地黃飲片HPCE-DAD指紋圖譜的研究(中藥材)(共10頁(yè))

1、PAGE PAGE 13地黃(d hun)飲片HPCE-DAD指紋圖譜(tp)的研究許虎，韓樂(lè)，劉訓(xùn)紅*，傅興圣，李俊松，蔡寶昌，沈澤中（南京中醫(yī)藥大學(xué)， 江蘇 南京(nn jn) 210046）摘要 目的：建立地黃飲片HPCE-DAD指紋圖譜分析方法，并對(duì)地黃及其炮制品的指紋譜進(jìn)行比較。方法：采用高效毛細(xì)管電泳法進(jìn)行色譜分離，以60mmolL 1硼砂 (5%甲醇，Ph 9.5)為運(yùn)行緩沖液，分離電壓為20 kV，波長(zhǎng)為210nm，以梓醇為參照物（IS），測(cè)定其指紋圖譜，并作模糊聚類(lèi)法分析和相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果：初步建立了以7個(gè)共有峰為特征指紋信息的地黃飲片HPCE-DAD指紋圖譜；發(fā)現(xiàn)少數(shù)地黃飲

2、片的指紋圖譜有一定差異，生品與其炮制品的指紋譜中共有峰相對(duì)峰面積差異顯著。結(jié)論：方法準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好，可作為地黃飲片內(nèi)在質(zhì)量評(píng)價(jià)的依據(jù)。關(guān)鍵詞 地黃；高效毛細(xì)管電泳二極管陣列檢測(cè)法；指紋圖譜Studies on HPCE-DAD fingerprint of Rehmannia glutinosaXu Hu , HAN Le , LIU Xunhong*, FU Xingsheng, LI Junsong , CAI Baochang，SHEN Zezhong(Nanjing University of Chinese Medicine, Nangjing 210046, China) Ab

3、stract Objective: To establish the analytical method for the fingerprint of Rehmannia glutinosa by HPCE-DAD and compare the fingerprints of Rehmannia glutinosa and its processed products. Method: Based on the mode of high performance capillary electrophoresis，60mmolL - 1 sodium borate was used as bu

4、ffer solution (5%MeOH, pH9.5). The separation voltage was 20 kV and the detection wavelength was set at 210 nm. Catalpol was used as a reference standard，the chromatographic fingerprint were determined. The data were analyzed by fuzzy cluster and fingerprint similarity evaluation software to compare

5、 the similarity of samples. Result: HPCE-DAD fingerprints with 7 common peaks of Rehmannia glutinosa were established preliminarily. It was discovered that a small number of samples differed from others. Regarding to the fingerprints of Rehmannia glutinosa and its processed products，there were obvio

6、us differences in the relative areas of common peaks. Conclusion: The method is reliable， accurate and can be used for quality control of Rehmannia glutinosa.Key words Rehmannia glutinosa；HPCE-DAD；fingerprint地黃為地黃科植物地黃Rehmannia glutinosa Libosch.的塊根，具有清熱涼血、養(yǎng)陰、生津之功效，始載于神農(nóng)本草經(jīng)，列為上品，為我國(guó)“四大懷藥”之一。中國(guó)藥典2010

7、版收載有鮮地黃、生地黃、熟地黃，功效各不相同。鮮地黃涼血清火、生津止渴，生地黃清熱涼血、滋陰生津，熟地黃補(bǔ)血、滋陰基金項(xiàng)目：江蘇省中藥炮制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放式課題(ZYPZ007) ；南京中醫(yī)藥大學(xué)“藥用生物資源研究與利用”優(yōu)秀科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃作者簡(jiǎn)介： 許虎(1986-)，男，碩士研究生， 從事中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)研究。*通訊作者：劉訓(xùn)紅， Tel：(025)85811511 E-mail： HYPERLINK mailto:liuxunh1959 liuxunh1959。臨床上也有用生地炭、熟地炭，生地炭長(zhǎng)于涼血止血，熟地炭長(zhǎng)于補(bǔ)血止血2?，F(xiàn)代藥理研究表明，地黃對(duì)免疫系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系

8、統(tǒng)具有顯著作用，還具有抗腫瘤、降血糖、抗胃潰瘍等作用3。其主要有效成分為環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物。目前對(duì)地黃的質(zhì)量控制，多以梓醇等作為考察指標(biāo)4-5，這種對(duì)單一成分的檢測(cè)不足以全面反映藥材的質(zhì)量，也缺乏專(zhuān)屬性。中藥色譜指紋圖譜用于中藥質(zhì)量控制，比目前沿用的方法提供的信息要豐富，高效液相色譜法已應(yīng)用于地黃的指紋圖譜研究6。本文采用高效毛細(xì)管電泳法對(duì)地黃飲片指紋圖譜的構(gòu)建進(jìn)行了探討，并與其炮制品進(jìn)行比較分析，以期為規(guī)范地黃飲片市場(chǎng)及確保藥材內(nèi)在質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性提供較全面的質(zhì)量控制手段。1 儀器(yq)與材料(cilio)G1600-AX高效(o xio)毛細(xì)管電泳儀（美國(guó)Agilent公司），配惠普化

9、學(xué)工作站、二極管陣列檢測(cè)器（DAD）、自動(dòng)進(jìn)樣器；Rotavapor R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司）；pHS-3C型pH計(jì)（上?？祪x儀器有限公司）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。硼砂（南京化學(xué)試劑一廠，分析純），氫氧化鈉（上海化學(xué)試劑有限公司，分析純），乙腈（德國(guó)Merck公司，HPLC級(jí)），甲醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純），無(wú)水乙醇（南京化學(xué)試劑有限公司，分析純），鹽酸（上?；瘜W(xué)試劑有限公司，分析純），乙酸（南京化學(xué)試劑有限公司，分析純），配制緩沖溶液和供試品溶液所用的水均為重蒸餾水。對(duì)照品：梓醇（批號(hào)：110808-200508）、桃葉珊瑚苷（批號(hào)

10、：111761-200601）、梔子苷（批號(hào)：110749-200714）、肉桂酸（cinnamic acid，批號(hào)：786-9001）購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；毛蕊花糖苷購(gòu)于上海永葉生物科技有限公司。樣品：地黃不同產(chǎn)地(chnd)（批次）樣品編號(hào)見(jiàn)表1。S1 S7為商品(shngpn)生地黃，S8 S10為自制(zzh)生地黃，S11S13為自采鮮地黃，S14為自制熟地黃， S15為自制地黃炭，S16為自制熟黃炭，均經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室劉訓(xùn)紅教授鑒定為地黃科植物地黃Rehmannia glutinosa Libosch.的新鮮或干燥塊根，或生地黃的加工炮制品。其中S11相對(duì)應(yīng)的加

11、工炮制品為S8、S14、S15、S16。留樣憑證存放于南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥炮制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。表1 地黃飲片樣品編號(hào)品 名產(chǎn) 地提供廠商批號(hào)或采集時(shí)間S1生地黃河北南京市中醫(yī)院080831S2生地黃河北南中醫(yī)藥大百草堂100607S3生地黃河南江蘇省中醫(yī)院20100803S4生地黃河南南京軒德堂中醫(yī)門(mén)診部100722S5生地黃河南南京市傳統(tǒng)中醫(yī)門(mén)診部100626S6生地黃河南南中醫(yī)藥大國(guó)醫(yī)堂100801S7生地黃河南河南宛西制藥股份有限公司1000031S8生地黃河南焦作溫縣實(shí)地采集，品種：溫85-520101110S9生地黃河南焦作溫縣實(shí)地采集，品種：沁懷一號(hào)20101110S10生地黃河南

12、焦作溫縣實(shí)地采集，品種：紅薯王20101110S11鮮地黃河南焦作溫縣實(shí)地采集，品種：溫85-520101110S12鮮地黃河南焦作溫縣實(shí)地采集，品種：沁懷一號(hào)20101110S13鮮地黃河南焦作溫縣實(shí)地采集，品種：紅薯王20101110S14熟地黃河南焦作溫縣實(shí)地采集，品種：溫85-520101110S15生地炭河南焦作溫縣實(shí)地采集，品種：溫85-520101110S16熟地炭河南焦作溫縣實(shí)地采集，品種：溫85-5201011102 方法與結(jié)果2.1 電泳條件 未涂漬標(biāo)準(zhǔn)熔融石英毛細(xì)管（64.5 cm 75 m，有效長(zhǎng)度56 cm，Agilent科技有限公司）；運(yùn)行緩沖液：60mmolL 1

13、硼砂 (5%甲醇，Ph 9.5)；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；分離電壓：20 kV；壓力進(jìn)樣：5 kPa6 s；毛細(xì)管溫度：25 。毛細(xì)管使用前依次用0.1 mmolL 1氫氧化鈉溶液、重蒸餾水和運(yùn)行緩沖液壓力沖洗5、10、5 min，樣品分析間隔用0.1 mmolL 1氫氧化鈉溶液、水、緩沖液平衡3、5、5 min。上述試劑使用前均經(jīng)0.22m濾膜過(guò)濾，并超聲脫氣。2.2 對(duì)照(duzho)品溶液(rngy)制備 稱(chēng)取桃葉珊瑚(shnh)苷20.00 mg、梔子苷5.13mg、毛蕊花糖苷4.02mg、肉桂酸10.32mg，精密稱(chēng)定，分別置于10 mL容量瓶中；稱(chēng)取梓醇3.92mg，精密稱(chēng)定，置于

14、5mL容量瓶中。上述對(duì)照品用50%甲醇溶液溶解并定容至刻度，使上述5種對(duì)照品濃度依次為2.000、0.513、0.402、1.032、0.784mgmL 1，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取梓醇2 mL、桃葉珊瑚苷1mL、梔子苷1mL、毛蕊花糖苷1mL、肉桂酸0.4mL，移至10mL容量瓶中，用50%甲醇稀釋并定容，即得梓醇0.157mgmL1、桃葉珊瑚苷為0.200 mgmL-1，梔子苷0.051mgmL-1、毛蕊花糖苷為0.040 mgmL-1，肉桂酸為0.103 mgmL-1混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。32.3 供試品溶液制備 精密稱(chēng)取經(jīng)50 干燥2 h后的樣品粉末（過(guò)60目篩）1.0 g，置具塞錐形瓶

15、中，精密加入50（體積分?jǐn)?shù)）甲醇50 mL，加熱回流1.5 h，過(guò)濾，濾液用50甲醇定容至50mL量瓶，用0.22 m濾膜過(guò)濾，作供試品溶液。2.4 方法學(xué)考察2.4.1 精密度試驗(yàn)：取同一批次供試品（S1）溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定指紋圖譜，用“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A）”軟件計(jì)算，結(jié)果相似度均大于0.98，表明供試品進(jìn)樣精密度良好。2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批次供試品（S1）溶液，分別在1、2、4、8、16、24h進(jìn)樣6次，測(cè)定指紋圖譜，用“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A）”軟件計(jì)算，結(jié)果相似度均大于0.94，說(shuō)明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)：取

16、同一批次樣品（S1）粉末6份，平行操作，制備供試品溶液，測(cè)定指紋圖譜，用“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A）”軟件計(jì)算，結(jié)果相似度均大于0.91，表明本法測(cè)定的重現(xiàn)性尚好。以上結(jié)果表明指紋圖譜中各色譜峰的相對(duì)遷移時(shí)間和峰面積基本一致，相似度較高，符合指紋圖譜研究的的技術(shù)要求。2.5 指紋圖譜的建立 將供試品溶液分別放入自動(dòng)進(jìn)樣的樣品管中，按選定的測(cè)試條件進(jìn)行檢測(cè)。同一上述實(shí)驗(yàn)(shyn)條件下，測(cè)定S1 S10供試品HPCE色譜圖。根據(jù)不同批次供試品測(cè)定結(jié)果(ji gu)所給出的峰數(shù)、峰值（積分值）和峰位（相對(duì)遷移時(shí)間）等相關(guān)參數(shù)，進(jìn)行分析、比較，制定優(yōu)化的指紋圖譜。（圖1，圖2）圖1

17、地黃(d hun)的HPCE-DAD指紋圖譜1. 梓醇 7.肉桂酸圖2 地黃的三維HPCE-DAD指紋圖譜2.6 指紋圖譜分析2.6.1 共有指紋峰標(biāo)定： 經(jīng)對(duì)供試品HPCE色譜圖的分析、比較，地黃標(biāo)定7個(gè)共有峰作為指紋圖譜的特征峰，1、7號(hào)峰與對(duì)照品對(duì)照分別鑒定為梓醇、肉桂酸。以1號(hào)峰梓醇為參照峰，分別求出各共有峰與之相比的值（調(diào)整遷移時(shí)間之比）和各共有峰的相對(duì)峰面積（峰面積之比）。（表2）表2 地黃(d hun)HPCE-DAD指紋圖譜中共有峰的相對(duì)遷移時(shí)間(shjin)值和相對(duì)峰面積峰號(hào)1234567相對(duì)遷移時(shí)間/1.00001.37831.44391.76081.90741.97002

18、.2777相對(duì)峰面積S11.00000.18100.41400.90140.72760.56451.4785S21.00000.14690.38030.86920.78270.59761.4165S31.00000.16600.41900.89130.81620.60081.9308S41.00000.15160.37810.91750.83300.54702.1248S51.00000.18470.36380.78540.78540.50562.3414S61.00000.20100.43851.00170.70760.57481.8787S71.00000.18820.40770.9111

19、0.71250.57671.6010S81.00000.19160.36930.94010.78840.53291.6826S91.00000.14980.40570.93270.64650.52021.3596S101.00000.18360.41220.94200.71660.58781.21582.6.2 指紋(zhwn)圖譜的聚類(lèi)分析： 選擇地黃HPCE指紋圖譜中7個(gè)比較明顯的共有峰，根據(jù)表2中的數(shù)據(jù)，用SPSS軟件中的hierarchical cluster analysis對(duì)10個(gè)地黃樣品進(jìn)行聚類(lèi)分析，所用聚類(lèi)方法為average linkage (between groups)，

20、距離公式為square euclidean distance，得不同樣品地黃的聚類(lèi)分析圖。（圖3，圖4）圖3 地黃HPCE-DAD指紋圖譜的聚類(lèi)分析圖結(jié)果顯示，當(dāng)距離標(biāo)尺在1時(shí)，樣品S1、S2、S9，樣品S7、S8各歸為一類(lèi)；在2時(shí)，樣品S3、S6各歸為一類(lèi)；在3時(shí)，樣品S1、S2、S9與S10歸為一類(lèi)；在4時(shí)，樣品在S3、S6與S4歸為一類(lèi)；在5時(shí)，樣品S1、S2、S9、S10與S7、S8歸為一類(lèi)；在10時(shí)，樣品S3、S6、S4與S5歸為一類(lèi)；當(dāng)距離標(biāo)尺在25時(shí)，所有樣品才歸為一類(lèi)。圖4 地黃(d hun)HPCE-DAD指紋(zhwn)圖譜中共有峰組分含量圖2.6.3 色譜(s p)峰的重

21、疊率： 以地黃對(duì)照譜圖（R）為基準(zhǔn)，按以下公式計(jì)算待測(cè)樣品與對(duì)照譜圖共有的峰數(shù)2/(待測(cè)樣品與對(duì)照譜圖峰數(shù)和)100，110號(hào)樣品色譜峰的重疊率依次為：89.45%，89.35%，85.40%，84.10%，82.30%，85.10%，87.65%，87.60%，89.55%，88.90%。2.6.4 相似度評(píng)價(jià)： 將測(cè)試數(shù)據(jù)導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A）”軟件，經(jīng)校正選峰，設(shè)定匹配模式，將色譜峰自動(dòng)匹配，生成對(duì)照?qǐng)D譜（圖5），進(jìn)行色譜峰差異性評(píng)價(jià)和整體相似性評(píng)價(jià)。各相似度值如下：S1-0.982，S2-0.987，S3-0.955，S4-0.965，S5-0.9

22、30，S6-0.950，S7-0.978，S8-0.977，S9-0.985，S10-0.988。結(jié)果表明，地黃樣品的指紋譜相似度較好（0.93）。圖5 地黃(d hun)樣品HPCE指紋圖譜(tp)共有模式2.6.5 鮮地黃(d hun)、生地黃、熟地黃的指紋譜比較 經(jīng)對(duì)鮮地黃（S11）、生地黃（S8）、熟地黃（S14）、生地炭（S15）、熟地炭（S16）的指紋圖譜比較、分析，鮮地黃、生地黃、熟地黃均具有7個(gè)共有峰，但色譜峰的重疊率及色譜圖相似度具有一定差異；生地炭、熟地炭只具有1個(gè)共有峰，色譜峰重疊率及色譜圖相似度具有明顯差異。以生地黃樣品（S8）為基準(zhǔn)，計(jì)算炮制品色譜峰的重疊率，鮮地黃為

23、94.2%，熟地黃為90.5%，生地炭為7.3%，熟地炭為5.6%；以生地黃（S8）為基準(zhǔn)，計(jì)算炮制品色譜圖的相似度，鮮地黃0.882，熟地黃0.902，生地炭0.161，熟地炭0.144。(圖6)圖6 地黃(d hun)的HPCE-DAD色譜(s p)圖a.鮮地黃(d hun) b.生地黃 c.熟地黃 d.生地炭 e.熟地炭1.梓醇 7.肉桂酸3 討論3.1 電泳條件的優(yōu)化緩沖液體系、緩沖液濃度及pH值的選擇： 實(shí)驗(yàn)考察了硼砂-水和硼砂-甲醇體系的緩沖溶液，經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)確定以硼砂-5%甲醇溶液緩沖體系，色譜峰峰形、分離度較好。在此基礎(chǔ)上，對(duì)緩沖液濃度及pH值進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，當(dāng)緩沖液濃度為

24、60 mmolL-1時(shí)各色譜峰的分離度較好；當(dāng)pH為9.5時(shí)各組分可以達(dá)到基線分離。分離電壓和運(yùn)行溫度的選擇： 考察了分離電壓在1625 kV范圍內(nèi)對(duì)各組分遷移時(shí)間的影響，結(jié)果表明，當(dāng)分離電壓為20 kV時(shí)樣品及對(duì)照品各待測(cè)組分仍然可以達(dá)到基線分離且節(jié)省時(shí)間；考察了運(yùn)行溫度在2025 范圍內(nèi)對(duì)各組分遷移時(shí)間的影響，結(jié)果表明，當(dāng)運(yùn)行溫度為25 時(shí)樣品的各組分分離效果好，且分析時(shí)間縮短。檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇： 采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行考察，記錄并比較不同波長(zhǎng)的色譜圖。結(jié)果在206 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，色譜圖中色譜峰較多，信息豐富。2 指紋(zhwn)譜分析指紋(zhwn)譜分析結(jié)果表明，不同(b tn)批次地黃樣品之間既有相關(guān)性，又有區(qū)別。相應(yīng)共有指紋峰均已在色譜圖上體現(xiàn)，色譜峰重疊率、指紋譜相似度較好，但各峰面積有所不同，說(shuō)明不同來(lái)源、不同批次地黃飲片其成分含量有一定差異。通過(guò)與對(duì)照品對(duì)照分析，梓醇、肉桂酸可列為地黃指紋譜共有特征峰中n強(qiáng)峰，而梔子苷、桃葉珊瑚苷、毛蕊花糖苷分別在個(gè)別批次商品飲片中，峰較小或未檢出，未標(biāo)