第5章植物脫毒快繁技術

1、第5章植物脫毒快繁技術 目前，對細菌和真菌侵染的病害，可通過藥物處理達到治愈的目的。但還沒有治病毒的特效藥。種子一般不帶病毒(豆類植物除外)，種子繁殖可得無毒植株。但對于無性繁殖植物，必須采取一些特殊方法脫除病毒。 脫毒快繁的一般過程 1、診斷：首先了解供試材料感染病毒的種類 2、莖尖培養(yǎng)脫毒或結合熱處理 3、鑒定 4、繁殖 5、馴化移植 1、熱處理脫毒原理： 病毒進入植物細胞后，隨植物細胞DNA一起復制。熱處理并不能殺死細胞，只是鈍化病毒的活性，使病毒在植物體內增殖減緩或增殖停止，而失去病毒的侵染能力。熱處理是一種物理效應，可加速植物細胞分裂，在激烈分裂的細胞中正常核蛋白合成占優(yōu)勢，使植物細

2、胞在與病毒繁殖的競爭中取勝。因此加速分生組織細胞的分裂，能夠獲得無病毒植株。 二、脫毒方法 (一) 熱處理脫毒 依據(jù)病毒對高溫的敏感，寄主耐高溫。利用這一差異，選擇適當?shù)臏囟群吞幚頃r間，進行高溫處理，就能使寄主體內病毒濃度降低，傳遞速度減慢或失去活性，而寄主細胞仍然存活，并加快分裂和生長。(1)溫湯浸漬處理 (2)熱空氣處理 2、熱處理脫毒方法（1）溫水浸漬處理 適用于休眠器官，在50左右的溫水中浸漬10min至數(shù)小時，方法簡便易行，但易使材料受傷。（2）熱空氣處理 熱空氣處理對活躍生長的莖尖效果較好。將生長的盆栽植株移入溫熱治療箱內，一般35-40。處理時間因植物而異，短則幾十分鐘，長可達數(shù)

3、月。熱處理廣泛應用于葡萄、草莓、馬鈴薯和菊花等植物。如：葡萄置于38 可去除扇葉病毒。熱處理對葡萄扇葉病毒、草莓斑駁病毒、蘋果花葉病毒等球形病毒有作用，而對另一些病毒不起作用，因此，必須與莖尖培養(yǎng)相結合脫毒效果更好。 植物的去病毒技術，實質上就是采取不含病毒顆?；虿《绢w粒含量甚少的0.10.5mm帶12個葉原基的莖尖作為外植體，進行微繁殖，使其培養(yǎng)成完整的無病毒小植株的技術。（二）莖尖培養(yǎng)脫毒 1、莖尖培養(yǎng)脫毒原理 病毒在植物體內分布不均勻，其數(shù)量隨植株部位及年齡而異，越靠近莖頂端區(qū)域，病毒感染的程度越低，生長點即分生組織（約0.1-1mm）幾乎不含或含病毒很少。 1、傳導抑制。植物體病毒的移

4、動主要靠2條途徑：一是通過維管系統(tǒng)，而分生組織中尚未形成維管系統(tǒng)；二是通過胞間連絲，但這條途徑病毒移動速度非常慢，趕不上莖尖和根尖細胞不斷分裂和活躍的生長速度。 2、酶缺乏。莖尖中缺乏病毒合成所需的酶系，存在高水平內源激素，可抑制病毒的增殖。 莖尖分生組織不帶病毒，可能有4方面的原因：3、能量競爭。當植物細胞分裂DNA復制時，病毒DNA隨著復制。因此，植物細胞分裂和病毒繁殖之間存在相互競爭。在旺盛分裂的分生組織中，代謝活動很高，正常核蛋白合成占優(yōu)勢，使病毒無法進行復制。4、抑制因子存在。在植物體內存在有一種“病毒鈍化系統(tǒng)”（抑制因子假說），在分生組織中的活性最高，因而使分生組織不受侵染。2、培

5、養(yǎng)基 一般以White、MS為基本培養(yǎng)基，提高鉀鹽和銨鹽含量有利于莖尖生長。MS培養(yǎng)某些植物莖尖時，有些離子濃度過高應稀釋。在雙子葉植物中，激素可能在第2對葉原基中合成，所以莖尖的圓錐組織生長激素不能自給，必須加入生長素與細胞分裂素，濃度要合適。在生長素中應避免用易促進愈傷組織化的2，4-D，宜用NAA或IBA；細胞分裂素用KT或BA；GA3對某些植物莖尖培養(yǎng)有用。材料選擇、消毒 微莖尖的剝取 接種3、莖尖的培養(yǎng)方法3、莖尖的培養(yǎng)方法 需要一臺解剖鏡（8-40倍）。 剝離莖尖要迅速并盡快接種，或在一個襯有無菌濕濾紙的培養(yǎng)皿內進行操作，以防莖尖變干。 莖尖分生組織由于有彼此重疊的葉原基的嚴密保護

6、，只要仔細解剖，(無須表面消毒)就可得到無菌的外植體。有時消毒處理會增加培養(yǎng)物的污染率。即：葉片包被嚴緊的芽，如菊花、蘭花，只須75%酒精中浸蘸一下，而葉片包被松散的芽，如香石竹、馬鈴薯等，則要用0.1%次氯酸鈉表面消毒10min。莖尖長（）葉原基數(shù)小植株數(shù)脫毒植株數(shù)脫毒率（）0.1215024480.272421842.90.646400離體莖尖大小對馬鈴薯脫毒效果的影響 切取莖尖越小脫毒效果越好，但太小不易成活，過大又不能保證完全除去病毒，所以莖尖大小要合適。 剝取莖尖過程: 解剖鏡下用解剖針將葉片剝掉，解剖針要常消毒。當一個半圓球的頂端分生組織充分暴露出來之后，用解剖刀片將帶1-2個葉原

7、基的分生組織切下，接到培養(yǎng)基上。 將接種的莖尖置于22左右溫度下。 2000-3000lx 16h/d 光照下培養(yǎng)。由于在低溫和短日照下，莖尖有可能進入休眠；所以較高的溫度和充足的日照時間必須保證。微莖尖需數(shù)月才能成功。 莖尖培養(yǎng)的繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)和一般器官的培養(yǎng)相同。 莖尖培養(yǎng)脫毒，由于其脫毒效果好，后代穩(wěn)定，所以是目前培育無病毒苗最廣泛和最重要的一個途徑。4、影響微莖尖成活及脫毒的因素 （1）母體材料病毒侵染程度被單一病毒感染的植株脫毒較容易，復合感染的較難。 （2）外植體大小 在最適培養(yǎng)條件下，外植體的大小決定莖尖的存活率，外植體越大，產(chǎn)生再生植株的機會也就越多。除了外植體的大小之外，

8、葉原基的存在與否也影響分生組織形成植株的能力，一般認為，葉原基能向分生組織提供生長和分化所必需的生長素和細胞分裂素。（2）培養(yǎng)條件 在莖尖培養(yǎng)中，光下培養(yǎng)的效果通常比暗培養(yǎng)效果好，如馬鈴薯莖尖培養(yǎng)時，當莖已長到1cm高時，光照強度便增加到4000lx。 （3）外植體的生理狀態(tài) 莖尖最好要由活躍生長的芽上切取。 取芽的時間也很重要，一般選萌動期較好。否則采用適當?shù)奶幚?，打破休眠才能進行。 （三）莖尖與熱處理相結合方法 能克服單獨莖尖培養(yǎng)時，莖尖過小成活率太低，莖尖太大又脫除不掉病毒的缺點。 1、熱處理后取較大莖尖培養(yǎng)獲得脫毒苗。 2、取莖尖（或莖段）培養(yǎng)獲得無菌苗。然后將試管苗熱處理，再取莖尖培

9、養(yǎng)獲得脫毒苗。 （四）其它途徑脫毒 1、愈傷組織培養(yǎng)脫毒 2、莖尖微體嫁接 3、化學療法脫毒 1、愈傷組織培養(yǎng)脫毒 愈傷組織細胞帶病原菌不均一，部分細胞不帶病毒，由這些細胞再生的植株是無病毒的。多次繼代的愈傷組織中病毒含量下降，甚至檢測不出病毒。 愈傷組織的某些細胞不帶病毒原因： 1、病毒的復制速度趕不上細胞的增殖速度； 2、有些細胞通過突變獲得了抗病毒的抗性。 愈傷組織脫毒的缺陷是植株遺傳性不穩(wěn)定，可能會產(chǎn)生變異植株。2、莖尖微體嫁接 木本植物莖尖培養(yǎng)難以生根成植株，將實生苗砧木在人工培養(yǎng)基上種植培育，再從成年無病樹枝上切取0.4-1mm莖尖，在砧木上進行試管微體嫁接，以獲得無病毒幼苗。3、

10、化學療法脫毒 病毒抑制劑 三、脫毒快繁材料的選擇 應注意以下幾點： 1）品種要可靠 2）要選擇經(jīng)當?shù)卦耘啻_認的高產(chǎn)優(yōu)質的品種來作 為脫毒材料 3）名貴的植物良種 4）植物生長旺盛期，再生率高，脫毒效果好 四、植物病毒的鑒定 1、外觀判斷法 2、指示植物法 3、抗血清鑒定法 4、電子顯微鏡檢查法 5、酶聯(lián)免疫鑒定法(ELISA) 1、外觀判斷法： 帶病毒株往往葉片發(fā)黃，凹凸不平，畸形，可根據(jù)這些表現(xiàn)來判斷。但有些病毒表現(xiàn)不明顯，僅靠這一方法還不夠。 2、指示植物檢測法： 指示植物又稱鑒別寄主，指的是對某種或某些特定病毒非常敏感，而且癥狀表現(xiàn)十分明顯的植物。 通常不同病毒應選用不同的植物。馬鈴薯病

11、毒常用指示植物有千日紅、曼陀羅、豇豆、辣椒等。 分為2種 汁液感染法（摩擦接種法） 嫁接檢測法 3、抗血清鑒定法（抗原抗體反應） 原理：由于病毒是由蛋白質和核酸組成的，是一種較好的抗原。將病毒給動物注射后產(chǎn)生抗體。抗原和抗體結合產(chǎn)生血清反應。抗原：病毒。抗體：是指生物體在外來抗原的刺激下產(chǎn)生的一種免疫球蛋白，主要存在于血清中，含抗體的血清稱為抗血清。 4、電子顯微鏡檢查法 直接觀察有無病毒存在，并根據(jù)病毒的大小、形狀和結構等來判斷病毒種類。 5、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA) 把抗原-抗體的免疫反應于酶的催化反應相結合而發(fā)展起來的一種綜合性技術，靈敏度高，特異性強，發(fā)展最快應用最廣的方法。

12、原理：采用酶標記的特異抗體指示抗原-抗體的結合，從而檢測樣品中的抗原定量測定法。雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：(1)將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜質。(2)加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。(3)加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。(4)加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。 五、快速繁殖 莖尖培養(yǎng)得到

13、的脫毒苗不多，用于生產(chǎn)需擴大繁殖。 擴繁方法： 1）組培快繁 2）無毒苗栽到土壤中進行擴繁。如甘薯、草 莓等利用蔓，馬鈴薯、姜、蒜等利用地下部分繁殖。為了預防病毒再感染，擴繁應在培育溫室或防蟲罩內，因為昆蟲傳播病毒。 3）兩種方法相結合，試管內擴繁，移栽后再擴繁。 注意： 1、培養(yǎng)變異的產(chǎn)生，應及時去除 2、脫毒苗并非永遠是無毒苗，由于昆蟲等的傳播，不免會再感染病毒，所以要經(jīng)常脫毒，一般脫毒苗用13代 。 脫毒試管苗為原原種繁殖一代為原種原1代原2代楓樹快繁圖示楓樹快繁圖示月季快繁圖示月季快繁圖示月季快繁圖示月季快繁圖示腋芽在生根培養(yǎng)基中生長兩周，即可有小的幼根生成，三周后，幼根可長至2 cm

14、長。 將上述月季苗經(jīng)過煉苗后，從培養(yǎng)基中取出，小心地洗去根上的培養(yǎng)基，然后將其接種在培養(yǎng)介質中(營養(yǎng)土:蛭石:珍珠巖= 3:1:1)，再將培養(yǎng)介質澆透水，用保鮮膜封上，以防止水分的散失，然后將其放在弱光、濕度大的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，待長出新根后，可移入田間土壤中。具體過程如下圖：月季快繁圖示植物快繁的一般程序1.無菌母體植株的制備： （取材、植物激素、 防止褐化和有害物積累）2.不定芽增殖 ： （增殖的途徑：誘導形成大量胚狀體；誘導形成大量不定芽；促進腋芽的快速形成；愈傷組織增殖）3. 完整植株的形成： 4. 再生植株的馴化 ： 5. 再生植株的鑒定： （植物形態(tài)學鑒定；細胞學鑒定）（一）離體繁殖的

15、一般技術1.外植體的選擇(1)根據(jù)培養(yǎng)目的選擇(2)考慮種質、取材大小、時期和材料的生理狀態(tài)，具有代表性2培養(yǎng)物的增殖 植物的種類和自然生長習性不同，其增殖方式及所采取的相應技術措施也不一樣。一般來講，培養(yǎng)物的增殖有以下4種方式 芽增殖特點主要表現(xiàn)在培養(yǎng)方法簡單，能高度保持遺傳穩(wěn)定性，能長期繼代繁殖。目前采用這一方式快速繁殖的植物有石竹、馬鈴薯、甘薯、草莓、葡萄和月季等。 不定芽增殖 從現(xiàn)存的芽以外的任何器官和組織上通過器官發(fā)生重新形成的芽稱之為不定芽。特點主要表現(xiàn)在繁殖系數(shù)高，有較好的遺傳穩(wěn)定性。 胚狀體增殖 特點是增長率高，胚的雙極性免去了生根環(huán)節(jié)，但胚狀體休眠的誘導和解除還難以把握，其成苗率還不高。因此，目前除一些特殊用途外(人工種子)，這一技術途徑還沒有用于植物的快速繁殖。 愈傷組織增殖 可以說，所有的植物通過組織培養(yǎng)的方法均可以誘導形成愈傷組織,愈傷組織再進一步分化即可獲得