TPA誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化過(guò)程中線粒體鐵蛋白表達(dá)情況研究

1、TPA誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化歷程中線粒體鐵卵白表達(dá)環(huán)境研究孫蕾高舉袁粒星陳婷婷潘玲麗周晨燕朱易萍【關(guān)鍵詞】TPA；K562細(xì)胞；線粒體鐵卵白；運(yùn)鐵卵白受體；鐵卵白線粒體鐵卵白(ithndrialferritin,tF)是2001年才創(chuàng)造的一種鐵代謝相干分子，與胞漿鐵卵白具有很高的同源性，也具有亞鐵氧化酶活性和鐵結(jié)合本領(lǐng)，但其表達(dá)范圍于線粒體1。外洋開(kāi)端研究表白，tF為線粒體內(nèi)的鐵存儲(chǔ)卵白，tF的表達(dá)可使胞漿內(nèi)鐵向線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，低落胞漿可變鐵池labileirnpl，LIP程度，細(xì)胞呈缺鐵狀態(tài)，并通過(guò)鐵調(diào)治卵白irnregulatryprtein,IRP和鐵效應(yīng)元件irnrespnsiveelee

2、nt,IRE的彼此作用在轉(zhuǎn)錄后程度上和諧調(diào)治運(yùn)鐵卵白受體1(transferrinreeptr1,TfR1)和鐵卵白(ferritin,Fn)表達(dá)程度2。tF在細(xì)胞鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)治方面大概具有非常緊張的作用。中國(guó)實(shí)行血液學(xué)雜志JExpHeatl2022;15(2)K562細(xì)胞誘導(dǎo)分化歷程中線粒體鐵卵白表達(dá)環(huán)境研究線粒體是細(xì)胞代謝最為茂盛的細(xì)胞器，是血紅素和鐵硫卵白合成的重要場(chǎng)合，也是活性氧自由基產(chǎn)生的緊張部位3,4。白血病細(xì)胞增殖代謝茂盛，對(duì)鐵的需求大，但如今對(duì)白血病細(xì)胞線粒體鐵代謝相識(shí)很少。為此，我們接納TPA體外誘導(dǎo)K562白血病細(xì)胞定向分化動(dòng)態(tài)研究了K562白血病細(xì)胞誘導(dǎo)分化歷程中tF、TfR

3、1和胞漿FnRNA表達(dá)的變革環(huán)境，探究tF在白血病細(xì)胞線粒體鐵代謝調(diào)治方面的作用，為創(chuàng)立針對(duì)鐵代謝途徑的白血病治療新計(jì)謀奠基理論基矗質(zhì)料和要領(lǐng)質(zhì)料和儀器K562細(xì)胞造就K562細(xì)胞清醒后加RPI1640造就液含10FBS、100U/l青霉素和100g/l鏈霉素在37、5%2、飽和濕度孵箱中懸浮造就。實(shí)行分組用無(wú)血清RPI1640造就液將K562細(xì)胞懸液調(diào)解至濃度為5105/l，參加6孔板中，每孔接種量1106個(gè)細(xì)胞，置于37、5%2、飽和濕度孵箱中舉行造就。實(shí)行組為T(mén)PA誘導(dǎo)分化造就組和比擬組，前者按照預(yù)實(shí)行效果，確定TPA終濃度為16nl/L，比擬組為K562細(xì)胞平凡造就。每孔共設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

4、細(xì)胞形態(tài)不雅察網(wǎng)絡(luò)各時(shí)點(diǎn)1、3、5天的實(shí)行組和比擬組K562細(xì)胞，用PBS洗滌2次，離心涂片后瑞氏染色，涼干后油鏡下不雅察細(xì)胞形態(tài)，每片計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，盤(pán)算誘導(dǎo)分化率。誘導(dǎo)分化率%=已分化細(xì)胞數(shù)/200100%細(xì)胞外貌D64表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)網(wǎng)絡(luò)各時(shí)點(diǎn)1、3、5天的實(shí)行組和比擬組K562細(xì)胞，于四川大學(xué)華西病院腫瘤生物治療中央檢測(cè)細(xì)胞D64表達(dá)程度。PR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳和凝膠成像闡發(fā)統(tǒng)計(jì)闡發(fā)對(duì)相干資料用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件別離舉行統(tǒng)計(jì)學(xué)闡發(fā)。均數(shù)比力接納t查驗(yàn)，率的比力接納2查驗(yàn)。效果TPA誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化的形態(tài)學(xué)不雅察瑞氏染色不雅察可見(jiàn)，比擬組K562細(xì)胞呈圓形或橢圓形，胞核大而圓，

5、胞漿少少，染色深藍(lán)，94.5為未分化細(xì)胞，早幼階段以下的細(xì)胞僅占5.5%。但TPA處置懲罰5天的K562細(xì)胞具有典范成熟單核細(xì)胞的形態(tài)特性，如體積增大，胞漿染色變淡，可見(jiàn)空泡樣改變，核漿比例減小，核形態(tài)不規(guī)矩或呈腎形，核仁淘汰或消散，核染色質(zhì)趨向致密。誘導(dǎo)分化率為95，與比擬組比擬有明顯性差異P0.05，表白TPA可誘導(dǎo)K562細(xì)胞向單核細(xì)胞定向分化表1，圖1。TPA誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化歷程中D64表達(dá)環(huán)境D64是成熟單核細(xì)胞緊張的外貌標(biāo)記分子之一。我們接納流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TPA誘導(dǎo)分化歷程中，K562細(xì)胞外貌D64的表達(dá)程度。效果創(chuàng)造，TPA處置懲罰后第1天D64表達(dá)與比擬組比擬已有明顯性差異

6、P0.05。隨著誘導(dǎo)時(shí)間延伸，D64表達(dá)顯著加強(qiáng)，而比擬組K562細(xì)胞D64表達(dá)無(wú)顯著變革表2。誘導(dǎo)分化歷程中鐵代謝相干基因表達(dá)變革RNA表達(dá)上調(diào)。誘導(dǎo)分化第5天TfR1和FnRNA表達(dá)程度別離為誘導(dǎo)分化前的68.2%和1.97倍圖2和表3-5。討論鐵到場(chǎng)細(xì)胞的能量代謝和血紅卵白的生物合成等很多緊張的生理歷程，為DNA生物合成和細(xì)胞保存、增殖所必須。同時(shí)鐵可通過(guò)Fentn反響產(chǎn)生存性氧自由基，損傷生物大分子5。大量研究已經(jīng)表白，細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)重要是通過(guò)胞漿內(nèi)的IRP與鐵代謝相干分子RNA上的IRE的彼此作用，在轉(zhuǎn)錄后程度上和諧調(diào)治細(xì)胞攝鐵分子TfR1和儲(chǔ)鐵分子Fn的表達(dá)，精致調(diào)控胞漿LIP程度，

7、如許既可滿意細(xì)胞種種代謝對(duì)鐵的需求，又制止過(guò)多游離鐵造成的細(xì)胞損傷6,7。線粒體是細(xì)胞電子轉(zhuǎn)運(yùn)和氧化復(fù)原反響最為活潑和茂盛的細(xì)胞器，是血紅素和鐵硫酸卵白合成的重要場(chǎng)合。在幼紅細(xì)胞等細(xì)胞中，攝入胞漿中的鐵絕大部門(mén)進(jìn)入線粒體，到場(chǎng)血紅素合成3。線粒體鐵池必須與胞漿鐵池處于動(dòng)態(tài)平衡之中。但如今對(duì)兩者間的鐵動(dòng)態(tài)互換及其調(diào)治機(jī)制的熟悉相稱有限。外洋開(kāi)端研究表白，tF大概在線粒體鐵代謝調(diào)治方面發(fā)揮著緊張作用1，8。tF是新近創(chuàng)造的線粒體儲(chǔ)鐵卵白，基因定位于5q23.1，為單拷貝無(wú)內(nèi)含子基因，RNA長(zhǎng)度約1kb，編碼區(qū)序列與胞漿鐵卵白重鏈基因同源性高達(dá)80%。Levi等1研究表白，tF也具有亞鐵氧化酶活性，

8、可將亞鐵氧化為高鐵，形成無(wú)毒性的氫氧化鐵，儲(chǔ)存在殼狀布局的內(nèi)腔中，防范氧化應(yīng)激損傷，其攝取外源性亞鐵的速率和本領(lǐng)與胞漿Fn相稱，并且在去鐵胺作用后，tF結(jié)合鐵的本領(lǐng)乃至凌駕胞漿Fn8。按照tF卵白在線粒體的定位表達(dá)，體表里具有與胞漿鐵卵白相稱的攝鐵本領(lǐng)及與鐵結(jié)合的可逆性和可被動(dòng)用性，我們以為，tF在白血病細(xì)胞鐵代謝和細(xì)胞增殖方面大概發(fā)揮著緊張作用。因此，我們接納TPA體外誘導(dǎo)K562白血病細(xì)胞定向分化，動(dòng)態(tài)相識(shí)細(xì)胞誘導(dǎo)分化歷程中tF表達(dá)程度的變革紀(jì)律，以及與細(xì)胞重要攝鐵分子TfR1和胞漿儲(chǔ)鐵分子Fn表達(dá)變革間的彼此干系。我們接納TPA作為誘導(dǎo)分化劑，研究了K562細(xì)胞在TPA誘導(dǎo)前后的形態(tài)學(xué)和

9、細(xì)胞表型的變革。效果表白，16nl/LTPA可誘導(dǎo)K562細(xì)胞向單核/巨噬細(xì)胞定向分化，不但出現(xiàn)出成熟單核/巨噬細(xì)胞的形態(tài)特性如胞漿染色變淡、核漿比例縮小等，并且代表髓系細(xì)胞的D64表達(dá)程度呈上升趨勢(shì)，這與文獻(xiàn)報(bào)道的同等11,12。尤為緊張的是，隨著TPA誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化，tFRNA表達(dá)程度舉行性下調(diào)，誘導(dǎo)分化第5天表達(dá)程度僅為誘導(dǎo)分化前的50.3%。與此同時(shí)，TfR1RNA表達(dá)也漸漸低落，而FnRNA表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)分化第5天TfR1和FnRNA表達(dá)程度別離為誘導(dǎo)分化前的68.2%和1.97倍。我們的研究效果，從相反方面證明了rsi和Nie兩個(gè)研究小組的研究效果。rsi等8將tF轉(zhuǎn)染至He

10、La細(xì)胞，效果創(chuàng)造HeLa細(xì)胞胞漿TfR1卵白表達(dá)明顯上調(diào)，而胞漿Fn卵白表達(dá)明顯下調(diào)，提示tF表達(dá)程度增高可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵的再漫衍，使胞漿LIP程度低落，細(xì)胞呈缺鐵狀態(tài)，利于細(xì)胞通過(guò)TfR1攝鐵；而Nie等2通過(guò)轉(zhuǎn)染，使H1299細(xì)胞株tF高表達(dá)，效果也證明tF高表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵從胞漿向線粒體轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致胞漿呈缺鐵狀態(tài)，表示為胞漿TfR1表達(dá)增高、胞漿Fn表達(dá)低落、胞漿IRP與IRE結(jié)協(xié)力加強(qiáng)、TfR1介導(dǎo)的鐵攝取增長(zhǎng)。按照以上研究效果，我們以為白血病細(xì)胞適度程度的tF表達(dá)，有利于胞漿LIP向線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)，維持線粒體LIP處于一種適度較高程度，以滿意白血病細(xì)胞線粒體中種種代謝對(duì)鐵的需求；同時(shí)低落

11、胞漿LIP程度，使胞漿處于相對(duì)缺鐵狀態(tài)。細(xì)胞通過(guò)胞漿中的鐵感到分子irnsensr如IRP感知細(xì)胞缺鐵，從而上調(diào)TfR1表達(dá)，下調(diào)胞漿Fn表達(dá)，以利于白血病細(xì)胞通過(guò)TfR1攝取更多的鐵，使白血病細(xì)胞具有比正常細(xì)胞更強(qiáng)的鐵攝取本領(lǐng)。另一方面，白血病細(xì)胞同別的惡性腫瘤細(xì)胞一樣，細(xì)胞的增殖周期并非處于同步化狀態(tài)，因此要求線粒體中也存在某種不變的鐵儲(chǔ)藏。當(dāng)細(xì)胞處于靜止期時(shí)可以將游離性亞鐵氧化成高鐵狀態(tài)而儲(chǔ)藏起來(lái)，防范鐵到場(chǎng)的氧化損傷，具有庇護(hù)作用。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入活潑的增殖期如G1和S期時(shí)能很快將鐵開(kāi)釋出來(lái)滿意細(xì)胞代謝所需。tF的布局和成效特點(diǎn)使它可以或許為線粒體內(nèi)的種種代謝歷程提供不變的鐵儲(chǔ)藏，使白血病細(xì)胞具有比正常細(xì)胞更強(qiáng)盛的鐵儲(chǔ)藏和使用上風(fēng)?，F(xiàn)實(shí)上正常幼紅細(xì)胞中tF表達(dá)程度極低，但鐵粒幼細(xì)胞血虛環(huán)狀鐵粒幼細(xì)胞中tF表達(dá)程度明顯增高13。推測(cè)由于線粒體內(nèi)血紅素合成停滯，鐵感到分子感知線粒體缺鐵，導(dǎo)致胞漿鐵轉(zhuǎn)入線粒體，線粒體鐵負(fù)荷舉行性增長(zhǎng)。但為防范線粒體鐵積蓄所致的氧化應(yīng)激損傷，tF表達(dá)代償性上調(diào)，將過(guò)多的鐵以無(wú)毒性的情勢(shì)儲(chǔ)存起來(lái)，這也提示tF具有庇護(hù)作用14。比來(lái)，Nie等15將tF高表達(dá)的H1299細(xì)胞株轉(zhuǎn)入裸鼠，造成腫瘤動(dòng)物模子。效果創(chuàng)造tF高表達(dá)裸鼠腫瘤生長(zhǎng)速率和體積明顯小于比擬組。透射電子顯微鏡不雅察創(chuàng)造，tF高表達(dá)的裸鼠