K562細胞外泌體誘導特異性CTL生成的研究

1、K562細胞外泌體誘導特異性CTL天生的研究陳紹倩，杜英，王鑫，顧巧麗，黃玉敏，董子明【摘要】為了研究人白血病細胞株K562細胞排泄的外泌體(exses)及K562細胞總RNA刺激人樹突狀細胞D排泄的外泌體可否誘導出K562細胞特異性TL，接納四步離心法提取K562細胞及K562細胞總RNA刺激人樹突狀細胞的造就上清液中的外泌體，并誘導TL天生，以四甲基偶氮唑藍(TT)法檢測TL對K562細胞的殺傷作用。結果表現(xiàn)：K562細胞外泌體和K562細胞RNA刺激的D和外泌體均能顯著促進對K562細胞的殺傷活性，與未經外泌體作用的比擬組比擬有明顯性差異P0.05。外泌體作用后對K562細胞的殺傷作用顯

2、著比對HL-60細胞的殺傷作用強，其差異有明顯性P0.05。結論：K562細胞外泌體可以或許誘導出特異性抗白血病細胞的免疫反響?！娟P鍵詞】K562細胞；樹突狀細胞；外泌體；細胞毒T淋巴細胞PrdutinfSpeifiTLInduedbyExsesDerivedfrK562ellsKeyrdsK562ell；dendritiell；exse；yttxiTlyphyte外泌體exse是一種直徑在50-90n的亞細胞雙層膜顆粒,抗原呈遞細胞衍生的外泌體攜帶有富厚的抗原呈遞所必要的H-、H-、共刺激分子和熱休克卵白平分子；腫瘤細胞衍生的外泌體還攜帶有腫瘤相干抗原，能誘導腫瘤相干抗原的特異性TL反響，是

3、一種有用的抗原轉運呈遞載體1,2。Zitvgel等3的動物體內實行結果表現(xiàn)，用實體腫瘤抗原打擊樹突狀細胞D，其外泌體可以誘發(fā)荷瘤小鼠的腫瘤排擠效應。rse等4的一期臨床實行用非小細胞肺癌AGE-A3或A4抗原打擊盼望期非小細胞肺癌患者(AGE抗原陽性)自體樹突狀細胞，得到D衍生的外泌體，這種攜帶AGE腫瘤抗原的D衍生的外泌體可以誘導AGE特異性T細胞反響并使一部門病人的病情得到緩解和操縱，提示D衍生的外泌體可以作為無細胞治療性腫瘤疫苗用于腫瘤的免疫治療。外泌體在實體腫瘤方面的研究陳訴較多，而在白血病方面的陳訴卻甚少，因此我們提取了白血病細胞株K562細胞及K562細胞總RNA刺激人樹突狀細胞的

4、外泌體，不雅察了其誘導的抗白血病細胞的作用，創(chuàng)造其外泌體能誘導K562細胞特異性TL，現(xiàn)陳訴如下。質料和要領重要試劑尺度胎牛血清、淋巴細胞分散液(TBD公司產物);rhG-SF、rhIL-4、rhIL-2(Peprteh公司產物)；完全造就基RPI1640Gib公司產物;小鼠抗人H-I、H-II、D54IA-I、D86B7-2、D80B7-1、D40單克隆抗體Anell公司產物；膠體金標識表記標幟馬抗小鼠IgG(華美公司產物)。二甲亞砜、四甲基偶氮唑藍(Siga公司產物)；TRIzL試劑(Invitrgen公司產物)；DTAP脂質體Rhe公司。細胞株造就K562細胞株和HL-60細胞株系鄭州大

5、學底子醫(yī)學院保存株。K562和HL-60細胞于含10%的胎牛血清(56滅活30分鐘)、1105U/L青霉素、100g/L鏈霉素、510-5l/L2-巰基乙醇和110-3l/L谷氨酰胺的RPI1640造就液，在37、5%2造就箱中造就。K562細胞總RNA制備根據(jù)TRIzL試劑說明書抽提處于對數(shù)生恒久的K562細胞總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完備性，紫外分光光度儀測定A260和A280數(shù)值。D的誘導和造就從正凡人外全面血細胞得到貼壁細胞，調解濃度至5105/l，懸浮造就于RPI1640完全造就液中，別離參加終濃度為100ng/lrhG-SF和500U/lrhIL-4,隔天半量換液，增補奇

6、怪造就液及細胞因子以誘導天生D。取上述制備的K562細胞總RNA(25l/250lpti-E)和DTAP(50l/250lpti-E)各250l，室溫下在聚苯乙烯試管中混淆20分鐘,混淆物參加造就5天的D，在37造就箱孵育4小時。4小時后吸出造就上清,參加含rhG-SF和rhIL-4的RPI1640完全造就液繼承造就。外泌體的提取取對數(shù)生恒久的K562細胞和K562細胞總RNA刺激的D的造就上清，按文獻外泌體4步離心法分散5,6，即：4300g離心10分鐘;1200g離心30分鐘；10000g離心30分鐘；末了，100000g超速離心60分鐘，所得到的沉淀即為外泌體。用PBS將外泌體，1000

7、00g超速離心60分鐘，洗1遍后，用PBS100l重懸,用BA法舉行定量，低溫保存?zhèn)溆谩562細胞外泌體刺激D誘導TL的天生外周血非貼壁細胞過尼龍毛柱得到T細胞，參加IL-2(終濃度5105U/L)造就擴增。上述外周血D造就5天后分組，一組參加終濃度為20g/l的K562細胞外泌體與D共孵育24小時作為實行組D，另一組不加外泌體繼承造就24小時作為比擬組D。將實行組和比擬組的D和T淋巴細胞按120混淆，繼承造就3天誘導TL天生，然后參加靶細胞K562細胞和HL-60細胞，效靶比為201，TT法測2組T細胞對K562細胞和HL-60細胞的殺傷活性7。TL殺傷活性=靶細胞比擬組A值-實行組A值-

8、效應比擬組A值/靶細胞比擬組A值100%。RNA刺激的D及外泌體誘導TL的天生取第7天K562細胞總RNA刺激D(實行組D)和未刺激D(比擬組D)，同上述要領誘導TL天生，并測2組T細胞對K562細胞的殺傷活性。取RNA刺激的D和未刺激的D排泄的外泌體各10g/l，分為2組：未刺激D排泄外泌體組(比擬組)和RNA刺激D排泄外泌體組實行組，誘導TL天生，用上述要領測各組對K562細胞的殺傷活性。統(tǒng)計學闡發(fā)實行數(shù)據(jù)以XSD表現(xiàn)，應用SPSS11.0統(tǒng)計軟件舉行統(tǒng)計學處置懲罰，接納2查驗，以a=0.05為查驗水準。結果外泌體、RNA和D的斷定如今對外泌體的斷定重要依靠形態(tài)學不雅察和卵白組身闡發(fā)。我們

9、對從造就上清液中所提取的分散樣品舉行了電子顯微鏡超微布局的不雅察、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)卵白帶型的闡發(fā)及標識表記標幟性分子的estern膠體金免疫要領檢測，結果表白我們的分散樣品正是外泌體。同樣也對所提取的K562細胞RNA做了瓊脂糖凝膠電泳，用紫外分光光度儀測定其A260和A280數(shù)值，檢測證實所提取的K562細胞RNA未落解。所誘導的D在形態(tài)和標識表記標幟性分子的表達測定也表白誘導出了典范的樹突狀細胞。K562細胞外泌體誘導的TL細胞殺傷活性我們用通例四步離心法提取K562細胞造就上清液中的外泌體，后者作用于D并誘導TL天生，以K562細胞作為靶細胞，不雅察對其殺傷作用。在效靶比

10、為201和401時，外泌體作用后誘導的TL對K562細胞的殺傷率(實行組)和外泌體未作用誘導的TL比擬組對K562細胞的殺傷率比擬力，實行組殺傷活性顯著增高(P0.05)。外泌體作用后的TL對K562細胞的殺傷率(實行組)與對HL-60細胞的殺傷率比擬力，外泌體作用后的TL對K562細胞的殺傷率也顯著增高(表1)，提示外泌體作用后的TL對K562細胞的殺傷有特異性。這說明K562細胞外泌體作用于D后誘導的TL對K562白血病細胞有特異性殺傷活性。Table1.KillingativityfTLinduedbyK562ellexsestK562ellsandHL-60ells略RNA刺激D及外泌

11、體誘導的TL天生用RNA提取試劑盒提取K562細胞RNA，然后用提取到的RNA刺激正凡人樹突狀細胞并提取后者造就上清液中的外泌體。分組檢測RNA刺激D刺激D為實行組，未刺激D為比擬組和RNA刺激D外泌體誘導的對K562細胞的殺傷活性RNA刺激D外泌體為實行組，RNA未刺激D為比擬組。RNA刺激D實行組誘導的殺傷活性和比擬組比力，殺傷活性顯著增高表2。同時用K562細胞RNA刺激正凡人樹突狀細胞造就上清液提取到的外泌體直接刺激T淋巴細胞，誘導TL天生實行組，后者對K562細胞的殺傷作用和未刺激比擬組比力，也較顯著加強，提示抗原荷載后的樹突狀細胞外泌體有直接誘導抗原相干的TL殺傷白血病細胞的作用(

12、表3)。Table2.TLativityinduedbyDsativatedithK562ellRNA略Table3.TLativityinduedbyexsesfDsativatedithK562ellRNAGrupKillingativity略討論腫瘤的免疫治療不停都是腫瘤研究的一大熱門，從早期的IL-2、IFN、LAK細胞到比年的樹突狀細胞疫苗，漸漸地從非特異性向特異性靠近，獲得了令人煽動的結果8-10，但都存在如許或那樣的不敷，外泌體那么為我們展示了一片新天地。近些年對外泌體的研究創(chuàng)造，差異細胞排泄的外泌體有著差異的生理作用。造血細胞，尤其是抗原呈遞細胞衍生的外泌體攜帶有富厚的抗原呈遞

13、所必要的H-、H-、共刺激分子和熱休克卵白平分子，腫瘤細胞衍生的外泌體還攜帶有腫瘤相干抗原，是一種有用的抗原轉運呈遞載體，能直接或間接作用于樹突狀細胞、T細胞和NK細胞等，在體內發(fā)揮著免疫調治作用，并且體內作用結果更好，實體瘤方面的臨床實行結果提示，外泌體有很大潛能作為一種新型疫苗用于腫瘤的治療3,4。推測白血病細胞外泌體也有這種作用，因此我們研究了白血病細胞株K562細胞外泌體是否也能誘導出特異性殺傷K562細胞的免疫應答，白血病外泌體是否也有大概用于白血病的治療，實行結果驗證了我們的推測：白血病細胞外泌體可以誘導出特異性TL免疫反響；同時我們的實行還證實，K562細胞RNA刺激的樹突狀細胞及外泌體也可以直接誘導出對K562細胞的殺傷活性，提示白血病細胞外泌體也有作為疫苗用于白