血液代用品資料課件

1、生物產(chǎn)品工藝品第八章 血液代用品第八章 血液代用品8.1 概述8.2 全氟碳人工血液8.3 血紅蛋白類血液代用品8.4 血液代用品的發(fā)展前景8.1 概述血液的結(jié)構(gòu) 由細胞成分和非細胞成分組成。 細胞成分：紅細胞、白細胞和血小板 非細胞成分：稱為血漿，其中又包括膠體成分和晶體成分。 血液血細胞紅細胞白細胞血小板血漿 (細胞間質(zhì))水血漿蛋白、糖、維生素、激素、代謝產(chǎn)物及無機鹽等常規(guī)輸血的憂患 輸血時必須血型相配，延誤治療而造成死亡； 血液污染嚴重，威脅輸血安全； 健康供血人群不足，血液嚴重短缺； 血液的保存期短。 8.1 概述血液代用品定義 指具有攜帶氧擴容功能的溶液，即除了可用于失血補充和出血休

2、克的復蘇外，在臨床上還可用于血液稀釋等。8.1 概述人工血液代用品特點（1）安全，應無毒、無致病原、無污染、無免疫原性；（2）適合各種血型；（3）與人血液所有組分具有良好生物相容性，最大限度的替代人血的生理功能, （具備運輸氧、二氧化碳的能力，提供緩沖和自由基淬滅能力，可起到血漿擴容作用并維持膠體滲透壓)；（4）在血管內(nèi)有滿意的保留時間，代謝產(chǎn)物無毒并能經(jīng)正常渠道排出；（5）貯存時間長而所需條件低。 8.2 血紅蛋白的結(jié)構(gòu)和功能 血紅蛋白的結(jié)構(gòu)和功能； 影響血紅蛋白氧親和力的因素。Hb的組成與結(jié)構(gòu)Hb4條珠蛋白鏈：1412；1462 （共574個AA） 4分子血紅素每條多肽鏈結(jié)合一個血紅素分子

3、構(gòu)成一個Hb單位 Hb是四聚體，在紅細胞中占干重的95Hb的組成8.2 血紅蛋白結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)部分為珠蛋白（globin）、輔基為亞鐵血紅素(heme) 珠蛋白是由4條肽鏈組成，包括和亞基，形成22四聚體；血紅素輔基位于表面孔穴內(nèi)，每個亞基一個；在4個亞基間有一中央孔穴: 2,3-二磷酸甘油酸（ 2,3-DPG)位于其中，穩(wěn)定了脫氧血紅蛋白的結(jié)構(gòu), O2位于其中，穩(wěn)定了氧合血紅蛋白的結(jié)構(gòu)。血紅蛋白兩個肽鏈兩個一肽鏈四個亞鐵紅素基團每個肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團，此基團可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。血紅蛋白的特點：血紅蛋白功能 血紅蛋白在紅細胞內(nèi)能結(jié)合氧或釋放氧；

4、在肺部與氧結(jié)合形成氧和血紅蛋白（HbO2），轉(zhuǎn)運到全身各組織并釋放出氧。 將產(chǎn)生的二氧化碳以碳酸鹽的形式從組織中運出，從而完成肺和組織間O2和CO2的交換。血紅蛋白 對氧的親和力氧解離曲線 圖8-2 氧解離曲線P50血紅蛋白 對氧的親和力機制Hb的變構(gòu)效應 波爾效應 2，3-DPG的影響 影響血氧親和力的因素H+和CO2濃度增加促進氧分子的釋放(快速)Hb(H+ ) +4O2 Hb（O2）4+H+Hb(CO2)n +4O2 Hb（O2）4+nCO2 2，3-DPG作為別構(gòu)效應物降低脫氧血紅蛋白對氧的親和力。（代謝生成，反應較慢）Hb-2,3-DPG +4O2 Hb（O2）4+2,3-DPG都是

5、通過改變血紅蛋白的結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)血氧親和力。血紅蛋白氧解離曲線CO2pHDPG溫度CO2pHDPG溫度8.3 血液代用品的類型 無載氧功能的血管擴容劑（第一代紅細胞代用）； 全氟碳化合物、化學修飾血紅蛋白及基因重組血紅蛋白（第 二代血紅蛋白代用品）； 模擬天然紅細胞膜和紅細胞內(nèi)的生理環(huán)境，用仿生高分子材 料將血紅蛋白包裹起來，制備成“人工紅細胞”。（第三代血 液代用品）8.3.1 全氟碳人工血液概念 是一種具有載氧功能的人造血，是將碳氫化合物中的氫原子全部由氟原子代替，形成的類環(huán)狀或直鏈狀有機化合物。種類 全氟萘烷、全氟三丙胺、全氟三丁胺應用 用于急性貧血血液極端稀釋時，以維持機體組織的供氧，為輸血

6、爭取時間。全氟碳化合物全氟萘烷全氟碳人工血液優(yōu)點 無抗原性、無毒性；不依賴于過期或其它動物的血液，易于大量生產(chǎn)；純度易于控制。 缺點（1）只是氧的溶解劑，使用時患者必須呼吸足夠的氧氣才可保證氧氣溶解量；（2）循環(huán)時間短，高濃度使用可使血液粘度升高；（3）存放需要合適的溫度和條件；（4）流感樣癥狀。 8.3.2血紅蛋白類血液代用品 天然血紅蛋白； 血紅蛋白類血液代用品； 1）血紅蛋白的制備； 2）血紅蛋白的化學修飾。天然血紅蛋白（SFHS） 定義 是一種直接用紅細胞溶解產(chǎn)物來作為血液代用品，用過期的血液來制造，去除了基質(zhì)磷脂，是一種非細胞攜氧物質(zhì)。 又稱為無基質(zhì)血紅蛋白。 天然血紅蛋白（SFHS

7、）優(yōu)點 來源廣泛、符合人體生理需要； 無需進行交叉驗血、能去除病原、能長期儲存。 比全氟碳化合物更符合人體生理需要，來源廣泛；8.3.2血紅蛋白類血液代用品 血紅蛋白的制備樣品處理粗分離純化純度鑒定1.樣品處理：蛋白質(zhì)提取和分離步驟操作過程可選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液來分離血紅蛋白(1)紅細胞的洗滌:洗滌目的: 去除雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化，洗滌次數(shù)不可過少。洗滌操作：1、采集血樣。2、低速短時間離心（速度越高和時間越長，會使白細胞和淋巴細胞等一同沉淀，達不到分離的效果）3、吸取血漿：上層透明的黃色血漿。4、鹽水洗滌：用五倍體積的質(zhì)量分數(shù)為0.9的氯化鈉溶液洗滌。5、低速離

8、心（低速短時間）6、重復4、5步驟三次，直至上清液中已沒有黃色，表明洗滌干凈。初次離心后的結(jié)果次洗滌后的結(jié)果(2)血紅蛋白的釋放： 加蒸餾水到原血液體積，再加40體積的甲苯 ，置于磁力攪拌器上充分攪拌10分鐘（加速細胞破裂）,細胞破裂釋放出血紅蛋白。(3)分離血紅蛋白溶液： 過程：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10 min。試管中溶液層次：第1層（最上層）：甲苯層（無色透明）；第2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色薄層固體）；第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）；第4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）。分離：用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏

9、斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。(4)透析： 過程：取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/l的磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12小時。透析目的：除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)。原理：透析袋能使小分子自由進出，而大分子保留在袋內(nèi)。透析過程動畫演示利用透析袋透析裝配好的凝膠柱凝膠分離純化注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。收集得到的純化后的蛋白無基質(zhì)血紅蛋白（ SFH) 1）因SFH在血漿中很快從四聚體分解為二聚體或單體，易于通過腎臟，故其半衰期過短，僅2h-4h左右； 2)SH

10、F失去了2，3-DPG類物質(zhì)的變構(gòu)作用，其氧親和力明顯升高(氧離曲線P50下降)，故不利于向組織細胞釋放氧；3)因SFH可濾過至腎小管管腔，而高濃度的蛋白類物質(zhì)可引起管腔堵塞，導致腎功能受損；4)SFH具有膠體性質(zhì)，在血漿中可產(chǎn)生膠體滲透壓(COP)，在其血漿濃度與全血相同時，COP可達全血的2倍，故在常規(guī)應用時，其濃度最高只能在7 g； (5)Hb易氧化成高鐵Hb(MetHb)，失去攜氧能力并產(chǎn)生自由基。血紅蛋白類血液代用品 血紅蛋白的化學修飾 目的： 穩(wěn)定血紅蛋白4聚體結(jié)構(gòu)，增加蛋 白相對分子量，以達到降低毒性 的作用。原理： 表面有許多可修飾的功能基團類型：分子內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白、多聚血紅蛋

11、 白、共軛血紅蛋白、脂質(zhì)體包封血 紅蛋白；基因重組血紅蛋白圖8-3 血紅蛋白的修飾方法8.3.3 化學修飾血紅蛋白（第二代血液代用品）方法交聯(lián)血紅蛋白 聚合血紅蛋白 共軛連接血紅蛋白分子內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白血紅蛋白的化學修飾 血紅蛋白肽鏈間的交聯(lián)，降低氧的親和力。試劑：含有負電基團并能結(jié)合在血紅蛋白中心 腔位置，如雙阿司匹林類化合物（3， 5-二溴水楊基雙延胡索酸酯），吡哆醛 類化合物。產(chǎn)品：美國Baxter公司的DCLHb、加拿大 Hemosol公司的Hemolink分子內(nèi)交聯(lián)磷酸吡哆醛(PLP)是2，3-DPG的結(jié)構(gòu)類似物，可使Hb 亞基的氨基端Val吡哆醛化；與Hb 亞基的2,3-DPG結(jié)合位

12、點形成共價鍵可以降低氧親和力；但由此形成的四聚體不穩(wěn)定。為了克服PLP的缺點。人們后來合成了含有2個吡哆醛的雙醛基衍生物，降低天然Hb的氧親合力并阻止其解聚。雙阿司匹林交聯(lián)（DCL-Hb)3，5-二溴水楊酸在與琥珀酸或延胡索酸連接后形成雙阿司匹林(DBBF)，成為血紅蛋白賴氨酸的氨基共價交聯(lián)的碳橋。DBBF對脫氧血紅蛋白修飾效果較好，為-交聯(lián)，可產(chǎn)生一種穩(wěn)定的、高協(xié)同性和低氧親和力的雙阿司匹林交聯(lián)Hb(DCL-Hb)，其功能特征與人血液很相似，DCLHb血紅蛋白的化學修飾不少于97的聚合體的分子量為65kD一130kD， 低于5的聚合體分子量小于65kD。 臨床：患者出現(xiàn)皮膚黃染、無癥狀血尿、

13、腸梗 阻發(fā)生率顯著提高，三期臨床死亡率增加，于 1999年終止臨床試驗。Hemolink血紅蛋白的化學修飾 O-棉籽糖交聯(lián)血紅蛋白，由各種相對分子量的 聚合、非聚合成分組成，含交聯(lián)Hb大于95%。 臨床：三期已在美國、英國和加拿大開展。不良 反應是血壓升高，但在48-72小時內(nèi)恢復對肝腎功 能無影響。多聚血紅蛋白血紅蛋白的化學修飾在分子內(nèi)交聯(lián)的基礎上采用交聯(lián)劑使血紅蛋白分子之間聚合形成較大的分子； 交聯(lián)劑主要有戊二醛、乙醇醛、糖醛等。與血紅蛋白反應時無特異 的結(jié)合位點，屬于多位點修 飾，形成形成26個四聚體的聚合物。減少溶液中分子數(shù)目，溶液滲透壓和黏度也隨之降低，半衰期延長。多聚血紅蛋白采用戊

14、二醛多聚化牛Hb,產(chǎn)品：美國Biopure公司的Hemopure,被許可用于臨床。市場定價：800美元/200ml。Northfield Laboratories公司生產(chǎn)的Polyheme；戊二醛聚合人血紅蛋白，在制備過程中去除了大部分未聚合血紅蛋白，消除了大部分不良反應；缺點：原材料匱乏。共軛連接血紅蛋白將Hb四聚體與生物兼容性良好、能在血液循環(huán)系統(tǒng)中長時間停留的大分子相互連接;加大Hb的分子量，穩(wěn)定四聚體的結(jié)構(gòu)。采用的共軛物有聚氧乙烯（POE）、單甲氧聚氧乙烯(MPOE)、葡聚糖多聚糖類似物、聚乙二醇(PEG)等。大分子聚合物包裹在Hb周圍的高分子鏈覆蓋了抗原位點，起到了降低免疫原性?；瘜W

15、修飾存在的問題血紅蛋白的化學修飾 產(chǎn)品是非均一性混合物； 病原微生物尚未解決； 大分子的聚合體引起輕微腎毒性，引起血小板減少和白細胞減少癥等副作用； 終產(chǎn)物不穩(wěn)定性，導致交聯(lián)Hb間的重新排列； 重現(xiàn)率低，多聚體的多聚化會增加氧親和力并降低四聚體間協(xié)同作用。8.3.4 脂質(zhì)體包封血紅蛋白（第三代紅細胞代用品）思路：仿造天然紅細胞，制作“人工紅細胞”將高濃度的Hb包在脂質(zhì)體內(nèi),包裹于膜內(nèi)的Hb的四聚體不易解聚，因而載氧能力大，循環(huán)半衰期長，副作用小。采用磷脂制成雙分子層膜，加入膽固醇增加膜的韌性和穩(wěn)定性，加入2，3-DPG降低Hb的氧親和力，加入VE防止Hb的氧化。 脂質(zhì)體包封血紅蛋白血紅蛋白的化

16、學修飾制備的兩個基本條件： 1）制備過程中確保極易被氧化的血紅蛋白不被氧化； 2）脂質(zhì)體包封血紅蛋白及其輔助成分在制備和保存過程中有足夠的穩(wěn)定性，并使脂質(zhì)體包封血紅蛋白的循環(huán)存留時間延長。工藝發(fā)展脂質(zhì)體包封血紅蛋白工藝的發(fā)展血紅蛋白的化學修飾第一代脂質(zhì)體：從雞蛋、大豆中提取的不飽和脂肪酸、膽固醇以及維生素E等造成：1）半衰期短；2）不飽和脂質(zhì)在血漿中的氧化使血紅蛋白被氧化成高鐵血紅蛋白。第二代脂質(zhì)體：長鏈飽和磷脂（氫化大豆卵磷脂），延長半衰期，降低了脂質(zhì)過氧化，但存在溶血磷脂等雜質(zhì)。后來改為使用高純度的合成二硬脂酰卵磷脂，但磷脂雙層與血紅蛋白相互作用，引起血小板活化因子濃度升高。脂質(zhì)體包封血紅

17、蛋血紅蛋白的化學修飾第三代：第二代脂質(zhì)體包封血紅蛋白和凍干保存方法相結(jié)合。用海藻糖或蔗糖做凍干保護劑，可在長期保存中保持脂質(zhì)體包封血紅蛋白形態(tài)穩(wěn)定，達到“即用型”血液替代品的目標。 日本研制的NRC（Terumo公司-泰爾茂 )主要不良反應是被網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞吞噬，抑制網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)功能，使機體免疫功能受損，易引起感染性休克等。生產(chǎn)成本遠高于全血。基因重組血紅蛋白（rHb)血紅蛋白的化學修飾通過酵母、昆蟲、轉(zhuǎn)基因動物、植物進行重組血紅蛋白的表達。具有人為控制血紅蛋白產(chǎn)量及從根本上消除病毒污染的有點?；虿呗裕?）使紅細胞蛋白亞基間串聯(lián)；2）利用氫鍵、疏水作用力等穩(wěn)定四聚體；3）將特定氨基酸突變?yōu)榘腚?/p>

18、氨酸使形成鏈間二硫鍵。存在問題：表達量低。關(guān)鍵環(huán)節(jié)：構(gòu)建表達的rHb工程菌；提高分離純化技術(shù)。血液代用品發(fā)展現(xiàn)狀（一）產(chǎn)品名稱生產(chǎn)商采用技術(shù)研究進展PHP共軛物美國Apex Bioscience公司吡哆醛修飾聚氧乙烯共扼人血紅蛋白I期臨床HemAssist美國BAXTER公司雙阿司匹林交聯(lián)人血紅蛋白III期臨床Opero美國SOMATOGEN公司基因工程交聯(lián)人血紅蛋白III期臨床PEG-Hb美國ENZON公司PEG表面修飾牛血紅蛋白II期臨床Polyheme美國Northfield Lab公司戊二醛聚合人血紅蛋白III期臨床Hemopure美國Biopure公司戊二醛聚合牛血紅蛋白已在南非上市；在美國已批準用于動物治療；III期臨床結(jié)束，已申報生產(chǎn)許可Hemolink加拿大HEMOSOL公司棉籽糖聚合人血紅蛋白III期臨床Neo red ce