造血干細(xì)胞的發(fā)育調(diào)控和分子機(jī)制研究

1、造血干細(xì)胞的發(fā)育調(diào)控和分子機(jī)制研究 研究方向1：造血發(fā)育調(diào)控研究方向2：白血病治療的分子機(jī)制研究 造血（hematopoiesis） 造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell)分化為早期祖細(xì)胞(primitive progenitor cell) ，經(jīng)大量增殖分化成為晚期祖細(xì)胞(late progenitor cell)，然后再分化為具有特異形態(tài)的、骨髓中不同系別的前體細(xì)胞(precursor cell)，最后分化成為各類具有生理功能的血細(xì)胞的整個(gè)過(guò)程稱為“造血” 。骨髓中各類前體細(xì)胞是各系祖細(xì)胞分化走向成熟的過(guò)渡形態(tài)。造血不包括成熟血細(xì)胞在體內(nèi)儲(chǔ)存、釋放、分配和凋亡的過(guò)程。

2、第一節(jié) 造血器官人體的造血器官是生成血液的器官。起源于中胚葉，主要包括骨髓、胸腺、淋巴結(jié)、 肝臟和脾等。造血過(guò)程分為胚胎期造血和出生后造血。一、胚胎期造血器官人類的血液細(xì)胞首先在卵黃囊中形成，肝、脾、胸腺和骨髓均參與造血根據(jù)發(fā)育過(guò)程中造血中心的轉(zhuǎn)移，胚胎期造血分為三個(gè)時(shí)期： 卵黃囊造血期 、肝造血期 、骨髓造血期 1. 卵黃囊造血期（中胚葉造血期）始于人胚胎3周左右，卵黃囊壁上的中胚層細(xì)胞開始分化聚集成團(tuán)，稱為血島（blood island）。血島是人類最初的造血中心。血島外周的細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞。血島中央的細(xì)胞形成多能造血干細(xì)胞，繼爾分化成幼稚紅細(xì)胞，以后大量的多能造血干細(xì)胞遷移至肝、脾

3、、骨髓和淋巴組織繼續(xù)增殖、分化為干細(xì)胞。胚胎 2個(gè)月后，卵黃囊逐漸退化、萎縮，被肝、脾取代其造血功能。 2肝造血期 始于胚胎第6周，是卵黃囊血島的造血干細(xì)胞移植到肝臟的結(jié)果，以造紅細(xì)胞為主，后期可生成粒細(xì)胞和巨核細(xì)胞。肝臟是胚胎25個(gè)月的造血中心，持續(xù)至第7個(gè)月時(shí)，逐漸被骨髓造血替代。此外脾、胸腺、淋巴結(jié)等也參與造血。 3骨髓造血期 自胚胎第14周骨髓開始造血，5個(gè)月以后成為胚胎期的造血中心。骨髓中的造血干細(xì)胞來(lái)源于肝、脾，可維持終生。胚胎期的骨髓主要生成紅細(xì)胞、粒細(xì)胞和巨核細(xì)胞，也生成淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。 胚胎期造血的三個(gè)時(shí)期不能截然分開，此消彼長(zhǎng)，互為交錯(cuò)。二、出生后造血出生后造血主要靠骨

4、髓。在正常情況下骨髓是唯一能產(chǎn)生紅細(xì)胞、粒細(xì)胞和血小板的場(chǎng)所，也生成淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。脾和淋巴結(jié)為終生制造淋巴細(xì)胞的器官。 1骨髓 骨髓是位于骨髓腔內(nèi)的海綿樣膠狀組織，有紅骨髓和黃骨髓之分。嬰幼兒的骨髓幾乎都參與造血，即全為紅骨髓。約從5歲開始，長(zhǎng)骨的髓腔內(nèi)出現(xiàn)脂肪細(xì)胞，隨年齡增長(zhǎng)，長(zhǎng)骨遠(yuǎn)端的紅骨髓轉(zhuǎn)化為黃骨髓。成人的紅骨髓和黃骨髓約各占50%，但黃骨髓仍有造血潛能，當(dāng)機(jī)體需要時(shí)又轉(zhuǎn)變?yōu)榧t骨髓而參與造血。 2. 淋巴器官 分為中樞淋巴器官和周圍淋巴器官。中樞淋巴器官主要包括胸腺和骨髓，主導(dǎo)淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生、增殖、分化和成熟。周圍淋巴器官主要包括淋巴結(jié)、脾、腸粘膜相關(guān)淋巴組織等，是淋巴細(xì)胞聚集和

5、免疫應(yīng)答發(fā)生的場(chǎng)所。 3. 髓外造血正常情況下，胎兒出生2個(gè)月以后，骨髓以外的組織如肝、脾淋巴結(jié)等不再制造紅細(xì)胞、粒細(xì)胞和血小板。但在某些病理情況下，如骨髓纖維化、骨髓增生性疾病及某些貧血，這些組織又恢復(fù)造血功能（?？蓪?dǎo)致相應(yīng)器官腫大），稱為髓外造血。 一、造血細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育 是一個(gè)連續(xù)不斷的復(fù)雜過(guò)程，造血器官內(nèi)的各種造血細(xì)胞在造血微環(huán)境中通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞之間相互作用，在各種細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下，按一定的規(guī)律發(fā)育成為各種成熟的血細(xì)胞，然后釋放入血循環(huán)中。第二節(jié) 造血干/祖細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、特性以及造血調(diào)控 （一）基本過(guò)程 造血細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育包括增殖、分化、成熟和釋放四個(gè)方面。多種調(diào)節(jié)因素控制該過(guò)程，維

6、持血細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量穩(wěn)定。造血細(xì)胞的增殖（proliferation） 是指血細(xì)胞通過(guò)分裂而使其數(shù)量增加的過(guò)程。有絲分裂是造血細(xì)胞的主要增殖方式。 造血細(xì)胞的分化（differentiation）細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中失去某些潛能而獲得新功能的過(guò)程，即由多潛能轉(zhuǎn)變?yōu)閱螡撃艿倪^(guò)程。分裂后的細(xì)胞在形態(tài)和功能上產(chǎn)生新的特征，分化過(guò)程是不可逆的。 造血細(xì)胞的成熟（maturation）造血干細(xì)胞定向分化，從原始經(jīng)幼稚到成熟細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程。血細(xì)胞越成熟其形態(tài)越易辨認(rèn)，功能也日趨完善。成熟的血細(xì)胞在骨髓內(nèi)通過(guò)“髓血屏障”釋放入血循環(huán)中。（二）造血細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育階段 根據(jù)造血細(xì)胞的功能和形態(tài)特征，造血細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育階段可

7、分為： 造血干細(xì)胞、 造血祖細(xì)胞、 原始及幼稚細(xì)胞造血干細(xì)胞階段造血祖細(xì)胞階段原始及幼稚細(xì)胞階段成熟細(xì)胞二、造血干祖細(xì)胞干細(xì)胞（stem cell）是具有自我復(fù)制和多向分化能力的細(xì)胞。早期胚胎中的原始生殖細(xì)胞即胚胎干細(xì)胞，具有廣泛的發(fā)育和分化潛能，稱為全能干細(xì)胞（totipotent hematopoietic stem cell，THSC）。胚胎干細(xì)胞分化為各類組織干細(xì)胞，造血組織中存在造血干細(xì)胞、血管干細(xì)胞和間質(zhì)干細(xì)胞。（一）造血干細(xì)胞造血干細(xì)胞又稱多能干細(xì)胞，由中胚層細(xì)胞分化而來(lái)，是各種血細(xì)胞的始祖，具有高度自我更新、多向分化和增殖能力，并且在造血組織中含量極少，其形態(tài)酷似小淋巴樣細(xì)胞而

8、難以辨認(rèn)。 （1）自我更新 即細(xì)胞通過(guò)有絲分裂產(chǎn)生的兩個(gè)子代細(xì)胞與親代細(xì)胞具有相同的特征。造血干細(xì)胞的自我更新是維持其數(shù)量平衡的基礎(chǔ)，亦稱自我維持。高度的自我更新能力是造血干細(xì)胞最基本的生物學(xué)特征之一。（2） 造血干細(xì)胞靜止?fàn)顟B(tài) 干細(xì)胞95%以上細(xì)胞處于G0期靜止?fàn)顟B(tài)，不進(jìn)行DNA合成和有絲分裂，當(dāng)機(jī)體發(fā)生缺氧、感染、失血和創(chuàng)傷等應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，干細(xì)胞從靜止進(jìn)入增殖的數(shù)量增加，以滿足機(jī)體對(duì)造血的需求。 （3） 造血干細(xì)胞全能性（多向分化） 分化是不可逆的，一旦定向分化為某種祖細(xì)胞，就不可能再變成其它的祖細(xì)胞。 造血干細(xì)胞在特定的條件下可以分化成紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、血小板、組織嗜堿細(xì)胞、T淋巴

9、細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞等的祖細(xì)胞。（4） 造血干細(xì)胞不均一性 造血干細(xì)胞有增殖態(tài)與靜止態(tài)之分，并且不斷地在靜止和增殖態(tài)之間轉(zhuǎn)換。造血干細(xì)胞代齡（有絲分裂的次數(shù)）不同構(gòu)成了干細(xì)胞群體的代齡結(jié)構(gòu)，形成干細(xì)胞不均一性。 2造血干細(xì)胞檢測(cè) 單個(gè)細(xì)胞在生物體內(nèi)有能力長(zhǎng)期重建造血是判斷該細(xì)胞為造血干細(xì)胞的“金標(biāo)準(zhǔn)”。造血干細(xì)胞的數(shù)量極少，形態(tài)上不能區(qū)別，干細(xì)胞抗原性弱，僅有很少表面抗原。 （1）脾集落測(cè)試法 1961年Till等首先采用體內(nèi)試驗(yàn)小鼠脾集落形成間接證明了造血干細(xì)胞的存在：將受體小鼠以致死劑量射線照射后，破壞全部造血細(xì)胞，再輸以供體骨髓或血液，小鼠能存活，并在受體小鼠脾中形成紅系、粒系

10、、巨核系細(xì)胞結(jié)節(jié)，這些都是由單個(gè)細(xì)胞增殖分化而來(lái)，即脾集落形成單位（CFU-S）；將脾結(jié)節(jié)細(xì)胞靜脈注射給受體小鼠，該小鼠也能存活。證實(shí)了骨髓或血液中存在血液細(xì)胞的祖先細(xì)胞。（2）單克隆抗體法 利用FACS自動(dòng)細(xì)胞分選系統(tǒng)分選出CD34+CD38+及CD34+CD38亞群細(xì)胞，在無(wú)血清體系中加入各種細(xì)胞因子（如SCF、IL-3、IL-6、GM-CSF及Epo）刺激，結(jié)果表明，CD34+ CD38單個(gè)細(xì)胞可形成原代集落，并可向紅系、粒系、巨噬系、巨核系等 細(xì)胞分化。CD34+CD38細(xì)胞的性能接近于造血干細(xì)胞，同時(shí)也證明了造血干細(xì)胞具有多向分化的能力。 （3） 造血干細(xì)胞的表面標(biāo)記的流式細(xì)胞儀檢測(cè)

11、CD34+ 細(xì)胞具有長(zhǎng)期重建造血的能力；CD34+ CD38細(xì)胞比CD34+ 細(xì)胞具有更強(qiáng)的長(zhǎng)期造血能力；AC 133+細(xì)胞也被認(rèn)為是早期造血細(xì)胞的標(biāo)志。（二）造血祖細(xì)胞造血干細(xì)胞進(jìn)一步分化為各種造血祖細(xì)胞（hematopoietic progenitor cell）。造血祖細(xì)胞是一類由造血干細(xì)胞分化而來(lái)，但失去自我更新能力的過(guò)渡性、增殖性的細(xì)胞群，過(guò)去稱為定向干細(xì)胞。造血祖細(xì)胞根據(jù)其分化能力，可分為多向祖細(xì)胞和單向祖細(xì)胞。多向祖細(xì)胞可進(jìn)一步分化 為單向祖細(xì)胞。通過(guò)體外造血細(xì)胞半固體培養(yǎng)證實(shí)了造血祖細(xì)胞的存在。紅細(xì)胞爆式集落形成單位 （BFU-E）紅細(xì)胞的祖細(xì)胞體外培養(yǎng)紅細(xì)胞集落形成單位 (C

12、FU-E)（三）造血干祖細(xì)胞的臨床應(yīng)用 造血干祖細(xì)胞移植主要應(yīng)用于：1.血液系統(tǒng)惡性腫瘤，如急、慢性白血病等；2.血液系統(tǒng)非惡性腫瘤性疾病，如再生障礙性貧血、異常血紅蛋白病、Fanconi貧血、難治性貧血等；3.實(shí)體腫瘤化療后造血重建，如乳腺癌、卵巢癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等；4.其他，如重癥聯(lián)合免疫缺陷癥、自身免疫性疾病、基因治療等。 三、造血調(diào)控造血細(xì)胞的增殖、分化受控于不同的調(diào)控系統(tǒng)，以保持各種血細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量的相對(duì)穩(wěn)定。其中細(xì)胞因子的調(diào)控占重要地位。細(xì)胞因子（cytokines）是一組基因編碼的低分子量蛋白質(zhì)細(xì)胞外信號(hào)分子，有的是糖蛋白，有的則不含糖基，在機(jī)體內(nèi)含量極低，半衰期短，主要功能是在

13、細(xì)胞間傳遞信息，從而影響造血活動(dòng)。（一）集落刺激因子類( colony-stimulating factors, CSFs ) 主要有以下幾種：1.紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO） 刺激紅系祖細(xì)胞的增殖和分化，以提高紅細(xì)胞數(shù)量。2.粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF) 除促進(jìn)粒系祖細(xì)胞形成集落外，G-CSF可誘導(dǎo)某些白血病細(xì)胞株分化成熟，激活中性粒細(xì)胞的吞噬功能。3.粒巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF) 除了促進(jìn)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞祖細(xì)胞增殖、分化 成熟外，對(duì)成熟細(xì)胞也產(chǎn)生作用。4.巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF） 促進(jìn)單核系祖細(xì)胞的增殖和分化，激活巨噬細(xì)胞的吞噬和分泌功能

14、。5.多系集落刺激因子（multi-CSF） 促進(jìn)多系集落生長(zhǎng)。6.血小板生成素（thrombopoietin, TPO） 促進(jìn)巨核細(xì)胞集落形成。（二）白細(xì)胞介素（interleukin, IL)白細(xì)胞介素主要是白細(xì)胞產(chǎn)生的信號(hào)分子，不僅在免疫系統(tǒng)中傳遞信息，同時(shí)也參與造血系統(tǒng)的造血調(diào)控。（三）其它細(xì)胞因子1.干細(xì)胞因子（stem cell factor, SCF） 又稱肥大細(xì)胞生長(zhǎng)因子 促進(jìn)肥大細(xì)胞生長(zhǎng)；協(xié)同促進(jìn)造血干祖細(xì)胞增殖、分化。2FLT-3配基(FLT-3 ligand, FL) 誘導(dǎo)處于靜止期的造血干祖細(xì)胞進(jìn)人細(xì)胞周期，促進(jìn)其擴(kuò)增。1原癌基因 如：c-myc基因、ras相關(guān)基因、c

15、-abl基因、bcl-2 基因、c-kit基因等。（四）造血基因調(diào)控 原癌基因的編碼產(chǎn)物可為：細(xì)胞因子、細(xì)胞因子受體、細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞分子及轉(zhuǎn)錄因子等。 2. 抑癌基因 如：p53基因、WT1基因、NF1基因、DCC、Rb基因等。抑癌基因編碼產(chǎn)物通常為細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)節(jié)因子，抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)終末分化、維持基因穩(wěn)定、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等。 3. 轉(zhuǎn)錄因子參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控 對(duì)造血中基本的基因調(diào)控機(jī)制 仍存在若干懸念有待研究：（1）如何在細(xì)胞周期G1與G0之間來(lái)回轉(zhuǎn)換，并保持絕大多數(shù)細(xì)胞處于G0靜止?fàn)顟B(tài)? （2）干細(xì)胞不對(duì)稱有絲分裂在基因水平上是怎樣實(shí)現(xiàn)的?（3）干/祖細(xì)胞基因怎樣調(diào)控各類受

16、體表達(dá)，以接受造血微環(huán)境中各種正負(fù)信號(hào)的影響?（4）干細(xì)胞在基因水平如何調(diào)控向淋巴系或髓系分化?祖細(xì)胞基因如何決定分化方向?怎樣保持各系之間正常恒定比例? 第三節(jié) 造血干祖細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù) 體內(nèi)造血干祖細(xì)胞在一個(gè)極復(fù)雜的造血微環(huán)境中增殖、分化生成血液細(xì)胞。體外造血祖細(xì)胞培養(yǎng)就是在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，將從機(jī)體中分離出的造血祖細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使之生存、增殖分化。 造血祖細(xì)胞培養(yǎng)的主要應(yīng)用：1）檢測(cè)造血祖細(xì)胞在骨髓、外周血和臍血中的數(shù)量2）研究體外造血祖細(xì)胞類型、特性及生理意義3）利用人工培養(yǎng)條件易于嚴(yán)格控制的特點(diǎn)，研究造 血調(diào)節(jié)；4）用于造血系統(tǒng)疾病發(fā)生機(jī)制，診斷、預(yù)后判斷、 療效觀察及治療藥物

17、的選擇等方面的研究。一、造血干祖細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本條件（一）細(xì)胞培養(yǎng)室條件（二）培養(yǎng)的支持物（三）營(yíng)養(yǎng)液（四）細(xì)胞因子（五）血清 二、造血干祖細(xì)胞體外培養(yǎng)（一）造血祖細(xì)胞集落培養(yǎng)：（1）分離培養(yǎng)細(xì)胞，制成單個(gè)核細(xì)胞懸液。（2）配制培養(yǎng)體系：按比例將培養(yǎng)液、細(xì)胞、血清、細(xì)胞因子加入到培養(yǎng)體系，混勻。（3）將配制的培養(yǎng)體系在37水浴中保溫10min。（4）將瓊脂等支持物煮沸融化（甲基纖維素不需加熱）。（5）待支持物降至40左右，加入培養(yǎng)體系并混勻。（6）將混勻后的培養(yǎng)體系加入培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板孔內(nèi)，一般平行做3份。（7）于5% CO2、飽和濕度及37溫箱內(nèi)孵育。BFU-E需14天，CFU-E需7天。（

18、8）觀察結(jié)果。（一）紅系祖細(xì)胞誘導(dǎo)分化的液體培養(yǎng)：MediumFBSEPOStem cell factorIL3FVA CELLS: an in vitro system to study erythroblast differentiation0h12h24h44hFVA cells: Briefly, 10 days after infection with 104 spleen focus-forming units of the anemia-inducing strain of Friend leukemia virus (FVA), female CDF-1 mice were killed, and proerythroblasts (spleen origin) were purified and cultured.Koury MJ,et al. J Cell Physiol 1984, 121:526532.Lee G,et al. Blood, 2003,101, 1790-1797. High amount of enucleating erythroblas