弓形蟲慢性感染小鼠腦內(nèi)長鏈非編碼RNA(lncRNA)的差異表達(dá)及作用機(jī)制的研究

1、弓形蟲慢性感染小鼠腦內(nèi)長鏈非編碼RNA(IncRNA)的差異表達(dá)及作用機(jī)制的研究弓形蟲是細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲,呈世界性分布,廣泛寄生于人和動物的有核細(xì)胞內(nèi)。能夠感染所有溫血動物,包括人,引起人畜共患弓形蟲病。血清學(xué)調(diào)查結(jié)果表明,全世界約有30%的人感染弓形蟲。免疫功能正常的宿主感染弓形蟲后,一般表現(xiàn)出沒有明顯癥狀的感染情況?，F(xiàn)在的研究表明,弓形蟲的這種隱性感染模式雖然沒有明顯的癥狀,但是能夠侵入宿主的神經(jīng)系統(tǒng),影響神經(jīng)細(xì)胞的功能,從而導(dǎo)致宿主腦損害,甚至精神疾病的發(fā)生?，F(xiàn)在,越來越多的證據(jù)表明弓形蟲慢性感染能影響神經(jīng)細(xì)胞損傷并參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病。新近研究發(fā)現(xiàn)，Non-codingRNA(ncRNA)是

2、基因組中一類重要的非編碼RNA,不具有蛋白編碼功能,但是在生命過程中卻發(fā)揮著重要的調(diào)控功能。其中長鏈非編碼RNA(Longnon-codingRNA,lncRNA)的長度大于200個核苦酸,作為神經(jīng)系統(tǒng)一類重要的非編碼RNA通過與靶基因mRNA合，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)，在許多神經(jīng)相關(guān)性疾病中起著重要的調(diào)節(jié)作用。在本研究中，我們用PRUtt弓形蟲包裹經(jīng)口感染小鼠，建立弓形蟲慢性感染小鼠模型,通過微陣列芯片檢測IncRNA與mRNAfc正常組與感染組的表達(dá)水平。通過熱圖、散點(diǎn)圖分析差異表達(dá)的IncRNA和mRNAfi過cis/trans預(yù)測靶基因?qū)Σ町惖腎ncRNA進(jìn)行靶基因的預(yù)測并進(jìn)行GOKEGC

3、W集分析，將相應(yīng)的基因根據(jù)功能的不同歸類,將有差異的pathway進(jìn)行富集,從而將相應(yīng)的基因進(jìn)行注釋及分類,找到實驗條件下顯著性差異變化的生物學(xué)調(diào)控通路并確定研究的IncRNA及相應(yīng)靶基因。通過生物信息學(xué)方法對IncRNA進(jìn)行定位分析并確定核質(zhì)位置。通過實時定量PCRT大樣本驗證IncRNA及靶基因的表達(dá)。免疫組化、免疫熒光檢測感染弓形蟲慢性感染腦組織中蛋白的變化。利用CCK-8流式細(xì)胞術(shù)、克隆形成、TUNE學(xué)實驗在細(xì)胞水平上研究IncRNA的功能。通過才建shRNAF口過表達(dá)體系，研究IncRNA的表達(dá)變化對靶基因表達(dá)的影響并通過Westernblot檢測蛋白變化。此外,我們通過RNAPul

4、ldown實驗將與IncRNA相關(guān)的蛋白拉下來，并通過質(zhì)譜分析，鑒定蛋白的種類，進(jìn)一步揭示IncRNA調(diào)控下游靶基因的機(jī)制。芯片數(shù)據(jù)顯示，感染弓形蟲的小鼠腦組織中IncRNA和mRNA勺表達(dá)發(fā)生了較大的變化，通過篩選發(fā)現(xiàn)lncRNA11496在弓形蟲慢性感染腦組織中的表達(dá)差異變化較大。通過GOKEGCW集分析，對IncRNA的靶基因和mRNAJ行基因注釋及分類，發(fā)現(xiàn)lncRNA11496和宿主精神行為的改變密切相關(guān)；通過cis/trans預(yù)測了lncRNA11496的基因，確定lncRNA11496靶基因是Mef2c。我們證實lncRNA11496定位于細(xì)胞核內(nèi)。同時，我們通過qPCR僉證發(fā)現(xiàn)

5、,lncRNA11496和Mef2c都是下調(diào)的。我們通過熒光定量PCR僉測了干擾及過表達(dá)lncRNA11496以后，檢測相應(yīng)靶基因Mef2c的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，lncRNA11496正向調(diào)控Mef2c的表達(dá)。同時，我們通過Westernblot檢測了蛋白水平上的表達(dá),進(jìn)一步驗證了這一結(jié)果。在體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞中，我們轉(zhuǎn)染shRNAF擾lncRNA11496及過表達(dá)lncRNA11496，通過CCK-8和克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)，干擾了lncRNA11496以后，細(xì)胞增殖變得緩慢,而過表達(dá)lncRNA11496以后,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖變快。我們進(jìn)一步通過流式細(xì)胞術(shù)檢測了細(xì)胞周期的變化，發(fā)現(xiàn)lncRNA的變化影響了細(xì)胞GtG2和S期的占比,進(jìn)而影響了細(xì)胞的增殖情況。此外,我們還發(fā)現(xiàn),干擾lncRNA11496的表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡,而lncRNA11496表達(dá)增加能夠抑制細(xì)胞凋亡。通過RNApulldown及質(zhì)譜分析,我們發(fā)現(xiàn)lncRNA11496是通過結(jié)合HDAC來影響Mef2c的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的增殖分化和凋亡。綜上所述，本研究通過微陣列芯片技術(shù)檢測了感染n型弓形蟲后，小鼠腦內(nèi)IncRNA和mRNA勺差異表達(dá)。發(fā)現(xiàn)lncRNA11496差異表達(dá)顯著并與精神行為密切相關(guān)，并且證明lncRNA11496是通過結(jié)合HDAC來調(diào)控