膽汁酸、結(jié)腸炎(共15頁)

1、PPAR-UGT axis activation represses intestinal FXR-FGF15 feedback signalling and exacerbates experimental colitisby142111.摘要(zhiyo) 膽汁酸在炎癥(ynzhng)性腸道疾病(jbng)（IBD）中發(fā)揮著重要作用，但膽汁酸IBD中失調(diào)的機制仍是未知。本文指出PPAR（過氧化物酶體增值物激活受體）-UGTs（葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶）信號對膽汁酸體內(nèi)平衡起著重要的決定作用。葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的結(jié)腸炎通過激活過氧化物酶體增值物激活受體PPAR-UGTs途徑，導(dǎo)致膽汁酸在發(fā)炎

2、的結(jié)腸組織中積累。UGTs加速膽汁酸的清除和代謝，從而降低其在小腸中的胞內(nèi)水平。細(xì)胞內(nèi)膽汁酸的降低使法尼醇X受體(FXR) -FGF15信號的減弱，導(dǎo)致肝CYP7A1的上調(diào)，從而促進(jìn)膽汁酸的從頭合成。PPAR的敲除和用重組FGF19治療都能顯著減輕DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。因此，本文推測，腸PPAR-UGTs和下游FXR-FGF15信號通路對膽汁酸體內(nèi)平衡起重要的決定作用，并在結(jié)腸炎的病理發(fā)展中發(fā)揮重要作用。 回腸中OEA激活PPAR，上調(diào)UGTs的作用，增加膽汁酸的代謝清除。FXR內(nèi)源性配體膽汁酸在小腸細(xì)胞內(nèi)的水平減少，減弱了回腸FXR-FGF15的信號，導(dǎo)致肝CYP7A1的連續(xù)激活，并因此增加膽

3、汁酸的從頭合成，最后導(dǎo)致膽汁酸在發(fā)炎的結(jié)腸組織中積累。2.基本介紹2.1結(jié)腸(jichng)炎中結(jié)腸膽汁酸累積通過對DSS造模組的膽汁酸水平的觀察發(fā)現(xiàn)：與正常鼠比，結(jié)腸炎小鼠膽汁酸池較大(jio d)，表明膽汁酸從頭合成增加；與正常鼠比，結(jié)腸炎小鼠血清中膽汁酸濃度較低，而在膽囊、小腸、結(jié)腸和糞便中較高。Figure 1 | DSS-induced colitis disrupts bile acids homeostasis. (a) Bile acid pool analysis. The bile acid pool size was analysed by measuring total

4、 bile acids in the whole enterohepatic system, including the liver, gall bladder and the entire small intestine and its contents, and the values were normalized by body weight. (be) Total amount of bile acids in individual compartments.2.2結(jié)腸炎中肝CYP7A1上調(diào)(shn dio)通過對DSS造模組的膽汁酸水平的觀察發(fā)現(xiàn)：與正常鼠比，結(jié)腸炎小鼠膽汁酸池較大，

5、表明膽汁酸從頭合成增加；與正常鼠比，結(jié)腸炎小鼠血清中膽汁酸濃度較低，而在膽囊、小腸、結(jié)腸和糞便中較高。Figure 1 | DSS-induced colitis disrupts bile acids homeostasis. (a) Bile acid pool analysis. The bile acid pool size was analysed by measuring total bile acids in the whole enterohepatic system, including the liver, gall bladder and the entire small

6、 intestine and its contents, and the values were normalized by body weight. (be) Total amount of bile acids in individual compartments.2.3結(jié)腸炎中FXR-FGF15信號(xnho)減弱 與正常組比，結(jié)腸炎小鼠回腸中 Fxr的mRNA和蛋白含量沒有明顯變化，但FXR靶基因Fgf15和Shp的mRNA含量顯著減少(jinsho)；免疫染色也表明回腸FGF15蛋白含量明顯降低。Figure 2 | The intestinal FXR-FGF15 signalli

7、ng is compromised in colitis. (ce) Expression of Fxr, Fgf15 and Shp mRNAs in the distal ileum. (f) Expression of Fgfr4 and b-Klotho mRNAs in the liver. (g) Immunohistochemistry staining and quantitative analysis of FXR protein content in the distal ileum (scale bar, 50 mm). (h) Immunohistochemistry

8、staining and quantitative analysis of FGF15 protein content in the distal ileum (scale bar, 50 mm). 2.4結(jié)腸炎利于(ly)膽汁酸葡糖苷酸化結(jié)腸炎中頂膜和基底膜膽汁酸的運輸因子Asbt, Osta and Ostb和胞內(nèi)膽汁酸結(jié)合蛋白Ibabp都未產(chǎn)生大變化，表明FXR的減少不太可能是膽汁酸的錯誤吸收導(dǎo)致的；結(jié)腸炎中，糞便和尿中的膽汁酸葡萄苷酸化代謝物都顯著地增多；結(jié)腸炎中各種UGTs亞型，包括Ugt1a6, Ugt1a7, Ugt2b24 and Ugt2b35，在小腸中mRNA水平都顯著上調(diào)

9、，相關(guān)所有測試底物的酶活性都顯著增加，其中CDCA葡萄苷酸化的酶活性增加了4倍。Figure 3 | Intestinal PPAR-UGTs axis is overactivated in colitis. (a,b) The quantitative analysis of glucuronidation metabolites of bile acids in faeces and urine. (c,d) Expression and enzyme activity of UGT1A1, UGT1A6, UGT1A7, UGT2B34 and UGT2B35. 2.5PPAR是結(jié)腸炎

10、中擾亂(rolun)UGTs和膽汁酸的原因2.5.1實驗(shyn)中發(fā)現(xiàn)：與正常相比，結(jié)腸炎小鼠Acox1和L-Fabp mRNA表達(dá)增多，表明PPAR在小腸中激活(j hu)，同時PPAR的mRNA含量基本不變，但免疫組化表明其蛋白質(zhì)含量略有上升；與正常相比，結(jié)腸炎小鼠（LC-MS）腸內(nèi)OEA水平明顯高出很多；與正常相比，結(jié)腸炎小鼠NAPE-PLD 的mRNA（負(fù)責(zé)OEA的生物合成）表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)AAH的mRNA（參與其分解）表達(dá)不變，表明結(jié)腸炎小鼠中OEA水平的增加可能是由于生物合成增強引起的。Figure 3 | Intestinal PPAR-UGTs axis is overacti

11、vated in colitis. (e) Expression of Ppar, Acox1 and L-Fabp mRNAs in the small intestine. (f) Immunohistochemistry staining and quantitative analysis of PPAR protein content in the distal ileum (scale bar, 50 mm). (g) The concentration of OEA in the intestine contents of colitis mice, analyzed by LC-

12、MS. (h) The mRNA expression of Nape-pld and Faah in the small intestine. 2.5.2 正常(zhngchng)小鼠施用PPAR的激動劑Wy-1464一周(y zhu)后，小腸中的PPAR典型靶基因ACOX1和L-FABP的mRNA顯著上調(diào)(shn dio)，并導(dǎo)致腸道中Ugts的表達(dá)明顯增加，表明PPAR在調(diào)節(jié)腸道膽汁酸葡萄糖醛酸化的關(guān)鍵作用；另外，回腸中FG15的表達(dá)顯著抑制，肝Cyp7a1基因表達(dá)增加，而長FXR表達(dá)不受顯著影響，表明腸道PPAR -UGTs軸的激活可以調(diào)節(jié)腸FXR- FGF15信號以及之后的膽汁酸平衡

13、；降低小腸中的膽汁酸水平，但增加結(jié)腸和糞便中的膽汁酸含量，并且多種膽汁酸的糞便中葡萄糖醛酸比對照組高得多，表明可以PPAR激動劑處理可模仿DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的現(xiàn)象。Figure 4 | PPAR controls intestinal FXR-FGF15 and bile acid homeostasis. (a) The enzymatic activity of UGT isozymes towards the gluronidation of CDCA. The mice S9 in the distal ileum were a pool of eight individuals. (b

14、) The mRNA expression of Ugt1a1, Ugt1a6, Ugt1a7, Ugt2b34 and Ugt2b35. (c) The ileum expression of Fxr and Fgf15 in control and Wy-14643-treated mice. (d,e) The hepatic expression and protein content of CYP7A1 in control and WY-14643-treated mice. (f) Small intestinal bile acid profiles of control an

15、d Wy-14643-treated mice using UFLC-triple-time of flight analysis. 2.5.3 與野生型(WT)小鼠相比(xin b)，PPAR缺失小鼠肝中表達(dá)的Cyp7a1基因mRNA低得多，肝Cyp7a1基因的下調(diào)(xi dio)至少部分地是由于腸FGF15上調(diào)增加引起的，腸表達(dá)UGT基因明顯較低，小腸S9部分CDCA的葡萄糖醛酸酶的活性較低，糞便中大多數(shù)膽汁酸的葡糖苷酸低得多。Figure 4 | PPAR controls intestinal FXR-FGF15 and bile acid homeostasis.(g) The he

16、patic expression of Cyp7a1, Fgf15, Fgfr4 and Shp in WT and Ppar-null (Ppar-/-) mice. (h) Expression of Fgf15, Shp and Fxr mRNAs in the ileum. (i,j) The mRNA expression and activity of Ugts in control and Ppar-null mice. 2.6 PPAR-UGTs軸控制(kngzh)腸FXR-FGF19信號2.6.1 大鼠腸上皮細(xì)胞系IEC6經(jīng)WY-14643處理(chl)CDCA葡萄糖醛酸的產(chǎn)

17、生顯著(xinzh)增加細(xì)胞內(nèi)CDCA的量減少；FXR靶基因FGF15和SHP的表達(dá)顯著減少；表明與FXR- FGF15活化的顯著降低密切相關(guān)。2.6.2原代小鼠腸上皮細(xì)胞(PMIECs)經(jīng)OEA和WY-14643處理都能使細(xì)胞內(nèi)CDCA和CA的濃度下降，并且使其葡糖苷酸增加；顯著促進(jìn)CDCA和CA的代謝消除；FXR的靶基因FGF15和SHP的表達(dá)顯著減少；這表明PPAR的激活抑制FXR的活化的結(jié)果。Figure 5 | PPAR-UGTs axis controls FXR-FGF15 signalling in enterocytes. (gi) The relative levels o

18、f glucuronidation metabolites in the media and intracellular concentrations of FXR ligands, and the expression of FGF19 in HT29 cells under the treatment of OEA. (jl) The relative levels of glucuronidation metabolites in the media and the intracellular concentration of FXR ligands, and the expressio

19、n of FGF19 in HT29 cells under the treatment of fenofibrate. (mo) The relative levels of glucuronidation metabolites in the media and intracellular concentration of FXR ligands, and the expression of FGF19 of control and UGT1A3 siRNA-transfected HT29 cells 2.6.3平移鏈接(lin ji)到人類HT29細(xì)胞，用OEA和非諾貝特處理PPAR激

20、活，顯著降低了CDCA的細(xì)胞內(nèi)水平(shupng)，而UGT1A3的小干擾RNA沉默顯著增加CDCA的水平；顯著促進(jìn)了HT29細(xì)胞CDCA葡萄糖醛酸的產(chǎn)生和CDCA的細(xì)胞內(nèi)水平的降低，從而導(dǎo)致FGF19的表達(dá)減少；UGT1A3的siRNA沉默大幅增加了細(xì)胞內(nèi)CDCA水平，并降低了CDCA葡萄糖醛酸的產(chǎn)生，導(dǎo)致FGF19表達(dá)的雙重提升；結(jié)果表明，在人體PPAR-UGTs軸的破壞也可以(ky)減弱腸道FXR-FGF19信號。Figure 5 | PPAR-UGTs axis controls FXR-FGF15 signalling in enterocytes. (ac) The relativ

21、e levels of glucuronidation metabolites in the media and the intracellular concentration of FXR ligands and the expression of Fgf15 in PMIECs under treatment with OEA. (df) The relative levels of glucuronidation metabolites in the media and the intracellular concentration of FXR ligands, and the exp

22、ression of Fgf15 in PMIECs under the treatment of Wy-14643.2.6.4 IBD患者(hunzh)結(jié)腸活檢分析PPAR靶基因(jyn)，包括ACOX1和多個UGTs，分別顯著高于對照組；FXR靶基因包括FGF19和SHP的表達(dá)，均顯著低于健康對照組；與DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的小鼠獲得數(shù)據(jù)相同；結(jié)果表明在IBD患者中PPAR-UGTs信號(xnho)過度活躍，并可能壓制FXR-FGF19信號。2.7 PPAR-FGF15信號控制DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎2.7.1小鼠分為PPAR激動劑WY- 14643單獨處理或WY- 14643與DSS共同處理兩組單獨

23、使用DSS處理相比，WY-14643與DSS的聯(lián)合處理導(dǎo)致體重和結(jié)腸的長度更急劇的下降，炎癥損傷更嚴(yán)重，以及促炎因子和抗炎性細(xì)胞因子之間的不平衡程度更高；WY-14643處理顯著上調(diào)PPAR和其靶基因ACOX -1，L-FABP和多個UGT亞型基因在回腸的表達(dá)；WY-14643和DSS共同處理組小鼠的回腸FXR的靶基因FGF15和SHP 的表達(dá)和和肝FGFR4和SHP的表達(dá)水平進(jìn)一步降低，導(dǎo)致肝Cyp7a1基因的表達(dá)更加上調(diào)以及膽汁酸池的大小增加。Figure 6 | Wy-14643 exacerbates DSS-induced colitis. (a) Body weight. (b)

24、Colon length. (c) Histological assessment (scale bar, 100 mm). (d) Ileum expression of Fxr and Fgf15 mRNAs. (e) Hepatic expression of Fgfr4, b-Klotho, Shp and Cyp7a1 mRNAs. (f) Bile acid pool analysis. 2.7.2 WT小鼠和PPAR缺失(qu sh)的小鼠進(jìn)行DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的比較PPAR缺失小鼠與野生型小鼠都體重減少較少，結(jié)腸長度較長和炎癥組織損傷較少，由此判斷它們比較不易受到慢性(mn x

25、ng)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎；PPARA缺失(qu sh)小鼠與WT同窩小鼠相比，PPAR靶基因L-FABP和多個UGT亞型基因，包括UGT1A1，UGT1A6和UGT1A7在PPAR的回腸表達(dá)明顯較低；PPAR缺失小鼠與WT同窩小鼠相比，回腸表達(dá)FXR的靶基因FGF15和SHP顯著較高，而的肝表達(dá)CYP7A1顯著較低。Figure 7 | Ppar-null mice are less susceptible to DSS-induced colitis. (a) Body weight. (b) Colon length. (c) Haematoxylin and eosin staining

26、 of colon tissues (scale bar, 100 mm). (d) The mRNA expression of Ppar and L-Fabp in the ileum and liver of WT control and PPAR-null (Ppar-/-) mice. (e) The mRNA expression of Ugts in WT and Ppar-/- mice. (f) The mRNA expression of Fgf15, Shp and Fxr in the ileum. (g) The hepatic expression of Cyp7a

27、1, b-Klotho, Fgfr4 and Shp in WT and Ppar-/- mice. 2.7.3重組人FGF19 以25 mg kg-1腹腔(fqing)給藥治療DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠FGF19的慢性治療能顯著增加重量恢復(fù)能力，使結(jié)腸長度更長以及改善炎癥組織損傷，揭示能夠明顯減輕DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎；FGF19治療顯著恢復(fù)FGFR4和SHP，并且尤其使肝Cyp7a1基因的表達(dá)水平和膽汁酸池的大小恢復(fù)到正常；結(jié)果共同表明， FGF15分泌減少是促進(jìn)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎病理發(fā)展的一個重要的因素，并在FGF19低劑量的慢性治療可能成為(chngwi)治療結(jié)腸炎是有希望的戰(zhàn)略。Figure

28、8 | FGF19 treatment protects against DSS-induced colitis in mice. DSS-induced chronic colitis mice were treated with recombinant FGF19 at a dose of 25 mg kg-1 per day for the first 14 days per DSS cycle. (a) Body weight recorded during the first DSS cycle. (b) Colon length. (c) Haematoxylin and eosi

29、n staining of colon tissues (scale bar, 100 mm). (d) Hepatic Fgfr4, b-klotho, Shp and Fxr mRNA expression. (e) Hepatic Cyp7a1 mRNA expression.(f) Hepatic levels of CYP7A1 protein. (g) Bile acid pool analysis. 3.討論(toln)目前的研究表明，慢性DSS誘導(dǎo)(yudo)的結(jié)腸炎激活腸PPAR-UGTs軸，促進(jìn)膽汁酸和FXR的內(nèi)源性配體在小腸中的代謝消除。DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的條件下，內(nèi)源性

30、的FXR配體細(xì)胞內(nèi)水平降低，抑制腸FXR-FGF15的反饋信號的激活，從而導(dǎo)致肝CYP7A1的上調(diào)，并由此增加膽汁酸的從頭合成。本文(bnwn)研究結(jié)果表明，PPAR-UGT軸的過度激活和腸道FXR-FGF15的信號的減弱是結(jié)腸炎的DSS誘導(dǎo)模型的病理發(fā)展的關(guān)鍵因素。糞便排泄的膽汁酸增加是IBD中公認(rèn)的模式，然而，然在IBD中膽汁酸在其他部分的潛在改變的處置不太為人所知并在之前的研究中有爭議。實驗性結(jié)腸炎小鼠的觀察中發(fā)現(xiàn)，膽汁酸在糞便排泄增加但在血清水平減少，這與實驗性結(jié)腸炎和IBD 患者早期的觀測都相一致。在炎癥的結(jié)腸組織中膽汁酸積累的水平顯著增加，這支持了毒性膽汁酸在加劇結(jié)腸炎的病變發(fā)展中

31、的可能作用。值得注意的是，盡管膽汁酸池的大小增加了但是多種游離膽汁酸卻在小腸顯著減少。在回腸細(xì)胞中多種FXR配體（包括CDCA，CA和DCA）水平的減少，代表在結(jié)腸炎中FXR-FGF15反饋信號通路抑制背后的一個主要機制。此外，結(jié)腸炎中肝FGFR4的表達(dá)減少，由于FGF19處理可顯著恢復(fù)FGFR4的肝表達(dá)，因此，這一過程可能涉及FGF15水平的減少。FGF15減少以及肝表達(dá)其受體FGFR4的降低可能共同合作參與CYP7A1的上調(diào)。此外，在結(jié)腸炎小鼠回腸中，TbMCA，一種最近發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性的FXR拮抗劑的細(xì)胞內(nèi)積累顯著升高。因此，不能排除的可能性是在結(jié)腸炎小鼠中，除了在FXR激動劑的降低，F(xiàn)XR

32、拮抗劑TbMCA水平的提高也可以使回腸FXR-FGF15的信號減弱。然而，這些研究結(jié)果表明DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎促進(jìn)膽汁酸糞便消除和肝從頭合成膽汁酸增加。在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中這樣的膽汁酸失調(diào)非常類似于使用的膽汁酸螯合劑觀察到的現(xiàn)象，即促進(jìn)了糞便消除膽汁酸和肝表達(dá)Cyp7a1基因的上調(diào)。最近的一項研究表明膽汁酸在結(jié)腸colestilan eatment的特定富集，這似乎說明糞便消除膽汁酸的增加能夠促進(jìn)膽汁酸輸送到腸的遠(yuǎn)端部分，而以上皮細(xì)胞受損為特點的炎癥結(jié)腸組織因此得以易于豐富膽汁酸的種類。由于結(jié)腸炎的小鼠與正常對照組相比糞便排泄的游離膽汁酸含量更高，結(jié)腸炎小鼠的解離活性降低就無法說明在小腸(xi

33、ochng)中細(xì)胞內(nèi)游離膽汁酸的減少。相反，這些結(jié)果強烈表明，在結(jié)腸炎小鼠膽汁酸的葡糖苷酸化的急劇增加，導(dǎo)致膽汁酸胞內(nèi)水平的減少這一可能。不像與?；撬?和甘氨酸- 結(jié)合的膽汁酸，糖醛酸化膽汁酸不能被再吸收，這可能代表了異常的膽汁酸聚集的條件下的一個重要解毒機制。以前的研究表明，膽汁酸的肝葡萄糖醛酸化可能為負(fù)反饋機制的一部分，因為膽汁酸限制了它們本身生物活性，并控制它們的細(xì)胞內(nèi)水平，避免了病理生理集聚。本數(shù)據(jù)表明，腸膽汁酸的葡萄糖醛酸化也是保持膽汁酸內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要因素，它通過控制內(nèi)源性的FXR配體細(xì)胞內(nèi)水平，從而影響回腸FXR-FGF15信號來發(fā)揮這一作用。盡管關(guān)于參與小鼠膽汁酸的葡糖苷酸化的

34、確切UGT亞型仍不明了，但由于多種UGT亞型（包括UGT1A3，UGT2B4，UGT2B7，UGT2A1和UGT2A2）被發(fā)現(xiàn)在人膽汁酸葡萄糖醛酸化中起作用，本文合理推測多種UGT也參與小鼠的這一過程。以往(ywng)的研究對于PPAR激活調(diào)節(jié)CYP7A1和膽汁酸平衡的作用存在爭議(zhngy)。一些研究報告說，貝特類藥物激活PPAR可以抑制Cyp7a1基因，并認(rèn)為這是貝特類藥物導(dǎo)致人膽結(jié)石的副作用的潛在機制(jzh)。而其他研究表明，內(nèi)源性激動劑（如脂肪酸的代謝物）激活PPAR，可以促進(jìn)Cyp7a1基因轉(zhuǎn)錄活性并且PPAR特異性激動劑WY-14643能增加小鼠的膽汁酸合成。然而，先前的研究從

35、未考慮過PPAR的活化通過腸的FXR-FGF15信號調(diào)節(jié)CYP7A1的潛在影響。如今發(fā)現(xiàn)小腸中OEA（一種內(nèi)源性PPAR配體）的增加，和由此導(dǎo)致的PPAR典型靶基因和一些編碼UGT的基因的上調(diào)，共同表明在結(jié)腸炎小鼠中PPAR-UGTs軸的活化?？诜PAR激動劑WY-14643很大程度上模仿了在結(jié)腸炎觀察到的特征模式，包括UGT表達(dá)和活性的增強、腸道FXR-FGF15信號的抑制、肝CYP7A1表達(dá)的上調(diào)，甚至和膽汁酸部分處理的模式。此外，PPAR缺失小鼠腸道FXR-FGF15反饋信號被發(fā)現(xiàn)顯著的上升了。在PMIECs中，WY-14643或OEA激活PPAR，導(dǎo)致通過CDCA或CA激活的FXRFGF15信號的抑制。而CDCA或CA激活FXRFGF15信號的作用依賴于UGTs的表達(dá)和活性作用。值得注意的是，OEA或非諾貝特在HT29細(xì)胞系激活PPAR所產(chǎn)生的結(jié)果與嚙齒動物腸道細(xì)胞模型觀察到的非常相似。IBD患者結(jié)腸活檢分析進(jìn)一步表明，在這些患者身上也發(fā)生了PPAR-UGTs軸的激活和FXRFGF19信號