天然產(chǎn)物提取分離與結(jié)構(gòu)鑒定課件

1、第二章 天然產(chǎn)物的提取分離和結(jié)構(gòu)鑒定 一、基本概念1、提?。豪眠m當(dāng)?shù)娜軇┗蚍椒ǎ瑢⑺煞直M可能從原料中完全提出的過程。2、分離：將提取物中所含的各種成分一一分開，并將得到的單體加以精制的過程。 第一節(jié) 天然產(chǎn)物的提取 研究天然產(chǎn)物化學(xué)成分的基本步驟原材料單體化合物總提取物不同部位目的化合物結(jié)構(gòu)修飾人工合成提取初步分離精細(xì)分離純化 水 親水性有機(jī)溶劑 親脂性有機(jī)溶劑二、提取方法超臨界流體萃取法（SFE）水蒸氣蒸餾法溶劑提取法升華法壓榨法溶劑（一）溶劑提取法 溶劑提取法原理“相似相溶” 溶劑的選擇取決于被提取成分化學(xué)結(jié)構(gòu)、 溶解性及溶劑的性質(zhì)。 注意： 乙醇、甲醇雖然屬于親水性溶劑，可與水混溶

2、，但很多親脂性成分可溶于乙醇、甲醇，所以乙醇或甲醇提取液中既有水溶性成分，也有很多脂溶性成分。 溶劑提取法 根據(jù)天然成分的溶解性不同，選用對(duì)所需成分溶解度大而對(duì)其他成分溶解度小的溶劑，將所需成分從生物材料中溶解出來的一種提取方法。 溶劑提取是指溶劑進(jìn)入生物體細(xì)胞，溶解或分散其有用物質(zhì)而變成浸出物的全過程。 包括浸潤(rùn)、解吸和擴(kuò)散三個(gè)階段。1、溶劑提取法的原理選擇溶劑依據(jù)相似相溶原理。 浸潤(rùn)：滲透階段 溶劑通過細(xì)胞壁滲透到細(xì)胞中。解吸：溶解階段 細(xì)胞內(nèi)容物與細(xì)胞組織之間有親和 力，溶劑破除這種親和力。擴(kuò)散：置換階段 利用細(xì)胞內(nèi)的滲透力產(chǎn)生的壓差而抽提出來，用溶劑占領(lǐng)內(nèi)容物的位置而 將內(nèi)容物置換出來

3、。2、選擇溶劑的要點(diǎn) * 對(duì)所要成分溶解度大 * 沸點(diǎn)適中容易回收 * 低毒安全 * 廉價(jià) 天然產(chǎn)物成分中，萜、甾等大環(huán)、稠環(huán)化合物極性小，易溶于氯仿、乙醚等；糖、苷等易溶于水、乙醇等極性溶劑中；酸堿性成分因存在狀態(tài)不同溶解性不同。 最常用的溶劑為乙醇。3、常用溶劑的分類 水及酸水或堿水等，適合提取無機(jī)鹽、可溶性糖、多酚類、氨基酸、水溶性蛋白質(zhì)、有機(jī)酸鹽、生物堿鹽、苷類等。1.強(qiáng)極性溶劑2. 弱極性溶劑3. 非極性溶劑 親脂性有機(jī)溶劑，如乙醚、氯仿、乙酸乙酯、苯、石油醚、環(huán)己烷等。適合提?。撼鞍踪|(zhì)、粘液質(zhì)、果膠、淀粉與部分多糖外，大多可溶；部分脂溶成分亦可溶。通過調(diào)節(jié)乙醇濃度、加酸、加堿可改

4、變分離效果。 親水性有機(jī)溶劑，如甲醇、乙醇、丙酮。適合提取極性小的成分，但滲透性差，易燃、易揮發(fā)，常有毒性；樣品中水分多則提取效果差水甲醇乙醇丙酮乙酸乙酯乙醚氯仿苯石油醚 常見溶劑極性的強(qiáng)弱順序 ： 4、溶劑的選擇 (1) 水：為價(jià)廉、易得、使用安全的強(qiáng)極性溶劑。適于提取無機(jī)鹽、糖、氨基酸、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸鹽、生物堿鹽、苷類等。(2) 親水性有機(jī)溶劑：以乙醇最常用。高濃度提取親脂性成分，低濃度提取親水性成分。(3) 親脂性有機(jī)溶劑： 具有較強(qiáng)的選擇性，對(duì)揮發(fā)油、油脂、葉綠素、樹脂、內(nèi)酯、某些生物堿及一些苷元均可提取出來。 優(yōu)缺點(diǎn)：沸點(diǎn)低，濃縮回收方便，但易燃、有毒、價(jià)貴，穿透力差。5、溶劑提取的

5、方法 溶劑提取的方法連續(xù)回流提取法回流提取法煎煮法（煎中藥）滲漉法浸漬法（泡藥酒）（1）浸漬特點(diǎn) 適用于較易提取的有效成分遇熱易破壞以及含多量淀粉、樹膠、果膠、粘液質(zhì)的天然物的提取。適用范圍特點(diǎn)：浸出率較差，特別是用水為溶劑，其提取液易于發(fā)霉變質(zhì)，須注意加入適當(dāng)?shù)姆栏瘎７鬯楹玫乃幉姆湃胩崛∮玫娜葜?，加入溶劑使沒過藥面，浸泡12小時(shí)。濾出溶劑，加入新的溶劑繼續(xù)提取加入溶劑浸泡12小時(shí)后浸漬法（2）滲漉法向原料粗粉中不斷添加溶劑，使其滲過原料，從滲漉筒下端出口流出浸出液的一種浸出方法。（2）滲漉特點(diǎn) 當(dāng)溶劑滲進(jìn)原料溶出成分比重加大而向下移動(dòng)時(shí)，上層的溶液或稀浸出液便置換其位置，造成良好的濃度差，

6、使擴(kuò)散能較好地進(jìn)行。原理特點(diǎn)：浸出效率較高，浸出液較澄清。 溶劑消耗量大、費(fèi)時(shí)長(zhǎng)。 （3）煎煮法 以水為溶劑，對(duì)遇熱易破壞和揮發(fā)性成分有影響，對(duì)含多量淀粉、黏液質(zhì)的原料也不適用。 傳統(tǒng)的中藥煎制。 （4）回流提取法使用有機(jī)溶劑。對(duì)遇熱易破壞的成分有影響。 （5）連續(xù)回流提取法索式提取器的組成 循環(huán)使用揮發(fā)性的有機(jī)溶劑，在脂肪提取器中連續(xù)提取的方法。 提取效率高，節(jié)省溶劑。但不適于熱不穩(wěn)定成分的提取。 也可采用混合溶劑，常用的有水和乙醇。不同比例的溶劑可提出不同成分，如CHCl3-C2H5OH(95:5)可提取出強(qiáng)心甙、有機(jī)酸、葉綠素等。 連續(xù)回流 (索氏提取) .把濾紙做成與提取器大小相應(yīng)的濾

7、紙筒，然后把需要提取的樣品放入濾紙筒內(nèi)，裝入提取器。注意:a.濾紙筒既要緊貼器壁，又要方便取放。（濾紙筒上可以套一圈棉線，方便提取完成后取出濾紙筒。）b.被提取物高度不能超過虹吸管，否則被提取物不能被溶劑充分浸泡，影響提取效果。被提取物亦不能漏出濾紙筒，以免堵塞虹吸管。如果試樣較輕，可以用脫脂棉壓住試樣。 操作步驟： .在提取用的燒瓶中加入提取溶劑和沸石（沒有沸石可以用玻璃珠或碎瓷片，目的就是防止暴沸）。 .連接好燒瓶、提取器、回流冷凝管，接通冷凝水,加熱。沸騰后，溶劑的蒸氣從燒瓶進(jìn)到冷凝管中，冷凝后的溶劑回流到濾紙筒中，浸取樣品。溶劑在提取器內(nèi)到達(dá)一定的高度時(shí)，就攜帶所提取的物質(zhì)一同從側(cè)面的

8、虹吸管流入燒瓶中。溶劑就這樣在儀器內(nèi)循環(huán)流動(dòng)，把所要提取的物質(zhì)集中到下面的燒瓶?jī)?nèi)。 具體的回流時(shí)間是不一樣的，有的是按文獻(xiàn)要求提取一定時(shí)間，有的是提取至提取液無色，又比如用乙醚提取樣品中的脂肪時(shí)是以抽提管中流出的乙醚揮發(fā)后不留下油跡為抽提終點(diǎn)?？傊褪且崛⊥耆珵橹?。 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)薄膜蒸發(fā) 6、影響溶劑提取法的因素（1）生物材料的粉碎度 材料細(xì)，面積大，擴(kuò)散快，效果好。但是太細(xì)，吸附作用大，易糊化，擴(kuò)散慢，同時(shí)植物細(xì)胞也會(huì)遭受破壞，大量蛋白質(zhì)、淀粉被提出，產(chǎn)生沉淀或膠束狀，影響提取。 花、葉可適當(dāng)粗些，皮、莖、根宜細(xì)些。 （2）提取溫度 一般使用常溫，在不破壞有效成分的條件下加熱不要超過8

9、0C。 溫度低提取時(shí)的雜質(zhì)少，溫度高時(shí)提取效率高；但含淀粉、粘液質(zhì)較多的材料，水提時(shí)避免熱提。 （3）提取時(shí)間 以提完為準(zhǔn)，是否完全可以提取也做定性實(shí)驗(yàn)，或薄層層析檢測(cè)，或以液體顏色判斷。 根據(jù)檢測(cè)結(jié)果確定是否需要延長(zhǎng)提取時(shí)間。 （4）濃度差 根據(jù)擴(kuò)散原理，造成提取液的濃度差可以提高提取的效率。 可采取的措施有：攪拌、更換溶劑。 （5）新技術(shù)的使用 超聲波、微波促提技術(shù)的應(yīng)用，可以加快提取速度，提高提取效率。 目前實(shí)驗(yàn)室廣泛使用的超聲波萃取儀是將超聲波換能器產(chǎn)生的超聲波通過介質(zhì)（通常是水）傳遞并作用于樣品，這是一種間接的作用方式，聲振強(qiáng)度較低，必須通過增加超聲波發(fā)生器功率（3300W）來提高萃

10、取效率。但較大的超聲波功率，又會(huì)發(fā)出令人感覺不適的噪音。超聲波促提原理： 為物理過程，無化學(xué)反應(yīng)，不改變生物活性，高能量的超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)大壓力，可造成植物細(xì)胞壁及生物體破裂，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)釋放、擴(kuò)散、溶解。 實(shí)驗(yàn)室用小型超聲儀 工業(yè)生產(chǎn)用超聲儀 微波輔助技術(shù)是利用樣品中目標(biāo)物分子在微波電磁場(chǎng)的作用下，從原來的熱運(yùn)動(dòng)狀態(tài)轉(zhuǎn)為跟隨微波交變電磁場(chǎng)而快速排列取向，將微波能量轉(zhuǎn)化為樣品內(nèi)的能量，從而加速目標(biāo)物從固相進(jìn)入溶劑相的過程。 微波促提原理： 微波加熱機(jī)制： 極性分子作用機(jī)制: 極性分子存在一定的偶極矩，當(dāng)它處于一定的靜電場(chǎng)中時(shí)，偶極分子就有呈方向性的趨勢(shì)，即帶正電的一端朝向負(fù)極，帶負(fù)電的一端朝向正

11、極。當(dāng)電磁場(chǎng)方向變化時(shí)，偶極子的取向也隨之改變，分子發(fā)生擺動(dòng)。 當(dāng)微波的頻率較高時(shí)，如 2450MHz ，即1秒鐘內(nèi)電場(chǎng)變化 2.45109 次，極性分子也隨之發(fā)生 2.45109次的擺動(dòng)。由于分子的熱運(yùn)動(dòng)和相鄰分子間的相互作用，阻礙和干擾分子隨電場(chǎng)的擺動(dòng)，產(chǎn)生類似摩擦的作用，使分子獲得能量并以熱的形式表現(xiàn)出來。加熱機(jī)制 微波具有穿透力強(qiáng)，加熱效率高，操作簡(jiǎn)便、快速、節(jié)能、高效等特點(diǎn)。 缺點(diǎn)：化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)易發(fā)生變化，繼而導(dǎo)致生物活性的改變。 微波提取尤其要注意能量的控制，被提取物質(zhì)的穩(wěn)定性。 工業(yè)生產(chǎn)用微波提取罐 （二）水蒸氣蒸餾法 適于具有揮發(fā)性，能隨水蒸氣蒸餾而不被破壞的有效成分結(jié)構(gòu)的提

12、取。如揮發(fā)油、小分子生物堿、酚類、游離醌類等。 水蒸氣蒸餾法是將水蒸氣通入不溶或難溶于水但有一定揮發(fā)性的有機(jī)物質(zhì)中，使該有機(jī)物在低于100的溫度下，隨著水蒸氣一起蒸餾出來。原理：道爾頓分壓定律 水蒸氣蒸餾裝置 常用的水蒸氣蒸餾裝置，包括水蒸氣發(fā)生器、蒸餾、冷凝和接受器四個(gè)部分。 （三）升華法裝置圖適用范圍某些固體物質(zhì)（如水楊酸、苯甲酸、樟腦等）受熱后，在低于其熔點(diǎn)的溫度下，不經(jīng)過熔化就可以直接轉(zhuǎn)化為蒸汽，蒸汽遇冷又凝結(jié)為固體稱為升華 1、將茶葉與95%乙醇回流2h；2、濾出茶葉，濃縮提取液至適當(dāng)體積；3、濃縮液與生石灰粉混合，攪成漿狀，用蒸發(fā)皿在蒸汽浴上蒸干，除去水份；4、在蒸發(fā)皿上蓋一張刺孔

13、向上的濾紙，再在濾紙上罩一個(gè)大小適合且頸部塞有棉花的漏斗；5、用酒精燈隔石棉網(wǎng)加熱，適當(dāng)控制溫度，白色咖啡因在濾紙上結(jié)晶。實(shí)驗(yàn)室提取咖啡因步驟：升 華（四）超臨界流體萃取 在臨界區(qū)附近，壓力和溫度的微小變化，會(huì)引起流體密度的大幅度變化，從而影響其溶解能力。 物質(zhì)在不同溫度和壓力的條件下，可以以不同的形態(tài)存在，如固體，液體，氣體，超臨界流體等。在超臨界流體中，不同的物質(zhì)有不同的溶解度，溶解度大的物質(zhì)溶解在超臨界流體中，與不溶解或者溶解度小的物質(zhì)分開。然后，通過升高溫度，降低壓力或者吸附的方法，使萃取物與超臨界流體分離，而得到所需的物質(zhì)。原理超臨界狀態(tài)P-T相圖氣態(tài) = 液態(tài)臨界點(diǎn):氣、液界面剛剛

14、消失的狀態(tài)點(diǎn)(Pc、Tc)為什么超臨界流體是良好的萃取劑液體超臨界流體氣體超臨界流體的物理性質(zhì)和傳質(zhì)特性介于液體和氣體之間超臨界流體的溶解能力與液體的溶解能力接近；擴(kuò)散系數(shù)接近于氣體 液體氣體超臨界流體溶解能力擴(kuò)散系數(shù)優(yōu)良性能的萃取劑溶劑萃取超臨界萃取溶劑殘留不可避免完全無溶劑殘留，純凈存在重金屬無重金屬溶劑的溶解能力為定值溶解能力隨溫度和壓力變化可能使用高溫，熱敏物質(zhì)分解通常在較低溫度下，不分解存在無機(jī)鹽被萃取的問題無無機(jī)鹽殘留溶劑選擇性差選擇性好需額外的操作單元來脫除溶解在線分離，有效物質(zhì)收率高溶劑萃取和超臨界萃取的對(duì)比 最常用的是二氧化碳超臨界萃取法，環(huán)保、成本低、提取分離一步完成。分子

15、的極性、沸點(diǎn)和分子量的大小與其在二氧化碳超臨界流體中的溶解性密切相關(guān)。（三）超臨界流體萃取法 超臨界二氧化碳流體(SFE-CO2)臨界點(diǎn)(31.1)相當(dāng)接近室溫超臨界二氧化碳萃取 二氧化碳在溫度高于臨界溫度Tc=31.26，壓力高于臨界壓力Pc=7.4MPa的狀態(tài)下，性質(zhì)會(huì)發(fā)生變化，其密度近于液體，粘度近于氣體，擴(kuò)散系數(shù)為液體的100倍，因而具有驚人的溶解能力。用它可溶解多種物質(zhì)，然后提取其中的有效成分，具有廣泛的應(yīng)用前景。超臨界二氧化碳是目前研究最廣泛的流體之一，因?yàn)樗哂幸韵聨讉€(gè)特點(diǎn)： (1)CO2臨界溫度為31.26，臨界壓力為7.4MPa，臨 界條件容易達(dá)到. (2)CO2化學(xué)性質(zhì)不活

16、潑，無色無味無毒，安全性好.(3)價(jià)格便宜，純度高，容易獲得. 利用超臨界條件下流體的特殊性能對(duì)樣品進(jìn)行提取，是20世紀(jì)80年代迅速發(fā)展起來的一種提取方法。 超臨界流體不但具有與液體接近的密度，有很強(qiáng)的穿透性，接近或超過溶劑的提取效率；而且具有與氣體相近的擴(kuò)散的性能，提取效率越高。 常用的超臨界流體有CO2、乙烷、丙烷等。 與普通有機(jī)溶劑提取法相比，超臨界CO2萃取技術(shù)具有無毒、常溫、不易燃、無污染等特點(diǎn)，可確保原有的色、香、味不因受熱破壞；更為可貴的是在萃取過程中可同時(shí)對(duì)萃取物進(jìn)行分離純化。該技術(shù)適宜于萃取高價(jià)值的油脂（包括天然功能性油脂）、精油、內(nèi)酯等極性較低的天然產(chǎn)物有效成分。 超臨界C

17、O2提取的特點(diǎn)。 CO2 鋼瓶 冷溫槽 高壓泵恒溫箱 控溫面板 接受瓶 流量計(jì) CO2 原料 玻璃珠 脫脂棉 萃取柱 超臨界CO2 萃取實(shí)驗(yàn)裝置示意圖 液體CO2由高壓泵加壓到萃取工藝要求的壓力并傳送到換熱器，將CO2流體加溫到萃取工藝所需溫度后進(jìn)入萃取器，在此完成萃取過程。負(fù)載溶質(zhì)的CO2流體在分離器中改變溫度壓力，溶解度降低使萃取物得以分離。分離萃取物后的CO2流體再經(jīng)換熱器液化后回到儲(chǔ)罐中循環(huán)使用。超臨界CO2提取操作流程 20世紀(jì)50年代初進(jìn)入試驗(yàn)階段，如從石油中脫瀝青。 70、80年代SFE用于食品香料的提取。 90年代從植物藥中提取目標(biāo)成分，如從蛇床子、桑白皮、茵陳蒿中提取活性成分

18、。 大型超臨界流體萃取裝置超臨界流體萃取技術(shù)的應(yīng)用第二節(jié) 天然產(chǎn)物的分離一、經(jīng)典分離方法1.溶劑法6.分餾法5.升華法4.膜分離法3.沉淀法2.結(jié)晶法1.溶劑法包括（1）系統(tǒng)溶劑分離法（2）兩項(xiàng)溶劑萃取法（1）系統(tǒng)溶劑法原理 依據(jù)“相似相溶”的原理，按極性由小到大的順序依次提取分離總提液中各種溶解度有差異的成分。 石油醚、己烷揮發(fā)油、脂溶性色素、蠟 乙醚、氯仿生物堿、苷元 乙酸乙酯黃酮苷 正丁醇皂苷、蒽醌苷 甲醇、乙醇苷、糖類、生物堿鹽適用范圍優(yōu)缺點(diǎn) 此法是早 年研究天然藥物有效成分的一種最重要的方法，主要用于分離提純含有極性不同的各種化學(xué)成分的中藥提取液。目前仍是最常用的方法， 此法操作繁瑣

19、，對(duì)化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，容易引起分解、異構(gòu)化的天然產(chǎn)物應(yīng)特別注意。在微量成分、結(jié)構(gòu)性質(zhì)相似成分的分離純化上受到很大限制。（2）兩項(xiàng)溶劑萃取法原理 利用混合物中各單體組分在兩相溶劑中的分配系數(shù)（K）不同而達(dá)到分離的方法。 溶劑分配法的兩相往往是互相飽和的水相與有機(jī)相?；旌衔镏懈鞒煞衷趦上嘀蟹峙湎禂?shù)相差越大，則分離效果越高。萃取的方法1）簡(jiǎn)單萃取法：實(shí)驗(yàn)室用分液漏斗，一般在水和親脂性有機(jī)溶劑中進(jìn)行，根據(jù)情況，可用酸水或堿水。中藥中成分比較復(fù)雜，2）pH度萃取法：以pH成梯度的酸（堿）水溶液依次萃取以親脂性有機(jī)溶劑溶解的堿（酸）性成梯度的混合生物堿(混合酚、 酸類)， 使后者分離的方法。萃取分離不出來純

20、品。一次3）連續(xù)萃取法：采用連續(xù)萃取器萃取。利用兩溶液比重不同自然分 層和分散相液滴穿過連續(xù)相 溶劑時(shí)發(fā)生傳質(zhì)。此法可克 服分液漏斗多次萃取的麻煩。4）液滴逆流分配法（DCCC法）：是利用流動(dòng)相形成液滴，通過作為固定相的液柱而達(dá)到分離純化的目的。雙水相萃取法（一）、概述 早在1896年,學(xué)者發(fā)現(xiàn),當(dāng)明膠與瓊脂或明膠與可溶性淀粉溶液相混時(shí),得到一個(gè)混濁不透明的溶液，隨之分為兩相,上相富含明膠,下相富含瓊脂(或淀粉), 這種現(xiàn)象被稱為聚合物的不相溶性，從而產(chǎn)生了雙水相體系。 雙水相體系的形成主要是由于高聚物之間的不相溶性，即高聚物分子的空間阻礙作用，相互無法滲透，不能形成均一相，從而具有分離傾向，

21、在一定條件下即可分為二相。 利用親水性高分子聚合物的水溶液可形成雙水相的性質(zhì)，瑞典的Albertsson于20世紀(jì)50年代后期開發(fā)了雙水相萃取法（aqueous two-phase extraction），又稱雙水相分配法。 20世紀(jì)70年代,科學(xué)家又發(fā)展了雙水相萃取在生物分離過程中的應(yīng)用，為蛋白質(zhì)特別是胞內(nèi)蛋白質(zhì)的分離和純化開辟了新的途徑。雙水相萃取法概述（二）雙水相系統(tǒng)及特點(diǎn)1、什么是雙水相系統(tǒng)？聚合物的不相容（溶）性： 把兩種或兩種以上具有一定濃度的親水性聚合物溶液混合后靜置，這些親水性的高分子聚合物并不混為一相，而是分成兩個(gè)液相，這種含有聚合物分子的溶液發(fā)生分相的現(xiàn)象稱為聚合物的不相溶

22、性。聚乙二醇(PEG)溶液葡聚糖(Dx)溶液利用雙水相的成相現(xiàn)象及待分離組分在兩相間分配系數(shù)差異，進(jìn)行組分分離或多水相提純技術(shù)。雙水相體系：分相的聚合物都是以水作為溶劑，稱雙水相體系雙水相萃取技術(shù)：聚合物不相容性的原因：聚合物分子的空間阻礙作用，相互之間無法滲透而分離成多相 聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dx)； 聚丙二醇/聚乙二醇； 甲基纖維素(methylcellulose)/葡聚糖。 雙水相萃取中常采用的雙聚合物系統(tǒng)為PEG/Dx，該雙水相的上相富含PEG，下相富含Dx。除雙聚合物系統(tǒng)外，聚合物與無機(jī)鹽的混合溶液也可形成雙水相，例如，PEG/磷酸鉀、PEG/磷酸銨、PEG/硫酸鈉等常用于生

23、物產(chǎn)物的雙水相萃取。PEG/無機(jī)鹽系統(tǒng)的上相富含PEG，下相富含無機(jī)鹽。 常見雙水相系統(tǒng)？2、雙水相萃取法的特點(diǎn)能夠保留產(chǎn)物的活性整個(gè)操作可以連續(xù)化與傳統(tǒng)的沉淀法相比，要優(yōu)越得多。已被廣泛地應(yīng)用在蛋白質(zhì)、核酸和病毒等產(chǎn)品的分離純化-半乳糖苷酶的提取也到了中試規(guī)模等。 影響待分離物質(zhì)在雙水相體系中分配行為的主要參數(shù)有成相聚合物的種類、成相聚合物的分子質(zhì)量和總濃度、無機(jī)鹽的種類和濃度、pH 值、溫度等。萃取原理雙水相萃取技術(shù)的應(yīng)用 雙水相萃取技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化工和食品化工等領(lǐng)域，并取得了許多成功的范例，主要是分離蛋白質(zhì) ，酶，病毒，脊髓病毒和線病毒的純化，核酸，DNA的分

24、離，干擾素，細(xì)胞組織，抗生素，多糖，色素，抗體等。 此外雙水相還可用于稀有金屬貴金屬分離，傳統(tǒng)的稀有金屬貴金屬溶劑萃取方法存在著溶劑污染環(huán)境，對(duì)人體有害，運(yùn)行成本高，工藝復(fù)雜等缺點(diǎn)。雙水相技術(shù)萃取技術(shù)引入到該領(lǐng)域，無疑是金屬分離的一種新技術(shù)。雙水相萃取技術(shù)的工藝流程主要由三部分構(gòu)成:目的產(chǎn)物的萃取; PEG的循環(huán); 無機(jī)鹽的循環(huán)。雙水相萃取的工藝流程分離和提純各種蛋白質(zhì)(酶） 用聚乙二醇(PEG)/ -(NH4) 2SO4 雙水相體系,經(jīng)一次萃取從 - 淀粉酶發(fā)酵液中分離提取 - 淀粉酶和蛋白酶；萃取最適宜條件為PEG1000 ( 15 %) (NH4) 2SO4 (20 %) , pH =

25、8 ，- 淀粉酶收率為90 % ，分配系數(shù)為19. 6，蛋白酶的分離系數(shù)高達(dá)15. 1。比活率為原發(fā)酵液的1. 5 倍，蛋白酶在水相中的收率高于60 %。雙水相的應(yīng)用舉例提取抗生素和分離生物粒子 采用PEG/ Na2HPO4 體系提取丙酰螺旋霉素，最佳萃取條件是pH= 8. 08. 5 ， PEG2000 (14 %) / Na2HPO4 (18 %) ,小試收率達(dá)69. 2 % ,對(duì)照的乙酸丁酯萃取工藝的收率為53. 4 %雙水相的應(yīng)用舉例目前存在的問題： 雖然該技術(shù)在應(yīng)用方面已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但幾乎都是建立在實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，到目前為止還沒能完全清楚地從理論上解釋雙水相系統(tǒng)的形成機(jī)理以及生

26、物分子在系統(tǒng)中的分配機(jī)理。存在的問題1、定義 反膠束或稱逆膠束(Reversed micelle) 是指當(dāng)有機(jī)溶劑中加入表面活性劑并令其濃度超過某臨界值時(shí)，表面活性劑便會(huì)自發(fā)地在有機(jī)溶劑中形成一種穩(wěn)定的大小為納米級(jí)的聚集體。 在反膠束中，表面活性劑的非極性基團(tuán)在外與非極性的有機(jī)溶劑接觸，而極性基團(tuán)則排列在內(nèi)形成一個(gè)極性核。此極性核具有溶解極性物質(zhì)的能力，極性核溶解水后，就形成了“水池” 。反膠團(tuán)（膠束）萃取反膠團(tuán)（膠束）萃取反膠團(tuán)（膠束）萃取靜電引力：主要是蛋白質(zhì)的表面電荷與反膠束內(nèi)表面電荷（離子型表面活性劑）之間的靜電引力作用。 空間位阻作用：增大反膠束極性核的尺寸，以減小大分子蛋白進(jìn)入膠核

27、的傳質(zhì)阻力。凡是能夠引起靜電引力，能夠促使反膠束尺寸增大的因素均有利于提高分配系數(shù)。這些因素主要是pH、離子強(qiáng)度、表面活性劑種類和濃度等，通過因素優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)選擇性地萃取和反萃取。2. 反膠束萃取的原理：3.反膠束的溶解作用微水池溶解和分離作用： 反膠團(tuán)的微水池的水可溶解氨基酸、肽和蛋白質(zhì)等生物分子，為生物分子提供易于生存的親水微環(huán)境。 因此，反膠團(tuán)萃取可用于氨基酸、肽和蛋白質(zhì)等生物分子的分離純化，特別是蛋白質(zhì)類生物大分子。在反膠束內(nèi)部包含了水溶液，蛋白質(zhì)等生物分子萃取后進(jìn)入反膠團(tuán)內(nèi)部的“水池” 中，避免了與有機(jī)溶劑直接接觸，反膠束內(nèi)的微環(huán)境與生物膜內(nèi)相似，故能很好保持其生物活性，解決了蛋白質(zhì)在

28、有機(jī)溶劑中容易變性失活和難溶于有機(jī)溶劑的問題，為蛋白質(zhì)的提取和分離開辟了一條新的途徑。成本低，有機(jī)溶劑可反復(fù)使用；容易放大和實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作 反膠束萃取是一條具有工業(yè)發(fā)展前景的蛋白質(zhì)分離技術(shù)。 反膠束法的優(yōu)點(diǎn)（1）溶液的pH pH影響蛋白質(zhì)的電荷數(shù)量和電荷性質(zhì)（2）溶液的離子強(qiáng)度 影響微膠團(tuán)的靜電狀態(tài). 凡是對(duì)蛋白質(zhì)所含電荷有影響的因素，如pH，以及對(duì)反膠束的靜電狀態(tài)有影響的因素，均能改變蛋白質(zhì)的增溶作用。（3）表面活性劑的濃度和種類（4）其他（有機(jī)溶劑、助表面活性劑、溫度）3、 影響反膠團(tuán)萃取的因素 4.膠束萃取的操作A萃取的基本方法B 反萃取 . C 分級(jí)萃取AOT = 二-(2-已基)琥珀酸

29、酯磺酸鈉。5、應(yīng)用舉例 純化和分離蛋白質(zhì) 如對(duì)于溶菌酶和肌紅蛋白的混合溶液(兩種蛋白質(zhì)相對(duì)分子量相近,等電點(diǎn)分別為11. 1 和6. 8），用二烷基磷酸鹽/ 異辛烷反膠束溶液萃取，并用緩沖液將混合液的pH 值調(diào)至9. 0 ，則溶菌酶完全進(jìn)入有機(jī)相中,而肌紅蛋白則留在水相.提取或分離物 溶液 結(jié)晶 2.結(jié)晶法粗結(jié)晶溶于選擇的溶劑，加熱成飽和溶液，過濾放置（冷藏）析晶，過濾重復(fù)上述操作（重結(jié)晶）3.沉淀法 酸性或堿性化合物通過加入某種沉淀試劑使之生成水不溶性的鹽類等沉淀析出而實(shí)現(xiàn)分離。如生物堿加入有機(jī)酸可生成不溶于水的有機(jī)酸鹽沉淀，酸性化合物可加入鈣鹽、鉛鹽、鋇鹽等生成不溶性的沉淀。 水醇沉淀法鉛

30、鹽沉淀法1）水提取醇沉淀法，于水提濃縮液中加入乙醇使含醇量達(dá)60%以上，可使多糖、蛋白質(zhì)沉淀。2）醇提取水沉淀法，于醇提取濃縮液中加入10倍量以上水，可沉淀親脂性成分。 利用中性醋酸鉛或堿式醋酸鉛在水或稀醇溶液中能與許多物質(zhì)生成難溶的鉛鹽或絡(luò)鹽沉淀而分離的方法。酸堿沉淀法專屬試劑沉淀法1）酸提取堿沉淀：用于生物堿的提取分離。2）堿提取酸沉淀：用于酚、酸類成分和內(nèi)酯類成分的提取、分離。 某些試劑能選擇性地沉淀某類成分，稱為專屬試劑沉淀法。 （四）透析法 利用小分子物質(zhì)在溶液中可通過半透膜，大分子則不能通過半透膜的性質(zhì)進(jìn)行分離的方法。 如分離純化皂甙、蛋白質(zhì)、多肽、多糖等大分子時(shí)，用此法可除無機(jī)鹽

31、、單、雙糖等小分子雜質(zhì) 。 透析膜的膜孔有大有小，視具體情況而選擇，常用透析膜：動(dòng)物性膜、火棉膠膜、硫酸紙膜、玻璃紙膜等。 借助機(jī)械外力的作用，將油脂從榨料中擠壓出來的過程。在壓榨過程中，主要發(fā)生的是物理變化，如物料變形、油脂分離、摩擦發(fā)熱、水分蒸發(fā)等。但由于溫度、水分、微生物等的影響，同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生某些生物化學(xué)方面的變化，如蛋白質(zhì)變性、酶的鈍化和破壞、某些物質(zhì)的結(jié)合等。壓榨時(shí)，榨料粒子在壓力作用下內(nèi)外表面相互擠緊，致使其液體部分和凝膠部分分別產(chǎn)生兩個(gè)不同過程，即油脂從榨料空隙中被擠壓出來及榨料粒子變形形成堅(jiān)硬的油餅。 （五）壓榨法石油醚(流動(dòng)相)碳酸鈣(固定相)色譜帶最早的色譜實(shí)驗(yàn)二、色譜分離

32、法柱色譜薄層色譜原理：利用混合物中各成分在固定相和移動(dòng)相中吸附、分配及其親和力的差異而達(dá)到分離。 色譜定義：是一種物理化學(xué)分離分析技術(shù)，它利用混合物中各組分在固定相和流動(dòng)相間的分配系數(shù)的差異，讓各組分在兩相間進(jìn)行多次分配產(chǎn)生明顯遷移速差而得以分離。又稱之為色譜分離法、層析法按移動(dòng)相分氣相色譜液相色譜按色譜原理分吸附色譜分配色譜離子交換色譜凝膠色譜按操作方法分柱色譜紙色譜薄層色譜色譜的分類薄層色譜法定義分類吸附薄層色譜分配薄層色譜 在平面載板上均勻涂布適宜的固定相形成一薄層，將欲分離的試樣于薄層板上點(diǎn)樣，隨著移動(dòng)相溶劑的移動(dòng)展開，混合物中各成分獲得分離的方法。 常用的吸附劑硅膠應(yīng)用最為廣泛!粒徑

33、：200-300目種類：硅膠G硅膠+粘合劑煅石膏 硅膠GF254含有熒光物質(zhì) 硅膠H 不含粘合劑煅石膏 硅膠HF254 含有熒光物質(zhì)常用的吸附劑其它氧化鋁：堿性、中性、酸性三種規(guī)格。聚酰胺：“氫鍵吸附”，對(duì)羥基類成分有很好的分離效果。附子中烏頭堿的限量檢查，就是采用堿性氧化鋁制備的薄層板薄層色譜法展開劑的選擇待測(cè)組分的Rf值宜控制在0.2-0.8之間各組分斑點(diǎn)圓且集中混合溶劑臨用前新鮮配制 要根據(jù)被分離物質(zhì)的溶解性、酸堿性、極性等性質(zhì)，結(jié)合吸附劑的吸附性能，綜合考慮，可選擇單一溶劑或混合溶劑系統(tǒng)。 若分離某些酸性或堿性成分，可在所選溶劑中加入少量的酸或堿或?qū)⒁恍”瓝]發(fā)性酸或堿放置色譜缸內(nèi)。操作

34、技術(shù)手工鋪板 取一份吸附劑和三份水（或另加黏合劑），在研缽中向一個(gè)方向研磨混合成均勻糊狀（無氣泡和結(jié)塊），均勻涂布在薄層板上。玻璃板層析專用玻璃板，清洗干凈用量1020CM，3g硅膠黏合劑0.20.5%CMC-NA溶液，0.3%干燥水平臺(tái)面，室溫下自然完全晾干檢查表面光滑平整，均勻，無雜質(zhì)操作要點(diǎn)CMC-Na溶液的配制 濃度0.20.5%，一般用的濃度是0.3%。 濃度過稀，使用的時(shí)候薄層易掉粉 濃度過大，用硫酸顯色加熱易變黑 使用上清液 取蒸餾水1000ml，在加熱并不斷攪拌的條件下，緩慢加入羧甲基纖維素鈉0.3g，至完全溶解。靜置冷卻，臨用前取上清液備用。裂開的薄層板不能使用! 操作技術(shù)活

35、化涂布后的薄層先在室溫下陰干，至完全干透后，在使用前置適當(dāng)溫度烘烤一定時(shí)間進(jìn)行活化，然后置干燥器中備用。不同薄層活化條件略有不同。硅膠 105-110 3060min氧化鋁 105-110 30min操作技術(shù)點(diǎn)樣定量微升毛細(xì)管薄層點(diǎn)樣毛細(xì)管 溶液沸點(diǎn)適中，對(duì)成分溶解度好（甲醇、乙醇、氯仿、醋酸乙酯等）。 斑點(diǎn)不宜過大,以小于3mm為宜，采用多次點(diǎn)加法。點(diǎn)樣量應(yīng)適中。毛細(xì)點(diǎn)樣管或定量毛細(xì)點(diǎn)樣管盡可能往薄層板中間點(diǎn)。操作技術(shù)展開 預(yù)先用展開劑將密閉的色譜缸飽和片刻，然后將點(diǎn)樣后的薄層板置缸內(nèi)支架上，勿與展開劑接觸，預(yù)飽和一定時(shí)間，使缸內(nèi)飽和的展開劑氣體達(dá)到平衡。飽和后，將薄層板點(diǎn)有試樣一端浸入展開

36、劑約0.5cm深處（不能浸泡點(diǎn)樣斑點(diǎn)），開始展開，隨著展開劑的上升，試樣中不同成分因遷移速度不同而得到分離。待展開劑上行遷移到規(guī)定高度即取出烘干操作技術(shù)顯色觀察方法：日光、熒光、顯色通?？上仍谌展庀掠^察，標(biāo)出色斑并確定其位置，然后在紫外光下觀察和標(biāo)記，必要時(shí)再選擇顯色劑顯色觀察若薄層板為硬板，采用噴霧法將顯色劑直接噴灑；軟板可選用碘蒸氣法、壓板法顯色噴霧瓶三用紫外燈操作技術(shù)計(jì)算比移值0.2-0.8Rf值越大，化合物的極性？紙色譜法定義與原理分配色譜定義：以濾紙為支持劑，濾紙上吸著的水（或根據(jù)實(shí)際分離的需要，經(jīng)適當(dāng)處理后濾紙上吸附的溶液）為固定相，用一定的溶劑系統(tǒng)為移動(dòng)相進(jìn)行展開，利用混合物中各

37、成分分配系數(shù)的差異而達(dá)到分離的一種分配色譜法。紙色譜法實(shí)驗(yàn)所需器材薄層點(diǎn)樣毛細(xì)管 主要用于親水性化合物的分離如氨基酸、苷類、糖類、有機(jī)酸分類吸附柱色譜凝膠過濾色譜分配柱色譜離子交換柱色譜 上樣量大，常用于制備分離，是分離天然化學(xué)成分最常用的方法。 柱色譜是一種將分離材料裝入柱狀容器中,以適當(dāng)?shù)南疵搫┻M(jìn)行洗脫而使不同成分得到分離的色譜方法。柱色譜-定義吸附柱色譜法基本原理吸附作用化學(xué)吸附:堿性氧化鋁與黃酮發(fā)生的吸附半化學(xué)吸附:氫鍵吸附，過程可逆物理吸附：相似者易于吸附 吸附色譜最主要的吸附力 利用作為固定相的吸附劑對(duì)混合物中各種成分吸附能力的大小不同，使各種成分得到相互分離的方法。物理吸附化學(xué)吸

38、附半化學(xué)吸附 溶液分子與吸附劑表面分子的分子間作用力。 硅膠、氧化鋁及活性炭為吸附劑的吸附色譜 如聚酰胺與黃酮類、蒽醌類等化合物之間的氫鍵吸附。介于物理吸附與化學(xué)吸附之間 如黃酮等酚酸性物質(zhì)被堿性氧化鋁吸附，生物堿被酸性硅膠吸附等。物理吸附基本規(guī)律相似者易吸附 固液吸附三要素：吸附劑、溶質(zhì)、溶劑極性吸附劑非極性吸附劑 對(duì)非極性物質(zhì)親和能力強(qiáng)，溶劑極性降低，則活性炭對(duì)溶質(zhì)的吸附能力也隨之降低；反之，則提高。 a.對(duì)極性強(qiáng)的物質(zhì)吸附能力強(qiáng) b.溶劑極性減弱，則吸附劑對(duì)溶質(zhì)的吸附能力增強(qiáng)；反之，則減弱。c.溶質(zhì)即使被硅膠、氧化鋁吸附，一旦加入極性較強(qiáng)的溶劑時(shí)，又可被置換洗脫下來。 常用于分離水溶性成

39、分如氨基酸、糖類及某些苷類！聚酰胺柱色譜洗脫劑聚酰胺操作步驟：裝柱上樣洗脫常用的吸附劑聚酰胺 聚酰胺是通過酰胺基聚合而成的一類高分子化合物，分子中含有豐富酰胺基，可與酚類、酸類、醌類、硝基化合物等形成氫鍵結(jié)合而被吸附，根據(jù)吸附力的大小不同，使能形成氫鍵與不能形成氫鍵的化合物達(dá)到分離。氫鍵吸附聚酰胺吸附能力強(qiáng)弱的判斷溶劑的種類水、有機(jī)溶劑、堿溶液化合物分子結(jié)構(gòu)分子中能形成氫鍵的基團(tuán)越多，吸附越強(qiáng)成鍵基團(tuán)位置不同，被吸附的強(qiáng)弱也不同共軛雙鍵越多，吸附越強(qiáng)能形成分子內(nèi)氫鍵者被吸附強(qiáng)度減弱化合物結(jié)構(gòu)對(duì)聚酰胺吸附作用的影響形成氫鍵的數(shù)目成鍵基團(tuán)位置雙鍵的數(shù)目分子內(nèi)氫鍵吸附柱色譜流動(dòng)相極性吸附劑溶劑極性越

40、大，洗脫能力越強(qiáng) 非極性吸附劑水、l0%乙醇、20%乙醇、 30%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇 聚酰胺水、乙醇（30%、50%、75%、95%）、丙酮、稀氨水液或稀氫氧化鈉水液、甲酰胺或二甲基甲酰胺、尿素水溶液 吸附柱色譜被分離物質(zhì) 在吸附劑與洗脫劑固定的情況下，各組分分離的情況直接與化合物的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)有關(guān)。 硅膠和氧化鋁（極性吸附劑），極性越大，被吸附就越強(qiáng)！ 柱層析吸附劑一般是100-200目 試樣與吸附劑用量比約為1:60 可分為濕法裝柱和干法裝柱吸附柱色譜裝柱要求 柱中吸附劑充填均勻，柱體內(nèi)不得出現(xiàn)氣泡、疏密不勻或者裂縫！ 濕法上樣：洗脫劑溶解試樣制成高 濃度溶液 干法上樣

41、：試樣層盡量窄且平整吸附柱色譜上樣吸附柱色譜洗脫 參照薄層色譜確定色譜條件：Rf約為0.2 梯度洗脫 注意保持液面高度，勿使柱面洗脫液流干 化合物無色，等份收集+薄層鑒別分配色譜法分配色譜法基本原理(分配系數(shù)不同)正相分配色譜反相分配色譜正相色譜極性物質(zhì)吸附強(qiáng)非極性物質(zhì)吸附弱后出先出反相色譜極性物質(zhì)吸附弱非極性物質(zhì)吸附強(qiáng)先出后出分配柱色譜法基本原理反向分配色譜 正向分配色譜 支持劑：硅膠，溶劑系統(tǒng)：水飽和的正丁醇， 水為固定相，正丁醇為移動(dòng)相。 反相硅膠：在硅膠表面鍵合長(zhǎng)度不同的烷基R，形成親油表面而成。烷基長(zhǎng)度為乙基、辛基、十八烷基。 溶劑：H2O-MeOH、H2O-CH3CN離子交換色譜法

42、定義、 分類 是一種利用離子交換樹脂上的功能基能在水溶液中與溶液的其他離子進(jìn)行可逆交換的性質(zhì)，以離子交換樹脂作為固定相，使混合成分中離子型與非離子型物質(zhì)、或具有不同解離度的離子化合物得到分離的方法。 陽離子交換樹脂：被分離物質(zhì)帶正電荷陰離子交換樹脂：被分離物質(zhì)帶負(fù)電荷分類氨基酸的離子交換分離原理離子交換柱色譜操作技術(shù)樹脂的預(yù)處理 裝柱 上樣 洗脫 再生 定義 以凝膠作為固定相，選擇適當(dāng)?shù)娜軇┻M(jìn)行洗脫，使混合物分子中分子量大小不同的化合物得到分離的方法分離原理 葡聚糖凝膠是由葡聚糖和甘油基通過醚橋相交鏈而成的多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 凝膠吸水后形成凝膠粒子，凝膠粒子構(gòu)成網(wǎng)眼，小分子進(jìn)入，大分子流下。如同

43、按照分子大小過篩一樣，故稱為“篩層析”。 凝膠層析 凝膠是一種不帶電的具有三維空間的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，每個(gè)顆粒的細(xì)微結(jié)構(gòu)及篩孔的直徑均勻一致，小分子可以進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔，而大分子則排阻于顆粒之外。 凝膠層析又稱分子篩過濾、排阻層析等，依據(jù)是多孔的載體對(duì)不同體積和不同形狀分子的排阻能力的不同，從而對(duì)混合物進(jìn)行分離。凝膠層析 表面有孔隙，其大小決定于聚糖與交聯(lián)劑的配比及反應(yīng)條件。 商品型號(hào)即按凝膠的交聯(lián)度大小分類，并以吸水量來表示，英文字母G代表葡聚糖凝膠，后面的數(shù)字表示每克凝膠吸水量，再乘以10的值，G-25的吸水量為每克2.5ml。 交聯(lián)度大網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越緊密孔隙越小吸水膨脹越少。大分子化合物阻力較

44、小，流速較快小分子化合物阻力較大，流速較慢凝膠色譜原理示意圖 此法常用的凝膠有葡聚糖凝膠（Sephadex G-25）和羥丙基葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20)。前者只適用于在水中應(yīng)用，而后者不但可在水中用，也可在有機(jī)溶劑中用或在水與有機(jī)溶劑的混合溶劑中使用。 G型凝膠：水或含水醇上樣、洗脫分離水溶性大分子化合物。 Sephadex LH-20凝膠（引入羥丙基）：可用有機(jī)溶劑極性大、極性小化合物均可分離。凝膠層析凝膠柱層析的動(dòng)態(tài)過程大孔吸附樹脂層析法 大孔樹脂的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，巨大的比表面積使其具有良好的吸附性能的白色的顆粒狀物質(zhì)。吸附原理 大孔吸附樹脂通過物理吸附（范德華引力或氫鍵）和

45、分子篩作用（多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)）而實(shí)現(xiàn)分離； 極性較大的化合物一般適用于中極性的樹脂上分離。 極性較小的化合物一般適用于非極性的樹脂上分離。洗脫液的選擇 洗脫劑選擇基本要求依據(jù)“相似相溶”原理。可選用水、不同濃度的MeOH、EtOH、Me2CO。 非極性大孔樹脂 洗脫劑極性越小，洗脫能力越強(qiáng)。 中極性大孔樹脂 用極性較大有機(jī)溶劑洗脫。大孔樹脂預(yù)處理與再生 預(yù)處理：MeOH 或Me2CO浸泡過夜，裝柱后連續(xù)洗滌至流出液加等量水無渾濁。 再生：乙醇浸泡24小時(shí)，用乙醇洗滌，至醇液中加水不呈白色混濁止。用2% NaOH浸泡、洗滌，水洗至中性，再用5% HCl浸泡、洗滌，然后水洗至中性。 另外，其存放時(shí)，應(yīng)

46、保持顆粒濕潤(rùn)，否則一旦顆粒干了則顆粒易碎，此時(shí)則大孔樹脂不能使用了。大孔吸附樹脂柱的洗脫洗 脫 柱得3瓶洗脫液203095硅膠柱氣相色譜法 氣相色譜與液相色譜相似，只是以氣體作流動(dòng)相，它的分離機(jī)理是基于物質(zhì)在流動(dòng)氣相和固定相（可為固體和液體）兩相間分配的不同而達(dá)到分離的方法。 農(nóng)藥殘留等的檢測(cè)載氣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)色譜柱檢測(cè)系統(tǒng)溫控系統(tǒng)高效液相色譜法 高效液相色譜的原理與一般液相色譜十分相似，樣品的分離取決于其在流動(dòng)相和固定相中的分配。 特點(diǎn)是使用高壓輸液泵進(jìn)行洗脫，并配備有紫外等檢測(cè)系統(tǒng)，使分離達(dá)到高速化和高效化。Thank you! 第三節(jié) 天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定 鑒定天然產(chǎn)物所需做的工作1、元素分

47、析 由哪些元素組成，各占多少。2、物理常數(shù) 熔、沸點(diǎn)3、比旋光度4、分子量、凝膠過濾法、光散射法、粘度測(cè)定法、MS等方法5、結(jié)構(gòu)測(cè)定法：紅外光譜、核磁共振（13C譜 、1H譜和二維譜）結(jié)構(gòu)測(cè)定的一般程序純度鑒定推測(cè)母體結(jié)構(gòu)類型功能基情況分子量分子式的確定波譜、化學(xué)方法推測(cè)出結(jié)構(gòu)式人工合成進(jìn)行確認(rèn)結(jié)構(gòu)測(cè)定 一、化學(xué)方法 二、儀器方法 波長(zhǎng)在200400nm分子吸收紫外線引起分子價(jià)鍵電子躍遷，由于價(jià)電子躍遷的能級(jí)固不同的而各異。 1、紫外光譜 飽和鍵 * 躍遷，不出現(xiàn)吸收帶。共軛雙鍵 *和n *躍遷。 紫外主要用于是否含有共軛體系的鑒定，如苯在256nm出現(xiàn)B帶。 OH 3600cm-1左右，因締

48、合，峰較寬；C=O 1700cm-1附近，隨所連基團(tuán)的供電子強(qiáng)弱而向上或向下移動(dòng)。 2、紅外光譜測(cè)定分子中存在的官能團(tuán)種類。 3、質(zhì)譜 確定分子量4、氫核磁共振譜 確定氫的個(gè)數(shù)及相互關(guān)系5、旋光光譜 具有旋光性的天然產(chǎn)物，測(cè)定其構(gòu)型和構(gòu)象6、元素分析 測(cè)定C、H、N、S元素含量。7、 核磁共振譜 確定分子骨架。 酚UV280nm，IR15001600、3300cm-1，溶于NaOH黃酮 黃色或淡黃結(jié)晶，UV240285nm及300400nm各一峰，IR在15001700cm-1有吸收。皂甙1H譜在高場(chǎng)有山峰形及幾個(gè)甲基尖峰信號(hào)。香豆素UV240260nm，IR15001600cm-1，有芳環(huán)吸

49、收； 320nm吡喃酮環(huán)結(jié)構(gòu)， 1700cm-1附近有不飽和內(nèi)酯吸收峰 ；1H譜主要為芳香質(zhì)子信號(hào)。 三、中藥指紋圖譜質(zhì)量控制 借助計(jì)算機(jī)、信息及先進(jìn)的物理、化學(xué)技術(shù)，將中藥的特性和有效成分，采用圖譜的形式描繪出來，從而鑒定真?zhèn)巍⒈嬲J(rèn)優(yōu)劣、確定其質(zhì)量和有效性。 紅外光譜指紋圖譜高效液相色譜-質(zhì)譜指紋圖譜氣相色譜-質(zhì)譜指紋圖譜質(zhì)譜指紋圖譜 紫外光譜指紋圖譜X-射線衍射指紋圖譜包括： 柚肉汁提取成分的高效液相色譜指紋圖譜 植物藥是多種化學(xué)成分的混合體，其藥效不是單一的組份能說明的，是多種活性組份共同起作用的，因此單一活性組份的測(cè)定和評(píng)價(jià)不能說明中藥質(zhì)量的好壞，而且目前很多檢測(cè)的指標(biāo)成分不具唯一性，

50、將西藥檢測(cè)的理念完全應(yīng)用于中藥存在以偏蓋全，割離整體作用的問題。 植物藥材的質(zhì)量隨產(chǎn)地、氣候、生產(chǎn)工藝而不同，建立一種代表性的整體性識(shí)別方式，將各種共同的特征用一個(gè)圖譜表現(xiàn)出來受到重視。 指紋圖譜是在某一方面從整體上來確定特定研究對(duì)象（如中藥材，提取物，飲片，注射液等）組成的一種方法，是一種模糊識(shí)辨方式。比較適合于中藥這種復(fù)雜體系的表征。但其也有局限性：1、圖譜反映的內(nèi)容不夠全面。2、圖譜與具體的成分結(jié)構(gòu)還有一定的差距。 應(yīng)用某種實(shí)用的方法，找出代表性相對(duì)更強(qiáng)的圖譜進(jìn)行表征是指紋圖譜研究的重點(diǎn)。 第四節(jié) 結(jié)構(gòu)研究法一、純度的測(cè)定二、結(jié)構(gòu)研究的主要程序三、結(jié)構(gòu)研究中采用的主要方法一、純度的測(cè)定純

51、度檢查法：均一的晶形敏銳的熔點(diǎn)、沸點(diǎn)、折光率、比旋度TLC、PC、GC、HPLC二、結(jié)構(gòu)研究的主要程序三、結(jié)構(gòu)研究中采用的主要方法1. 確定分子式，計(jì)算不飽和度2. 質(zhì)譜 （MS，mass spectrum）3. 紅外光譜（IR，infrared spectra）4. 紫外-可見吸收光譜（UV-vis) (ultraviolet-visible spectra）5. 核磁共振（NMR，nuclear magnetic resonance）6. 其他： x-單晶衍射法 旋光光譜（ORD） 園二色譜（CD） 三、結(jié)構(gòu)研究中采用的主要方法 1. 確定分子式，計(jì)算不飽和度分子式的確定元素定量分析結(jié)合分

52、子量測(cè)定同位素豐度比法高分辨質(zhì)譜（HR-MS，high resolution mass spectrum ） 不飽和度的計(jì)算u=/2/21 ：一價(jià)原子數(shù) 如H、X ：三價(jià)原子數(shù)，如N、P ：四價(jià)原子數(shù)，如C三、結(jié)構(gòu)研究中采用的主要方法 2. 質(zhì)譜 （MS，mass spectrum）作用：確定分子量、分子式提供部分結(jié)構(gòu)信息 丟失碎片的大小 如15、17 碎片的m/z及裂解方式三、結(jié)構(gòu)研究中采用的主要方法 2. 質(zhì)譜 （MS，mass spectrum）常用質(zhì)譜技術(shù)及特點(diǎn)電子轟擊質(zhì)譜（EI-MS，electron impact ionization）場(chǎng)解析質(zhì)譜（FD-MS，field desor

53、ption ionization） 快速原子轟擊質(zhì)譜（FAB-MS，fast atom bombardment）電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS，electrospray ionization） 基質(zhì)輔助激光解析質(zhì)譜（MALDI-MS） matrix-assisted laser desorption ionization 常用質(zhì)譜技術(shù)及特點(diǎn)電子轟擊質(zhì)譜（EI-MS）（electron impact ionization）樣品需加熱氣化，離化，得到M+難氣化、易熱解的成份測(cè)不到M+ 如糖、苷、氨基酸、肽、蛋白、核酸、抗生素 常用質(zhì)譜技術(shù)及特點(diǎn)場(chǎng)解析質(zhì)譜（FD-MS）試樣稀液涂于鎢絲上作陽極，對(duì)面加陰極

54、，通高壓，使電離難氣化、易熱解的成份，可得到 分子離子相關(guān)峰：MH+、MNa+、MK+ 逐個(gè)脫去糖基的碎片峰：MH-162+、MH-162-146+苷元的碎片離子相對(duì)少常用質(zhì)譜技術(shù)及特點(diǎn)快速原子轟擊質(zhì)譜（FAB-MS）離子槍發(fā)射高能離子與另一中性粒子碰撞，交換電荷， 形成高速中性粒子，與樣品碰撞，使其電離難氣化、易熱解的成份，可得到 分子離子相關(guān)峰：MH+、MNa+、MK+ 逐個(gè)脫去糖基的碎片峰：MH-162+、MH-162-146+ 可得到苷元的碎片常用質(zhì)譜技術(shù)及特點(diǎn)電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）強(qiáng)靜電場(chǎng)使試樣電離，難氣化、易熱解、大分子、小分子，均可得到 分子離子相關(guān)峰：MH+、MNa+、MK

55、+ 常用質(zhì)譜技術(shù)及特點(diǎn)基質(zhì)輔助激光解析質(zhì)譜（MALDI-MS）用于研究結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不易氣化的大分子物質(zhì)的分子量 如多糖、蛋白、核酸等 三、結(jié)構(gòu)研究中采用的主要方法 3. 紅外光譜（IR）原理： 化學(xué)鍵的振動(dòng)在紅外光區(qū)（4000625cm-1）引起的吸收譜圖作用： 特征頻率區(qū)（ 40001500 cm-1 ） 確定官能團(tuán)類型指紋區(qū)（ 1500600 cm-1 ） 構(gòu)象、構(gòu)型、取代模式等三、結(jié)構(gòu)研究中采用的主要方法 4. 紫外-可見吸收光譜（UV-vis)原理 電子由基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)（、n） 在紫外可見光區(qū)（200700nm）引起的吸收譜圖作用對(duì)含有共軛雙鍵、,-不飽和羰基、芳香化合物的結(jié)構(gòu)鑒定有重要價(jià)值特定的吸收譜特征骨架類型的判斷 如：黃酮、香豆素、蒽醌加診斷試劑前后譜圖的規(guī)律性變化取代圖式的推斷 如：黃酮、香豆素三、結(jié)構(gòu)研究中采用的主要方法5. 核磁共振（NMR）原理： 1H、13C等具有磁矩的原子在外加磁場(chǎng)中受電磁波照射，吸收一定能量電磁波，產(chǎn)生能級(jí)變化，引起核磁共振氫核磁共振（1H-NMR）碳核磁共振譜（13C-NMR）二維核磁共振譜 （2D-NMR）氫核磁共振（1H-NMR） 應(yīng)用： 提供H的類型、數(shù)目、相鄰原子團(tuán)的信息 四個(gè)參