光譜分析基礎(chǔ)(本)課件

1、第一章 光譜分析基礎(chǔ)電磁輻射和電磁波譜原子光譜和分子光譜吸收、發(fā)射及散射光譜儀器分析方法的評(píng)價(jià)光譜分析在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 光學(xué)光譜分析 構(gòu)成物質(zhì)的分子、原子或離子經(jīng)輻射能照射后物質(zhì)的總能量就會(huì)發(fā)生變化，在能量相互轉(zhuǎn)化的過程中產(chǎn)生輻射信號(hào)或引起輻射信號(hào)變化。根據(jù)產(chǎn)生的輻射信號(hào)或引起信號(hào)變化，均可進(jìn)行光譜分析 以此實(shí)驗(yàn)手段為基礎(chǔ)而建立分析方法的一門學(xué)科，廣義上都稱光譜分析法 光譜分析以測定物質(zhì)發(fā)射或吸收輻射的波長和強(qiáng)度為基礎(chǔ)。 三個(gè)基本過程：（1）能源(光源)提供能量；（2）能量與被測物之間的相互作用；（3）產(chǎn)生信號(hào)。 三個(gè)基本特點(diǎn)：（1）所有光譜分析法均包含能量（光源）,被測物（樣品）及信號(hào)；（2）

2、對(duì)特定波長的譜線選擇性測量，不涉及混合物分離（不同于色譜分析）；（3）涉及大量光學(xué)元器件。一 電磁輻射1電磁輻射：高速穿過空間的一種能量，即光子流,簡稱為光,其最小單位是光子。 光子的能量與其波長關(guān)系為： E = h = h c / = h c c：光速2.99791010cm*s-1；：頻率；E ：能量； h：普朗克常數(shù)6.62610-34J*s2 產(chǎn)生一定能量的波長計(jì)算為： = h c / E3波長單位: m:1 dm:0.1 cm:0.01 mm:001 m:10-6nm:10-9 pm:10-12.不同波譜區(qū)的波長往往采用的單位不一樣。 ：波數(shù)：每厘米中所含波的數(shù)目，等于波長的倒數(shù)：

3、=1/ 。4 普朗克觀點(diǎn)：1），物質(zhì)吸收或發(fā)射輻射能量不連續(xù)的（量子化）。 2），物質(zhì)分子或原子發(fā)生能級(jí)躍遷時(shí)，產(chǎn)生的輻射能（吸收或發(fā)射的能量）完全等于兩個(gè)能級(jí)之間的能量差。 E =E1-E0= h = h c / = h c 因此，當(dāng)物質(zhì)發(fā)射電磁輻射或者電磁輻射被物質(zhì)吸收時(shí)，就會(huì)發(fā)生能量躍遷。吸收或發(fā)射光的波長越短，躍遷時(shí)產(chǎn)生的能量差越大 例 ：某電子在能量差為3.37510-19J的兩能級(jí)間躍遷，其吸收或發(fā)射光的波長為多少納米？解： 根據(jù)上式，有 = hc/E=6.62610-34Js31010 cms-1/3.37510-19J =5.8910-5cm =589nm5 依外形可分 線光譜

4、(Line spectra): 由處于氣相的單個(gè)原子發(fā)生電子能級(jí)躍遷所產(chǎn)生的銳線，線寬大約為10-5nm。帶狀光譜(Band spectra): 由氣態(tài)自由基或小分子振動(dòng)-轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)躍遷所產(chǎn)生的光譜，由于各能級(jí)間的能量差較小，因而產(chǎn)生的譜線不易分辨開而形成所謂的帶狀光譜，其帶寬達(dá)幾個(gè)至幾十個(gè)nm)；線光譜帶光譜連續(xù)光譜(Continuum spectra)： 包含各種波長的光，由熾熱的固體、液體或高壓氣體所發(fā)的光都形成這種光譜 。 熾熱的固體所產(chǎn)生的連續(xù)輻射是紅外、可見及較長波長的重要輻射源，常用于做光譜分析的光源。 由于固體被加熱到熾熱狀態(tài)時(shí)，無數(shù)原子和分子的運(yùn)動(dòng)或振動(dòng)產(chǎn)生熱輻射，通常也產(chǎn)生背

5、景干擾。 二、電磁波譜 1 范圍包括：射線無線電波所有范圍。其中能為正常人視力感受到的電磁范圍為可見光，其波長為（400780nm) 按波長順序排列得電磁波譜。 各波譜區(qū)所具有的能量不同，其產(chǎn)生的機(jī)理也各不相同。 下面列出了電磁波譜區(qū)的波長范圍和相應(yīng)能量及躍遷能級(jí)類型電磁輻射波譜圖2，一般依其波長及其測定的方法可以分為：射線(0.0051.4)； X射線 (0.1100)； 光學(xué)光譜(100 1000m)； 微波波譜(0.1100cm)。 通常所說的光譜，一般僅指光學(xué)光譜而言。3單色光、復(fù)合光（1）單色光：具有同一波長（或頻率）的光稱為單色光。（2）復(fù)合光：由不同波長的光組合而成的光稱為復(fù)合光

6、。 單色光很難從光源獲得，多數(shù)光源如太陽、白熾燈和氫燈等發(fā)出的光都是復(fù)合光，通過適當(dāng)?shù)氖侄慰梢詮膹?fù)合光中獲得單色光。三、光譜儀器組成：光源，單色器，樣品容器，檢測器（光電轉(zhuǎn)換器、電子讀 出、數(shù)據(jù)處理及記錄）。 光源或熾熱固體樣品容器分光系統(tǒng)光電轉(zhuǎn)換信號(hào)處理器光源燈或激光樣品容器分光系統(tǒng)光電轉(zhuǎn)換信號(hào)處理器光源+樣品分光系統(tǒng)光電轉(zhuǎn)換信號(hào)處理器吸收熒光發(fā)射三種光分析法測量過程示意圖 1、光源對(duì)光源的要求：強(qiáng)度大（分析靈敏度高）、穩(wěn)定（分析重現(xiàn)性好）。 *Laser=light amplification by stimulated emission of radiation 2. 分光系統(tǒng)（mono

7、chromator, wavelength selector）定義：將由不同波長的“復(fù)合光”分開為一系列“單一” 波長的“單色光”的器件。 理想的100%的單色光是不可能達(dá)到的，實(shí) 際上只能獲得的是具有一定“純度”的單色光，即 該“單色光具有一定的寬度（有效帶寬）。有效 帶寬越小，分析的靈敏度越高、選擇性越好、 分析物濃度與光學(xué)響應(yīng)信號(hào)的線性相關(guān)性也越 好。構(gòu)成：狹縫、準(zhǔn)直鏡、棱鏡或光柵。 入射狹縫準(zhǔn)直鏡物鏡棱鏡焦面出射狹縫f入射狹縫準(zhǔn)直鏡光柵物鏡出射狹縫f其中最主要的分光原件為棱鏡和光柵。 3. 試樣裝置：1）吸收池（Sample container，Cell，Cuvette）盛放試樣的吸收

8、池由光透明材料制成。 石英或熔融石英：紫外光區(qū)可見光區(qū)； 玻璃：可見光區(qū)（350-2000nm）； 透明塑料：可見光區(qū)（350-2000nm）； 鹽窗（NaCl, NaBr晶體）：紅外光區(qū)。 2）其它特殊裝置：將在原子光譜中詳細(xì)介紹4. 檢測器：光電轉(zhuǎn)換器（Transducer）1）將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為可以測量的電信號(hào)的器件。2）理想的光電轉(zhuǎn)換器要求： 靈敏度高； 信背比S/N大； 暗電流?。?響應(yīng)快且在寬的波段內(nèi)響應(yīng)恒定。5.記錄系統(tǒng) 將電信號(hào)處理放大并以適當(dāng)?shù)姆绞斤@示或記錄下來，如計(jì)算機(jī)處理。 四 原子光譜和分子光譜 1，原子光譜 原子中價(jià)電子處于能級(jí)最低能量狀態(tài)時(shí)，稱基態(tài)。按受外界能量后(如受

9、到光的照射)，電子躍遷到較高或更高能級(jí)狀態(tài)，稱激發(fā)態(tài)。 基態(tài)與激發(fā)態(tài)之間能量差E120eV，即光子能量。 當(dāng)原子核外電子在不同能級(jí)態(tài)躍遷時(shí)，產(chǎn)生的光譜就叫原子光譜。原子光譜為線狀光譜，每條譜帶對(duì)應(yīng)于一定的波長。其波長負(fù)載了特定元素原子的分析信息，作定性分析依據(jù)。譜帶的強(qiáng)度則往往與樣品中原子濃度大小有關(guān)，作為定量分析依據(jù)。 2，分子光譜 (molecular spectrum)： 在輻射能作用下分子內(nèi)能級(jí)間的躍遷產(chǎn)生的光譜，稱為分子光譜。分子光譜包含幾種不同能量的譜線：電子光譜 ， 振動(dòng)光譜 ， 轉(zhuǎn)動(dòng)光譜（詳細(xì)內(nèi)容在紫外吸收可見光譜一節(jié)討論） 分子光譜法就是以測量分子轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)、振動(dòng)能級(jí)（包含轉(zhuǎn)動(dòng)

10、）及電子能級(jí)（包含振、轉(zhuǎn)）躍遷時(shí)的譜線為基礎(chǔ)定性定量分析物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的方法。除轉(zhuǎn)動(dòng)光譜外，其它分子光譜皆為許多譜線聚集成的帶狀光譜。五. 吸收、發(fā)射及散射光譜1,吸收光譜:當(dāng)物質(zhì)所吸收的電磁輻射能與該物質(zhì)的原子核、原子或分子的兩個(gè)能級(jí)間躍遷所需的能量滿足E = hv的關(guān)系時(shí)，將產(chǎn)生吸收光譜。 M + hv M* 通過測量物質(zhì)的吸收光譜的波長和強(qiáng)度進(jìn)行定性和定量分析的方法叫做吸收光譜分析 。包括原子吸收、紫外可見、紅外吸收等。 。2,發(fā)射光譜物質(zhì)通過電、熱或光獲得能量，其粒子(原子離子或分子)從基態(tài)或低能態(tài)變?yōu)楦吣軕B(tài)原子或分子M* .高能態(tài)粒子又迅速回到低能態(tài)或基態(tài)時(shí)釋放能量從而產(chǎn)生發(fā)射光譜(e

11、mission spectrum） 。 M* M + hv 通過測量物質(zhì)的發(fā)射光譜的波長和強(qiáng)度進(jìn)行定性和定量分析的方法叫做發(fā)射光譜分析法。包括原子發(fā)射和熒光光譜 3 熒光光譜 某些物質(zhì)的分子或原子在輻射能的作用下躍遷至激發(fā)態(tài)，在返回基態(tài)的過程中，先以無輻射躍遷的形式釋放出部分能量，回到第一激發(fā)態(tài)，然后再以輻射躍遷回到基態(tài)，由此產(chǎn)生的光譜稱為熒光光譜。 熒光光譜實(shí)質(zhì)是一種發(fā)射光譜。 由原子產(chǎn)生的熒光光譜稱為原子熒光光譜；由分子產(chǎn)生的熒光光譜稱為分子熒光光譜。4 散射光譜當(dāng)物質(zhì)分子吸收了頻率較低的光能后，并不足以使分子中的電子躍遷到電子的激發(fā)態(tài)，而只是上升到基態(tài)中較高的振動(dòng)能級(jí)上去，若在10-15

12、s10-12s返回到原能級(jí)，此時(shí)輻射出和激發(fā)光相同波長的光，稱為瑞利散射；若返回到較原能級(jí)稍高或稍低的振動(dòng)能級(jí)上，輻射出較激發(fā)光波長稍長或稍短的光，稱為拉曼散射。六 儀器分析方法的評(píng)定要達(dá)到準(zhǔn)確測量的目的，必須了解所用分析方法的可靠性與適用性，嚴(yán)格控測定條件，對(duì)分析方法的準(zhǔn)確度，精密度，檢測下限，分析空白，線性范圍，基體效應(yīng)環(huán)境因素等方面作出評(píng)定 1精密度標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation; S) 對(duì)于微量或痕量物質(zhì)分析，標(biāo)準(zhǔn)偏差更能突出較大偏差的影響。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)或稱變異系數(shù) 儀器分析工作中都用RSD表示分析結(jié)果的精密度。2 準(zhǔn)確度：通常用絕對(duì)誤差或相對(duì)誤差表示。 表示

13、方法（X：測量值 ：真值）(1)絕對(duì)誤差:() =X(2) 相對(duì)誤差(R) = / 100% 通過多次測量已知濃度或含量的物質(zhì)（稱為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)），得到總體平均值與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量（真實(shí)值）比較。 含量1%，準(zhǔn)確度較差； 含量在0.1%1%，其準(zhǔn)確度與化學(xué)分析法近似； 含量在0.001%0.1%或更低時(shí)，其準(zhǔn)確度優(yōu)于化學(xué)分析法。故光譜分析適于微量和痕量分析3 靈敏度（Sensitivity） 反映儀器或方法識(shí)別微小濃度或含量變化的能力。 影響靈敏度的因素有二：a）校正曲線的斜率；b) 分析的重現(xiàn)性或精密度。 國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)，即IUPAC推薦使用“校正靈敏度”或者“校正曲線斜率”作為衡量靈敏度

14、高低的標(biāo)準(zhǔn)。010203040506000.10.20.30.40.50.6ScS2=k2c+Sblank-2S1=k1c+Sblank-1儀器和方法的靈敏度描述 k1, k2分別為兩條校正曲線的斜率，即靈敏度。未考慮測定重現(xiàn)性影響4 檢出限（Detection limit, DL）檢出限：在已知置信水平，可以檢測到的待測物的最小質(zhì)量或濃度。它和分析信號(hào)（Singnal）與 空白信號(hào)的波動(dòng)（噪音, Noise）有關(guān)，或者 說與信噪比（S/N）有關(guān)。 只有當(dāng)有用的信號(hào)大于噪音信號(hào)時(shí)，儀器才有可能識(shí)別有用信號(hào)，如下圖所示。所謂檢出 ，即判定樣品中存有濃度高于空白的待測物質(zhì)。sb測定次數(shù)，nSSDL

15、=Sb +k1 sb儀器噪音及方法檢出限 K1=3時(shí)，可以認(rèn)為儀器檢出的最小信號(hào)值SDL可能性為95%檢出限的計(jì)算1 測定空白樣品(或濃度接近空白值）20-30次，求其 平均值 Sb 及其標(biāo)準(zhǔn)偏差 sb，則可分辨的最小信號(hào) SDL= Sb+k1sb2 通過校正曲線的斜率k，將最小待測物信號(hào)SDL轉(zhuǎn)化為濃度值CDL，即 3 經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)的 t 和 z 檢驗(yàn)，當(dāng)k1=3 時(shí)，大多數(shù)情況下，檢測結(jié)果的置信度為95%。因此上式可轉(zhuǎn)換為：動(dòng)態(tài)范圍CDLLOLLOQ濃度，c響應(yīng)信號(hào)S5 線性范圍（Dynamic range）CDL=檢出限；LOQ (limit of quantitation)定量下限, LO

16、Q=10 s blank LOL=limt of linear response, 定量上限（能準(zhǔn)確地定量測定待測物質(zhì)的最大濃度或量 ）。線性范圍是指信號(hào)與樣品濃度呈線性的工作曲線直線部分通常把相當(dāng)于10倍空白的標(biāo)準(zhǔn)偏差相應(yīng)的濃度定為方法的線性范圍的定量檢測下限。取工作曲線中高濃度時(shí)，彎曲處作為方法的線性范圍的定量檢測上限。好的分析方法要有寬的線性范圍。有的分析方法線性范圍只有一個(gè)數(shù)量級(jí)，有的分析方法線性范圍可達(dá)56個(gè)數(shù)量級(jí)。同一分析方法可用常量、微量、痕量的物質(zhì)分析。 6 儀器分析校正方法 所謂校正(Calibration)，就是將儀器分析產(chǎn)生的各種信號(hào)與待測物濃度聯(lián)系起來的過程。校正方法有

17、三： 標(biāo)準(zhǔn)曲線法； 標(biāo)準(zhǔn)加入法； 內(nèi)標(biāo)法。 1） 標(biāo)準(zhǔn)曲線法（Calibration curve，Working curve, Analytical curve） 具體做法：準(zhǔn)確配制已知待測物濃度的系列: 0 (空白)，c1，c2，c3，c4.；通過儀器分別測量以上各待測物的響應(yīng)值S0，S1，S2，S3，S4及待測物的響應(yīng)值Sx；以濃度c對(duì)響應(yīng)信號(hào)與S作圖得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后通過測得的Sx從下圖中求得cx；或者通過最小二乘法獲得其線性方程再直接進(jìn)行計(jì)算。S440cx 標(biāo)準(zhǔn)曲線法的準(zhǔn)確性與否與兩個(gè)因素有關(guān)：標(biāo)準(zhǔn)物濃度配制的準(zhǔn)確性；標(biāo)準(zhǔn)基體與樣品基體的一致性。 0.0520濃度，cSS2S3S10.00.20.40.60.81.01.230Sx2）標(biāo)準(zhǔn)加入法（Standard addition method） 具體做法：將一系列已知量待測物分別加入到幾等份的樣品中，配制成濃度為(cx+0)，(cx+c1), (cx+c2), (cx+c3).，得到和樣品有相同基體的標(biāo)準(zhǔn)系列(加標(biāo)，spiking)；通過儀器分別測量以上系列的響應(yīng)值S0，S1，S2，S3，S4；以濃度c 對(duì)響應(yīng)信號(hào)與S作圖，再將直線外推與濃度軸相交于一點(diǎn)(下圖)，求得樣品中待