補(bǔ)充細(xì)胞傳感器

1、細(xì)胞傳感器及其在藥物(yow)分析中應(yīng)用的研究共七十二頁(yè)主要(zhyo)內(nèi)容細(xì)胞傳感器的研究現(xiàn)狀細(xì)胞硅器件界面(jimin)模型LAPS器件設(shè)計(jì)與制備實(shí)驗(yàn)測(cè)試系統(tǒng)的構(gòu)建實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與討論總結(jié)與展望共七十二頁(yè)1.細(xì)胞(xbo)傳感器的研究現(xiàn)狀共七十二頁(yè)光學(xué)(gungxu)顯微鏡光學(xué)顯微鏡是最傳統(tǒng)也是最廣泛應(yīng)用于細(xì)胞研究和觀察的儀器，上圖給出的一個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的熒光顯微圖。在細(xì)胞的觀察研究中，主要(zhyo)使用相差顯微鏡、熒光顯微鏡，目前還有體視顯微鏡。共七十二頁(yè)早期(zoq)的微吸管或微絲電極（a）進(jìn)行細(xì)胞胞內(nèi)信號(hào)檢測(cè)或細(xì)胞膜阻抗測(cè)量時(shí)，需要(xyo)用一個(gè)微與細(xì)胞膜相接觸，在接觸面處形成緊密封

2、接，即“全細(xì)胞膜”技術(shù)；（b）微吸管直接刺入細(xì)胞內(nèi)，記錄胞內(nèi)電位；（c）金屬絲或微靠近細(xì)胞膜附近，可以記錄胞外信號(hào)。共七十二頁(yè)膜片鉗 電極尖端與封接微區(qū)形成一個(gè)微小的膜片（membrane patch），微電極經(jīng)過(guò)細(xì)胞、溶液中的參考電極和放大電路構(gòu)成回路，A1的同相輸入端外加一控制命令，可使細(xì)胞膜鉗位于鉗制電壓(diny)，但該命令信號(hào)源電路并不影響被測(cè)細(xì)胞的活性狀態(tài) 。共七十二頁(yè)細(xì)胞(xbo)與傳感器的相同點(diǎn)對(duì)多種刺激敏感，如試劑、藥品(yopn)、電、光等都有輸入和輸出端口可以將其它信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)細(xì)胞：具有更高的敏感性、選擇性共七十二頁(yè)細(xì)胞(xbo)傳感器的發(fā)展細(xì)胞傳感器 (Cell-b

3、ased Biosensor, CBB) : 將活細(xì)胞作為敏感元件，檢測(cè)生物活性物質(zhì)的功能性信息。 細(xì)胞傳感器具有高度選擇性和敏感性，響應(yīng)(xingyng)迅速，可以檢測(cè)多種已知或未知物質(zhì)，可以廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測(cè)（如生化武器，地下水污染），藥物篩選，新藥開發(fā)和基礎(chǔ)神經(jīng)學(xué)研究。共七十二頁(yè)細(xì)胞與硅器件(qjin)的結(jié)合細(xì)胞擁有(yngyu)很多受體，可以將化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，如果將細(xì)胞有效得與電子讀出器件耦合，則細(xì)胞可以作為萬(wàn)能的生物傳感器應(yīng)用在很多領(lǐng)域。共七十二頁(yè)細(xì)胞(xbo)傳感器/細(xì)胞(xbo)芯片的現(xiàn)狀場(chǎng)效應(yīng)晶體管（FET）細(xì)胞(xbo)傳感器微電極陣列（MEA）細(xì)胞傳感器基于光尋址電位

4、傳感器（LAPS）的細(xì)胞微生理計(jì)共七十二頁(yè)神經(jīng)細(xì)胞(shn jn x bo)動(dòng)作電位神經(jīng)細(xì)胞的靜息電位是70mV左右，受到刺激時(shí)，細(xì)胞膜發(fā)生去極化，當(dāng)去極化達(dá)到55mV時(shí)，將引發(fā)一次動(dòng)作電位，這里的55mV就是這一神經(jīng)元的閾刺激。如果神經(jīng)元沒(méi)能達(dá)到閾電位水平，那么就不會(huì)有動(dòng)作電位產(chǎn)生，而一旦(ydn)達(dá)到閾電位，則動(dòng)作電位會(huì)始終保持它這種固有的大小和波形。 共七十二頁(yè)FET陣列(zhn li)細(xì)胞傳感器將離體的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)在FET上34天后，固定工作點(diǎn) VGS與VDS，給一個(gè)(y )細(xì)胞加電或藥物刺激，記錄IDS的變化，從而反映神經(jīng)細(xì)胞動(dòng)作電位變化情況。 共七十二頁(yè)FET陣列記錄到的心肌細(xì)胞活

5、動(dòng)(hu dng)情況心肌細(xì)胞培養(yǎng)在FET陣列上，0s29s是心肌細(xì)胞正常搏動(dòng)情況，29s50s執(zhí)行加藥過(guò)程，加入0.1mol/L的去甲腎上腺素，引起信號(hào)波動(dòng)(bdng)，圖中不顯示，50s以后是換液結(jié)束后藥物作用下細(xì)胞搏動(dòng)的變化，未記錄到信號(hào)的，是由于該位點(diǎn)的FET未接觸到柵極共七十二頁(yè)微電極陣列(zhn li)細(xì)胞傳感器(a)斯坦福大學(xué)集成中心制作的36個(gè)直徑為10m的平面微電極的陣列 (b)一點(diǎn)加刺激(cj)，陣列同步記錄的其它位置心肌細(xì)胞的動(dòng)作電位 共七十二頁(yè)對(duì)細(xì)胞胞外代謝(dixi)產(chǎn)物的測(cè)量葡萄糖作為碳源的含有各種( zhn)要素的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中質(zhì)子產(chǎn)生和排出的主要細(xì)胞代謝機(jī)制 共

6、七十二頁(yè)基于胞外pH值測(cè)量(cling)的微生理計(jì) 在硅襯底上腐蝕出小井，填入培養(yǎng)細(xì)胞（用合適的培養(yǎng)基覆蓋）。在小井下面采用LED掃描，并通過(guò)脈沖激光激勵(lì)在硅中產(chǎn)生(chnshng)電子空穴對(duì)。 共七十二頁(yè)2.細(xì)胞硅器件界面(jimin)模型共七十二頁(yè)LAPS的工作(gngzu)原理共七十二頁(yè)細(xì)胞(xbo)與LAPS傳感器的耦合 共七十二頁(yè)三明治線纜模型(mxng)當(dāng)神經(jīng)元粘著于SiO2表面時(shí)，在神經(jīng)元和芯片之間有一層導(dǎo)電的電解液間隙（即培養(yǎng)液），這樣，用SiO2隔開了半導(dǎo)體硅，用細(xì)胞膜隔開了細(xì)胞質(zhì)，這種結(jié)點(diǎn)具有線纜的特性：間隙形成(xngchng)了線纜的芯， SiO2和細(xì)胞膜形成了外面的包

7、層，這種結(jié)構(gòu)被定義為三明治線纜模型。 共七十二頁(yè)三明治線纜模型(mxng)等效電路（a）三明治模型(mxng)等效電路（b）點(diǎn)接觸模型(mxng)共七十二頁(yè)模型的數(shù)學(xué)(shxu)表達(dá)1在三明治線纜的極小面積應(yīng)用基爾霍夫法則和歐姆法則，可以得到電壓VJ（x,y,t）的動(dòng)力學(xué)等式，從而得到通過(guò)SiO2的電容電流、間隙的電解液上的歐姆電流及結(jié)點(diǎn)(ji din)處的復(fù)合電流。共七十二頁(yè)模型(mxng)的數(shù)學(xué)表達(dá)2實(shí)際情況是，在測(cè)量過(guò)程(guchng)中，我們并不知道結(jié)點(diǎn)的形狀，因此，無(wú)法應(yīng)用一個(gè)詳細(xì)的結(jié)點(diǎn)處的結(jié)構(gòu)模型。為了設(shè)計(jì)和評(píng)估實(shí)驗(yàn)，將結(jié)點(diǎn)處結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)化，用全電容、全電阻來(lái)描述細(xì)胞膜和SiO2，引入一

8、個(gè)“點(diǎn)接觸模型”的概念。 共七十二頁(yè)LAPS的等效電路根據(jù)Stern雙電層模型(mxng)以及半導(dǎo)體MOS結(jié)構(gòu)理論，對(duì)LAPS傳感器進(jìn)行等效。共七十二頁(yè)模型數(shù)學(xué)(shxu)表達(dá)1共七十二頁(yè)模型(mxng)數(shù)學(xué)表達(dá)2在等效電路中光生電流(dinli)源Ig起著重要作用共七十二頁(yè)3.LAPS器件(qjin)設(shè)計(jì)與制備共七十二頁(yè)表面處理(chl)對(duì)細(xì)胞傳感器的作用Neher指出，生物組織在自然情況下，細(xì)胞與細(xì)胞之間的間距是1020nm，經(jīng)驗(yàn)證，在人工基底培養(yǎng)細(xì)胞，若不經(jīng)過(guò)特殊處理，細(xì)胞與基底之間的距離不小于40nm（Neher, 2001）。細(xì)胞與硅器件耦合的情況，直接影響測(cè)量信號(hào)的大小所以，耦合問(wèn)

9、題直接影響了生物學(xué)與微電子學(xué)的結(jié)合(jih)，在細(xì)胞傳感器研究中，是一個(gè)不可回避的難點(diǎn)。 共七十二頁(yè)影響細(xì)胞(xbo)固定和生長(zhǎng)的幾個(gè)因素化學(xué)因素(yn s)：表面官能團(tuán)，電荷物理因素：粗糙度共七十二頁(yè)促進(jìn)細(xì)胞附著(fzhu)和生長(zhǎng)的方法1硅片表面羥基離子注入：在硅片表面的鍵合態(tài)中，只有Si-O-H對(duì)材料表面的親水性有最大貢獻(xiàn)。化學(xué)方法處理表面，引導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)：表面涂層，BDMS，APDMS。改變粗糙度促使細(xì)胞粘附：20nm50nm的粗糙度最適宜細(xì)胞貼附生長(zhǎng)。利用特殊形貌的表面促使細(xì)胞生長(zhǎng)：采用反應(yīng)離子蝕刻技術(shù)在硅片表面制備“硅草”。硅片上制作特殊結(jié)構(gòu)固定細(xì)胞：神經(jīng)(shnjng)井或尖樁籬柵。

10、共七十二頁(yè)促進(jìn)細(xì)胞附著和生長(zhǎng)(shngzhng)的方法2神經(jīng)井芯片（a）海馬神經(jīng)元細(xì)胞在神經(jīng)井中培養(yǎng)天后的圖片，部分(b fen)突觸從井中探出，與其它神經(jīng)元聯(lián)系，形成網(wǎng)絡(luò)，比例尺是100m；（b）神經(jīng)井剖面圖，井底中央有一6m的金電極，比例尺是20m；（c）神經(jīng)井示意圖。 共七十二頁(yè)促進(jìn)細(xì)胞(xbo)附著和生長(zhǎng)的方法3圖中所示是培養(yǎng)(piyng)在尖樁籬柵神經(jīng)芯片上的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（a）雙向的尖樁籬柵神經(jīng)芯片，（比例尺20 m ），圖中標(biāo)出了刺激翼（St），晶體管（S源極，D漏極，G柵極）；（b）池塘蝸牛的神經(jīng)元離體培養(yǎng)(piyng)3天后，固定在尖樁籬柵內(nèi)（比例尺20 m ）；（c）細(xì)胞培養(yǎng)(p

11、iyng)2天后胞體固定于尖樁籬柵內(nèi)，伸展出神經(jīng)突觸形成網(wǎng)絡(luò)（比例尺100 m ）。 共七十二頁(yè)我們采用(ciyng)的表面處理方法1表面做不同(b tn)處理后LAPS的輸出特性比較共七十二頁(yè)處理(chl)后細(xì)胞培養(yǎng)情況培養(yǎng)4天后的乳鼠腦皮層(p cng)細(xì)胞，胞體直徑約20um共七十二頁(yè)我們采用(ciyng)的表面處理方法2表面做聚酰亞胺小坑制備好的LAPS，表面涂一薄層聚酰亞胺，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)光刻技術(shù)，將聚酰亞胺層蝕刻出一個(gè)個(gè)的小洞，直徑大約(dyu)為3mm，然后對(duì)器件進(jìn)行涂PLOL層的處理，裸露的LAPS表面會(huì)有細(xì)胞貼附生長(zhǎng)。（a）示意圖，（b）實(shí)際器件拍照。 共七十二頁(yè)單細(xì)胞傳感器制備(

12、zhbi)過(guò)程 (1)基底硅片；(2)熱氧化生長(zhǎng)SiO2層；(3)硅片背面蒸鋁；(4)粘著(zhn zhe)方孔的培養(yǎng)皿；(5)將進(jìn)液和出液管安置在測(cè)量腔中；(6)用PLOL做表面涂層。 共七十二頁(yè)LAPS細(xì)胞(xbo)傳感器 左側(cè)是器件示意圖，右側(cè)(yu c)是實(shí)物共七十二頁(yè)4.實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(xtng)構(gòu)建共七十二頁(yè)測(cè)試(csh)系統(tǒng)示意圖細(xì)胞生長(zhǎng)后先鏡檢，鏡檢后，將芯片固定于顯微鏡觀察平臺(tái)，接好進(jìn)液出液管，啟動(dòng)泵工作，將培養(yǎng)液和藥物泵至初始狀態(tài)，調(diào)節(jié)(tioji)顯微鏡平臺(tái)，使激光束聚焦到單個(gè)細(xì)胞上，一切準(zhǔn)備就緒，開始測(cè)量。 共七十二頁(yè)測(cè)量(cling)系統(tǒng)實(shí)物圖共七十二頁(yè)進(jìn)樣系統(tǒng)(xtng)

13、共七十二頁(yè)觀察(gunch)平臺(tái)（a）觀察平臺(tái)系統(tǒng)(xtng)，（b）觀察和選擇細(xì)胞時(shí)所用系統(tǒng)(xtng)，（c）激光束對(duì)準(zhǔn)細(xì)胞時(shí)所用系統(tǒng)(xtng)，此時(shí)由半透膜代替擋板。共七十二頁(yè)測(cè)量過(guò)程中對(duì)光源(gungyun)的調(diào)節(jié)共七十二頁(yè)實(shí)驗(yàn)測(cè)量(cling)界面該圖是無(wú)細(xì)胞測(cè)試過(guò)程中的一組數(shù)據(jù)。0120s是加培養(yǎng)液后的基線測(cè)量；A點(diǎn)開始泵3工作，抽出培養(yǎng)液，在大約20s的時(shí)間里，由于LAPS器件(qjin)表面電解液被抽干，所以測(cè)量信號(hào)為0；B點(diǎn)開始加藥，當(dāng)培養(yǎng)腔逐漸被藥物充滿時(shí)，信號(hào)又回到初始時(shí)的幅度，C點(diǎn)加藥結(jié)束，采樣頻率20KHz。 共七十二頁(yè)5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析(fnx)與討論共七十二頁(yè)LA

14、PS重復(fù)性測(cè)量(cling)共七十二頁(yè)光源調(diào)制(tiozh)頻率與輸出光電壓20010KHz為工作范圍，我們(w men)選擇4KHz作為工作頻率共七十二頁(yè)特性(txng)曲線隨頻率的變化共七十二頁(yè)一、多光源(gungyun)微生理計(jì)可同時(shí)(tngsh)檢測(cè)細(xì)胞在藥物作用下胞外K+、Ca2+、H+三種離子的代謝情況 共七十二頁(yè)測(cè)量(cling)結(jié)果分析1乳鼠腎細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液中，細(xì)胞外微環(huán)境(hunjng)pH的變化。泵工作通2min培養(yǎng)液，斷開泵，培養(yǎng)腔靜止3min，如此循環(huán)，測(cè)量6個(gè)周期。 共七十二頁(yè)測(cè)量結(jié)果(ji gu)分析2乳鼠心肌細(xì)胞在苯妥英鈉作用下，細(xì)胞外微環(huán)境三種離子(lz)濃度

15、的變化 共七十二頁(yè)二、單細(xì)胞傳感器可測(cè)量在刺激作用下單個(gè)細(xì)胞(xbo)的胞外動(dòng)作電位，從而確定刺激對(duì)細(xì)胞(xbo)的作用是興奮劑還是抑制劑。共七十二頁(yè)測(cè)量結(jié)果(ji gu)分析1表面處理結(jié)果細(xì)胞形態(tài)正常，突觸伸展明顯，生長(zhǎng)情況良好(lingho)，部分神經(jīng)元細(xì)胞形成突觸聯(lián)系。 共七十二頁(yè)測(cè)量結(jié)果(ji gu)分析2單細(xì)胞動(dòng)作電位模擬測(cè)量(cling)結(jié)果共七十二頁(yè)測(cè)量(cling)結(jié)果分析3單細(xì)胞傳感器在濃度(nngd)為10g/ml的乙酰膽堿作用下，記錄到的響應(yīng)曲線共七十二頁(yè)測(cè)量結(jié)果(ji gu)分析4（a）培養(yǎng)腔中泵入培養(yǎng)液，記錄基線；（b）培養(yǎng)腔泵入濃度(nngd)為10g/ml的乙酰膽

16、堿，記錄到細(xì)胞傳感器的響應(yīng)曲線 共七十二頁(yè)三、嗅覺與味覺(wiju)芯片的初步研究當(dāng)嗅細(xì)胞受到氣味刺激時(shí)，會(huì)把這種信息(xnx)傳遞給大腦，嗅覺與味覺在功能上相互配合，對(duì)于鑒別外界化學(xué)物質(zhì)具有重要意義。共七十二頁(yè)味覺(wiju)示意圖當(dāng)味蕾(wili)受到刺激時(shí)，會(huì)把刺激信息傳遞給大腦共七十二頁(yè)味蕾細(xì)胞(xbo)在玻片上的生長(zhǎng) 圖中（a）與（b）均為在玻璃片上離休培養(yǎng)6天后的乳鼠味蕾(wili)細(xì)胞。共七十二頁(yè)嗅細(xì)胞(xbo)在玻片上的生長(zhǎng) （a）嗅球的僧帽細(xì)胞，三角形，有明顯的細(xì)胞核；（b）嗅上皮的雙極細(xì)胞，互相(h xing)連接。 共七十二頁(yè)嗅球細(xì)胞(xbo)在 LAPS芯片上的培養(yǎng)情況

17、圖中箭頭所指為嗅球細(xì)胞，可以看到細(xì)胞形態(tài)完整(wnzhng)，呈明顯的僧帽形。共七十二頁(yè)基于LAPS的嗅覺(xiju)芯片嗅球的僧帽細(xì)胞(xbo)，三角形；（b）嗅上皮細(xì)胞(xbo)，明顯雙極。 共七十二頁(yè)測(cè)量結(jié)果(ji gu)分析1濃度為25mol/L的Glu刺激下，傳感器響應(yīng)(xingyng)信號(hào)的FFT 共七十二頁(yè)測(cè)量(cling)結(jié)果分析2濃度為25mol/L的Glu刺激下，傳感器響應(yīng)信號(hào)(xnho)的FFT（0200Hz的分量） 共七十二頁(yè)測(cè)量(cling)結(jié)果分析3濃度為25mol/L的Glu刺激(cj)下，傳感器響應(yīng)信號(hào)的FFT 共七十二頁(yè)6.總結(jié)(zngji)與展望共七十二頁(yè)

18、主要(zhyo)創(chuàng)新點(diǎn)1深入研究了細(xì)胞硅器件耦合界面模型及LAPS的測(cè)量模型。2提出了一種新型的多功能細(xì)胞傳感器微生理計(jì)3提出了基于(jy)LAPS的單細(xì)胞傳感器的設(shè)計(jì)方案和制作方法，設(shè)計(jì)了一套全自動(dòng)進(jìn)樣給藥系統(tǒng)。4提出了基于LAPS的細(xì)胞傳感器的藥物分析和藥效評(píng)價(jià)的方法，證明了該類細(xì)胞傳感器用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞活動(dòng)的可行性。共七十二頁(yè) 有待改進(jìn)(gijn)的方面1藥物選擇，需進(jìn)行大量的細(xì)胞和藥物實(shí)驗(yàn)，建立藥物評(píng)價(jià)(pngji)數(shù)據(jù)庫(kù)。2進(jìn)一步提高系統(tǒng)信噪比，減小環(huán)境震動(dòng)和自然光干擾，減少測(cè)量過(guò)程中引入人為的干擾；另外，傳感器的表面處理，也是影響信號(hào)幅度大小和信噪比的重要因素。3改進(jìn)信號(hào)處理方法。共七十二頁(yè) 正在(zhngzi)進(jìn)行的工作1將FET和 ISFET陣列制備在同一(tngy)芯片上，可以同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞的胞外代謝和胞外微環(huán)境中動(dòng)作電位的變化，我們已經(jīng)將心肌細(xì)胞成功地培養(yǎng)在這一陣列上。共七十二頁(yè) 正在(zhngzi)進(jìn)行的工作2采用lift-off技術(shù)在玻璃上制備微電極陣列，然后將味覺細(xì)胞培養(yǎng)在微電極陣列上進(jìn)行(jnxng)胞外刺激和相應(yīng)測(cè)量。共七十二頁(yè) 正在進(jìn)行(jnxng)的工作3結(jié)合芯片測(cè)量技術(shù)與膜片鉗技術(shù)，對(duì)嗅覺和味覺(wiju)生理進(jìn)行定量的研究。共七