回報(bào)很高。如美國Amgen公司，首次開發(fā)上市的EPO、G-SCF到1997年的銷售額分別接近和達(dá)到20億美元.67基因工程疫苗傳統(tǒng)疫苗：滅活疫苗減毒活疫苗亞單位疫苗基因工程疫苗：亞單位疫苗核酸疫苗基因缺失活疫苗轉(zhuǎn)基因可食疫苗等.68基因治療所謂基因治療是指用基因工程的技術(shù)方法，將正常的基因轉(zhuǎn)入病患者的細(xì)