造血干細胞的發(fā)育調控和分子機制研究

1、造血干細胞的發(fā)育調控和分子機制研究 研究方向1：造血發(fā)育調控研究方向2：白血病治療的分子機制研究 造血（hematopoiesis） 造血干細胞(hematopoietic stem cell)分化為早期祖細胞(primitive progenitor cell) ，經(jīng)大量增殖分化成為晚期祖細胞(late progenitor cell)，然后再分化為具有特異形態(tài)的、骨髓中不同系別的前體細胞(precursor cell)，最后分化成為各類具有生理功能的血細胞的整個過程稱為“造血” 。骨髓中各類前體細胞是各系祖細胞分化走向成熟的過渡形態(tài)。造血不包括成熟血細胞在體內(nèi)儲存、釋放、分配和凋亡的過程。

2、第一節(jié) 造血器官人體的造血器官是生成血液的器官。起源于中胚葉，主要包括骨髓、胸腺、淋巴結、 肝臟和脾等。造血過程分為胚胎期造血和出生后造血。一、胚胎期造血器官人類的血液細胞首先在卵黃囊中形成，肝、脾、胸腺和骨髓均參與造血根據(jù)發(fā)育過程中造血中心的轉移，胚胎期造血分為三個時期： 卵黃囊造血期 、肝造血期 、骨髓造血期 1. 卵黃囊造血期（中胚葉造血期）始于人胚胎3周左右，卵黃囊壁上的中胚層細胞開始分化聚集成團，稱為血島（blood island）。血島是人類最初的造血中心。血島外周的細胞分化為血管內(nèi)皮細胞。血島中央的細胞形成多能造血干細胞，繼爾分化成幼稚紅細胞，以后大量的多能造血干細胞遷移至肝、脾

3、、骨髓和淋巴組織繼續(xù)增殖、分化為干細胞。胚胎 2個月后，卵黃囊逐漸退化、萎縮，被肝、脾取代其造血功能。 2肝造血期 始于胚胎第6周，是卵黃囊血島的造血干細胞移植到肝臟的結果，以造紅細胞為主，后期可生成粒細胞和巨核細胞。肝臟是胚胎25個月的造血中心，持續(xù)至第7個月時，逐漸被骨髓造血替代。此外脾、胸腺、淋巴結等也參與造血。 3骨髓造血期 自胚胎第14周骨髓開始造血，5個月以后成為胚胎期的造血中心。骨髓中的造血干細胞來源于肝、脾，可維持終生。胚胎期的骨髓主要生成紅細胞、粒細胞和巨核細胞，也生成淋巴細胞和單核細胞。 胚胎期造血的三個時期不能截然分開，此消彼長，互為交錯。二、出生后造血出生后造血主要靠骨

4、髓。在正常情況下骨髓是唯一能產(chǎn)生紅細胞、粒細胞和血小板的場所，也生成淋巴細胞和單核細胞。脾和淋巴結為終生制造淋巴細胞的器官。 1骨髓 骨髓是位于骨髓腔內(nèi)的海綿樣膠狀組織，有紅骨髓和黃骨髓之分。嬰幼兒的骨髓幾乎都參與造血，即全為紅骨髓。約從5歲開始，長骨的髓腔內(nèi)出現(xiàn)脂肪細胞，隨年齡增長，長骨遠端的紅骨髓轉化為黃骨髓。成人的紅骨髓和黃骨髓約各占50%，但黃骨髓仍有造血潛能，當機體需要時又轉變?yōu)榧t骨髓而參與造血。 2. 淋巴器官 分為中樞淋巴器官和周圍淋巴器官。中樞淋巴器官主要包括胸腺和骨髓，主導淋巴細胞的產(chǎn)生、增殖、分化和成熟。周圍淋巴器官主要包括淋巴結、脾、腸粘膜相關淋巴組織等，是淋巴細胞聚集和

5、免疫應答發(fā)生的場所。 3. 髓外造血正常情況下，胎兒出生2個月以后，骨髓以外的組織如肝、脾淋巴結等不再制造紅細胞、粒細胞和血小板。但在某些病理情況下，如骨髓纖維化、骨髓增生性疾病及某些貧血，這些組織又恢復造血功能（?？蓪е孪鄳鞴倌[大），稱為髓外造血。 一、造血細胞的生長發(fā)育 是一個連續(xù)不斷的復雜過程，造血器官內(nèi)的各種造血細胞在造血微環(huán)境中通過細胞與細胞之間相互作用，在各種細胞因子的誘導下，按一定的規(guī)律發(fā)育成為各種成熟的血細胞，然后釋放入血循環(huán)中。第二節(jié) 造血干/祖細胞的生長發(fā)育、特性以及造血調控 （一）基本過程 造血細胞的生長發(fā)育包括增殖、分化、成熟和釋放四個方面。多種調節(jié)因素控制該過程，維

6、持血細胞數(shù)量和質量穩(wěn)定。造血細胞的增殖（proliferation） 是指血細胞通過分裂而使其數(shù)量增加的過程。有絲分裂是造血細胞的主要增殖方式。 造血細胞的分化（differentiation）細胞發(fā)育過程中失去某些潛能而獲得新功能的過程，即由多潛能轉變?yōu)閱螡撃艿倪^程。分裂后的細胞在形態(tài)和功能上產(chǎn)生新的特征，分化過程是不可逆的。 造血細胞的成熟（maturation）造血干細胞定向分化，從原始經(jīng)幼稚到成熟細胞的發(fā)育過程。血細胞越成熟其形態(tài)越易辨認，功能也日趨完善。成熟的血細胞在骨髓內(nèi)通過“髓血屏障”釋放入血循環(huán)中。（二）造血細胞生長發(fā)育階段 根據(jù)造血細胞的功能和形態(tài)特征，造血細胞生長發(fā)育階段可

7、分為： 造血干細胞、 造血祖細胞、 原始及幼稚細胞造血干細胞階段造血祖細胞階段原始及幼稚細胞階段成熟細胞二、造血干祖細胞干細胞（stem cell）是具有自我復制和多向分化能力的細胞。早期胚胎中的原始生殖細胞即胚胎干細胞，具有廣泛的發(fā)育和分化潛能，稱為全能干細胞（totipotent hematopoietic stem cell，THSC）。胚胎干細胞分化為各類組織干細胞，造血組織中存在造血干細胞、血管干細胞和間質干細胞。（一）造血干細胞造血干細胞又稱多能干細胞，由中胚層細胞分化而來，是各種血細胞的始祖，具有高度自我更新、多向分化和增殖能力，并且在造血組織中含量極少，其形態(tài)酷似小淋巴樣細胞而

8、難以辨認。 （1）自我更新 即細胞通過有絲分裂產(chǎn)生的兩個子代細胞與親代細胞具有相同的特征。造血干細胞的自我更新是維持其數(shù)量平衡的基礎，亦稱自我維持。高度的自我更新能力是造血干細胞最基本的生物學特征之一。（2） 造血干細胞靜止狀態(tài) 干細胞95%以上細胞處于G0期靜止狀態(tài)，不進行DNA合成和有絲分裂，當機體發(fā)生缺氧、感染、失血和創(chuàng)傷等應激狀態(tài)時，干細胞從靜止進入增殖的數(shù)量增加，以滿足機體對造血的需求。 （3） 造血干細胞全能性（多向分化） 分化是不可逆的，一旦定向分化為某種祖細胞，就不可能再變成其它的祖細胞。 造血干細胞在特定的條件下可以分化成紅細胞、粒細胞、單核細胞、血小板、組織嗜堿細胞、T淋巴

9、細胞、B淋巴細胞及自然殺傷細胞等的祖細胞。（4） 造血干細胞不均一性 造血干細胞有增殖態(tài)與靜止態(tài)之分，并且不斷地在靜止和增殖態(tài)之間轉換。造血干細胞代齡（有絲分裂的次數(shù)）不同構成了干細胞群體的代齡結構，形成干細胞不均一性。 2造血干細胞檢測 單個細胞在生物體內(nèi)有能力長期重建造血是判斷該細胞為造血干細胞的“金標準”。造血干細胞的數(shù)量極少，形態(tài)上不能區(qū)別，干細胞抗原性弱，僅有很少表面抗原。 （1）脾集落測試法 1961年Till等首先采用體內(nèi)試驗小鼠脾集落形成間接證明了造血干細胞的存在：將受體小鼠以致死劑量射線照射后，破壞全部造血細胞，再輸以供體骨髓或血液，小鼠能存活，并在受體小鼠脾中形成紅系、粒系

10、、巨核系細胞結節(jié)，這些都是由單個細胞增殖分化而來，即脾集落形成單位（CFU-S）；將脾結節(jié)細胞靜脈注射給受體小鼠，該小鼠也能存活。證實了骨髓或血液中存在血液細胞的祖先細胞。（2）單克隆抗體法 利用FACS自動細胞分選系統(tǒng)分選出CD34+CD38+及CD34+CD38亞群細胞，在無血清體系中加入各種細胞因子（如SCF、IL-3、IL-6、GM-CSF及Epo）刺激，結果表明，CD34+ CD38單個細胞可形成原代集落，并可向紅系、粒系、巨噬系、巨核系等 細胞分化。CD34+CD38細胞的性能接近于造血干細胞，同時也證明了造血干細胞具有多向分化的能力。 （3） 造血干細胞的表面標記的流式細胞儀檢測

11、CD34+ 細胞具有長期重建造血的能力；CD34+ CD38細胞比CD34+ 細胞具有更強的長期造血能力；AC 133+細胞也被認為是早期造血細胞的標志。（二）造血祖細胞造血干細胞進一步分化為各種造血祖細胞（hematopoietic progenitor cell）。造血祖細胞是一類由造血干細胞分化而來，但失去自我更新能力的過渡性、增殖性的細胞群，過去稱為定向干細胞。造血祖細胞根據(jù)其分化能力，可分為多向祖細胞和單向祖細胞。多向祖細胞可進一步分化 為單向祖細胞。通過體外造血細胞半固體培養(yǎng)證實了造血祖細胞的存在。紅細胞爆式集落形成單位 （BFU-E）紅細胞的祖細胞體外培養(yǎng)紅細胞集落形成單位 (C

12、FU-E)（三）造血干祖細胞的臨床應用 造血干祖細胞移植主要應用于：1.血液系統(tǒng)惡性腫瘤，如急、慢性白血病等；2.血液系統(tǒng)非惡性腫瘤性疾病，如再生障礙性貧血、異常血紅蛋白病、Fanconi貧血、難治性貧血等；3.實體腫瘤化療后造血重建，如乳腺癌、卵巢癌、神經(jīng)母細胞瘤等；4.其他，如重癥聯(lián)合免疫缺陷癥、自身免疫性疾病、基因治療等。 三、造血調控造血細胞的增殖、分化受控于不同的調控系統(tǒng)，以保持各種血細胞數(shù)量和質量的相對穩(wěn)定。其中細胞因子的調控占重要地位。細胞因子（cytokines）是一組基因編碼的低分子量蛋白質細胞外信號分子，有的是糖蛋白，有的則不含糖基，在機體內(nèi)含量極低，半衰期短，主要功能是在

13、細胞間傳遞信息，從而影響造血活動。（一）集落刺激因子類( colony-stimulating factors, CSFs ) 主要有以下幾種：1.紅細胞生成素（erythropoietin，EPO） 刺激紅系祖細胞的增殖和分化，以提高紅細胞數(shù)量。2.粒細胞集落刺激因子(G-CSF) 除促進粒系祖細胞形成集落外，G-CSF可誘導某些白血病細胞株分化成熟，激活中性粒細胞的吞噬功能。3.粒巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF) 除了促進中性粒細胞、單核細胞祖細胞增殖、分化 成熟外，對成熟細胞也產(chǎn)生作用。4.巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF） 促進單核系祖細胞的增殖和分化，激活巨噬細胞的吞噬和分泌功能

14、。5.多系集落刺激因子（multi-CSF） 促進多系集落生長。6.血小板生成素（thrombopoietin, TPO） 促進巨核細胞集落形成。（二）白細胞介素（interleukin, IL)白細胞介素主要是白細胞產(chǎn)生的信號分子，不僅在免疫系統(tǒng)中傳遞信息，同時也參與造血系統(tǒng)的造血調控。（三）其它細胞因子1.干細胞因子（stem cell factor, SCF） 又稱肥大細胞生長因子 促進肥大細胞生長；協(xié)同促進造血干祖細胞增殖、分化。2FLT-3配基(FLT-3 ligand, FL) 誘導處于靜止期的造血干祖細胞進人細胞周期，促進其擴增。1原癌基因 如：c-myc基因、ras相關基因、c

15、-abl基因、bcl-2 基因、c-kit基因等。（四）造血基因調控 原癌基因的編碼產(chǎn)物可為：細胞因子、細胞因子受體、細胞內(nèi)蛋白激酶、細胞內(nèi)信號傳遞分子及轉錄因子等。 2. 抑癌基因 如：p53基因、WT1基因、NF1基因、DCC、Rb基因等。抑癌基因編碼產(chǎn)物通常為細胞增殖負調節(jié)因子，抑制細胞增殖、誘導終末分化、維持基因穩(wěn)定、誘導細胞凋亡等。 3. 轉錄因子參與信號轉導的調控 對造血中基本的基因調控機制 仍存在若干懸念有待研究：（1）如何在細胞周期G1與G0之間來回轉換，并保持絕大多數(shù)細胞處于G0靜止狀態(tài)? （2）干細胞不對稱有絲分裂在基因水平上是怎樣實現(xiàn)的?（3）干/祖細胞基因怎樣調控各類受

16、體表達，以接受造血微環(huán)境中各種正負信號的影響?（4）干細胞在基因水平如何調控向淋巴系或髓系分化?祖細胞基因如何決定分化方向?怎樣保持各系之間正常恒定比例? 第三節(jié) 造血干祖細胞體外培養(yǎng)技術 體內(nèi)造血干祖細胞在一個極復雜的造血微環(huán)境中增殖、分化生成血液細胞。體外造血祖細胞培養(yǎng)就是在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，將從機體中分離出的造血祖細胞進行培養(yǎng)，使之生存、增殖分化。 造血祖細胞培養(yǎng)的主要應用：1）檢測造血祖細胞在骨髓、外周血和臍血中的數(shù)量2）研究體外造血祖細胞類型、特性及生理意義3）利用人工培養(yǎng)條件易于嚴格控制的特點，研究造 血調節(jié)；4）用于造血系統(tǒng)疾病發(fā)生機制，診斷、預后判斷、 療效觀察及治療藥物

17、的選擇等方面的研究。一、造血干祖細胞體外培養(yǎng)的基本條件（一）細胞培養(yǎng)室條件（二）培養(yǎng)的支持物（三）營養(yǎng)液（四）細胞因子（五）血清 二、造血干祖細胞體外培養(yǎng)（一）造血祖細胞集落培養(yǎng)：（1）分離培養(yǎng)細胞，制成單個核細胞懸液。（2）配制培養(yǎng)體系：按比例將培養(yǎng)液、細胞、血清、細胞因子加入到培養(yǎng)體系，混勻。（3）將配制的培養(yǎng)體系在37水浴中保溫10min。（4）將瓊脂等支持物煮沸融化（甲基纖維素不需加熱）。（5）待支持物降至40左右，加入培養(yǎng)體系并混勻。（6）將混勻后的培養(yǎng)體系加入培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板孔內(nèi)，一般平行做3份。（7）于5% CO2、飽和濕度及37溫箱內(nèi)孵育。BFU-E需14天，CFU-E需7天。（

18、8）觀察結果。（一）紅系祖細胞誘導分化的液體培養(yǎng)：MediumFBSEPOStem cell factorIL3FVA CELLS: an in vitro system to study erythroblast differentiation0h12h24h44hFVA cells: Briefly, 10 days after infection with 104 spleen focus-forming units of the anemia-inducing strain of Friend leukemia virus (FVA), female CDF-1 mice were killed, and proerythroblasts (spleen origin) were purified and cultured.Koury MJ,et al. J Cell Physiol 1984, 121:526532.Lee G,et al. Blood, 2003,101, 1790-1797. High amount of enucleating erythroblas