二氯熒光素最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長的測定

1、二氯熒光素最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長的測定實驗室地點：3411實驗時間安排（第5周星期二）8:3010:00 第 3 組10:0011:30 第 4 組（第5周星期三）14:3016:00 第 5 組16:0017:30 第 6 組（第5周星期四）8:3010:00 第7組（第5周星期五）14:3016:00 第1組16:0017:30 第 2 組實驗指導(dǎo)一、實驗?zāi)康恼莆斩葻晒馑刈畲蠹ぐl(fā)波長和最大發(fā)射波長的測量方法；學(xué)會辯別熒光物質(zhì)的分子熒光峰和拉曼散射峰；熟悉島津RF-5301 （日立F-4500）熒光分光光度計的定性掃描方法及定性 測量軟件數(shù)據(jù)處理操作。二、實驗原理任何熒光物質(zhì)都具有激發(fā)

2、光譜和發(fā)射光譜。由于斯托克斯位移，熒光發(fā)射波 長總是大于激發(fā)波長。在一定光源強度下，若保持激發(fā)波長.不變，掃描得到的熒光強度與發(fā)射 波長人的關(guān)系曲線，稱為熒光發(fā)射光譜，它表示在所發(fā)射的熒光中各種波長組 分的相對強度；反之，保持人不變，掃描得到的熒光強度與人ex的關(guān)系曲線，則 稱為熒光激發(fā)光譜，它可以反映不同波長激發(fā)光引起熒光的相對效率。由于各種 不同的熒光物質(zhì)有它們各自特定的熒光發(fā)射波長值，所以，可用它來鑒別各種熒 光物質(zhì)。在一定條件下，熒光強度與物質(zhì)濃度成正比，這是熒光定量分析的基礎(chǔ)。 熒光分析的靈敏度不僅與溶液的濃度有關(guān)，而且與紫外光照射強度及所選測量波 長等因素有關(guān)。同一熒光物質(zhì)的分子熒

3、光發(fā)射光譜曲線的波長范圍(和最大發(fā)射波長)不因 它的激發(fā)波長值的改變而位移，由于這一熒光特性，如果固定熒光發(fā)射波長(Xem)，然后改變激發(fā)波長Qex)，并以熒光強度F對激發(fā)光波長Xex繪圖 即獲得激發(fā)光譜曲線，從中能確定最大激發(fā)波長(Xex)。反之，固定激發(fā)波長 值，測定不同發(fā)射波長時的熒光強度，即得熒光發(fā)射光譜曲線和最大熒光發(fā)射波 長值。三、儀器和試劑1、 儀器 熒光分光光度計(島津RF-5301，日立F-4500)。它的主要技術(shù)指標(biāo) 如下：測量波長范圍：220-900 nm，( 200-900 nm)、光源：脈沖氙燈、測量 模式：激發(fā)光譜，發(fā)射光譜，波長同步光譜，測量方式：定性、定量、三維

4、掃描、 熒光動力學(xué)四面通石英比色皿一個(10mm x 10mm)、25 mL具塞比色管、移液管、吸 耳球、洗瓶、吸水紙2、試劑(1)二氯熒光素標(biāo)準(zhǔn)溶液a儲備標(biāo)準(zhǔn)液(25mg/mL):稱取0.0125g二氯熒光素(A.R)，用0.01molL-1 NaOH溶液溶解后移入500mL容量瓶中并用0.10 mol-L-1 NaOH稀釋至刻度。b工作標(biāo)準(zhǔn)液(0.10 mg/mL):取上述儲備溶液10.00mL于一 500mL容量瓶中，用 蒸餾水稀釋至刻度搖勻，配制成 0.50mg/mL溶液。再移取0.50mg/mL溶液 10.00mL于一 50mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度搖勻。(2) 1.0molL

5、-1 NaOH四、實驗步驟取25mL具塞比色管，加入上述二氯熒光素工作標(biāo)準(zhǔn)溶液5.00mL,然后加 入1.0molLTNaOH 1.0mL，用蒸餾水稀釋到刻度搖勻。打開計算機、打印機和熒光光度計主機，預(yù)熱5分鐘。對熒光光度計進行儀器初始化。 依次在激發(fā)波長值分別為340nm /350nm /360nm，波長掃描范圍為 200-750nm，激發(fā)和發(fā)射波長狹縫寬度分別為5nm，響應(yīng)時間為10nm，掃描速 度為1200時掃描二氯熒光素的各發(fā)射光譜圖，并且通過疊加的三份譜圖分析和 確定二氯熒光素的熒光發(fā)射峰。再確定最大發(fā)射波長值。同時查看其拉曼波長、 瑞利散射波長、以及雙倍頻峰波長。同理，固定最大發(fā)射波長掃描激發(fā)光譜圖。從圖中