常用免疫學(xué)檢驗技術(shù)的基本原理(共5頁)

1、常用(chn yn)免疫學(xué)檢驗技術(shù)的基本原理 免疫學(xué)檢測即是根據(jù)抗原、抗體反應(yīng)的原理，利用已知的抗原檢測未知的抗體或利用已知的抗體檢測未知的抗原。由于外源性和內(nèi)源性抗原均可通過不同的抗原遞呈途徑誘導(dǎo)生物機(jī)體的免疫應(yīng)答，在生物體內(nèi)產(chǎn)生特異性和非特異性T細(xì)胞(xbo)的克隆擴(kuò)增，并分泌特異性的免疫球蛋白（抗體）。由于抗體抗原的結(jié)合具有特異性和專一性的特點，這種檢測可以定性、定位和定量地檢測某一特異的蛋白（抗原或抗體）。免疫學(xué)檢測技術(shù)的用途非常廣泛，它們可用于各種疾病的診斷、療效評價及發(fā)病機(jī)制的研究。 最初的免疫檢測方法是將抗原或抗體的一方或雙方在某種介質(zhì)中進(jìn)行擴(kuò)散，通過觀察抗原抗體相遇時產(chǎn)生的沉淀

2、反應(yīng)，檢測抗原或抗體，最終達(dá)到診斷的目的。這種擴(kuò)散可以是蛋白(dnbi)的自然擴(kuò)散，例如環(huán)狀沉淀試驗、單向免疫擴(kuò)散試驗、雙向免疫擴(kuò)散實驗。單向免疫擴(kuò)散試驗就是在凝膠中混入抗體，制成含有抗體的凝膠板，而將抗原加入凝膠板預(yù)先打好的小孔內(nèi)，讓抗原從小孔向四周的凝膠自然擴(kuò)散，當(dāng)一定濃度的抗原和凝膠中的抗體相遇時便能形成免疫復(fù)合物，出現(xiàn)以小孔為中心的圓形沉淀圈，沉淀圈的直徑與加入的抗原濃度成正比。 利用蛋白在不同酸堿度下帶不同電荷的特性，可以利用人為的電場將抗原、抗體擴(kuò)散，例如免疫電泳試驗和雙向免疫電泳。免疫電泳首先將抗原加入凝膠中電泳，將抗原各成分依次分散開。然后沿電泳方向平行挖一直線形槽，于槽內(nèi)加入

3、含有針對各種抗原的混合抗體，讓各抗原成分與相應(yīng)抗體進(jìn)行自然擴(kuò)散，形成沉淀線。然后利用標(biāo)準(zhǔn)的抗原抗體沉淀線進(jìn)行抗原蛋白（或抗體）的鑒別。上述的方法都是利用肉眼觀察抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)生的沉淀，因此靈敏度有很大的局限。比濁法引入沉淀檢測產(chǎn)生的免疫比濁法就是利用濁度計測量液體中抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)生的濁度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算抗原（或抗體）的含量。該方法不但大大提高了檢測的靈敏度，且可對抗原、抗體進(jìn)行定量的檢測。 免疫印跡法則首先通過電泳分離標(biāo)準(zhǔn)的已知抗原，然后將電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，浸于待測血清中。如果血清中含有與一種或幾種抗原相對應(yīng)的抗體的話，則在該抗原印跡部位形成免疫復(fù)合物沉淀。在洗去未結(jié)合的

4、抗原和抗體后，在膜上加標(biāo)記的抗人免疫球蛋白的抗體，此抗體可以和病毒抗原與人抗體形成的免疫復(fù)合物發(fā)生反應(yīng)，最后加入顯色底物（可以是普通顯色劑，化學(xué)發(fā)光劑或放射性同位素等）進(jìn)行顯色。由于利用了第二種抗體進(jìn)行了信號放大，并且可以利用高靈敏的顯色方式，靈敏度也得到了很大的提高。目前該方法已經(jīng)利用凝集反應(yīng)檢測抗原抗體反應(yīng)也是較傳統(tǒng)的手段之一。利用帶有抗原的乳膠顆粒等不溶性的顆粒抗原與相應(yīng)(xingyng)抗體結(jié)合形成凝集團(tuán)塊，通過凝集現(xiàn)象，就可以達(dá)到檢測的目的。無論是直接凝集法還是間接凝集法都可對抗原或抗體進(jìn)行檢測。還可以利用二抗對信號進(jìn)行放大，從而提高檢測的靈敏度。 利用補(bǔ)體介導(dǎo)的反應(yīng)（例如溶血反應(yīng)）

5、，檢測抗原抗體(kngt)反應(yīng)也是過去常用的方法?？贵w與細(xì)胞表面抗原相遇，形成紅細(xì)胞-抗體復(fù)合物即可使加入反應(yīng)中的補(bǔ)體活化，導(dǎo)致細(xì)胞的溶解，此方法可用于紅細(xì)胞的各種抗原或相應(yīng)抗體的檢測，此外利用補(bǔ)體反應(yīng)的競爭效應(yīng)，也可對抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行定量的檢測利用帶有標(biāo)記（熒光素、同位素、膠體金或酶）的抗體（抗原）檢測抗原抗體反應(yīng)是目前應(yīng)用最廣泛、最靈敏的方法，使用放射性同位素標(biāo)記法可使檢測的靈敏度達(dá)到pg 級。由于帶標(biāo)記的抗體能準(zhǔn)確而可靠地反映出抗原的位置和數(shù)量，且利用二抗可對信號進(jìn)行放大，因此該方法可用于抗原定性、定量或定位檢測。以下是幾種常用(chn yn)的免疫學(xué)技術(shù)：免疫熒光技術(shù)(jsh)免疫熒光

6、技術(shù)是利用熒光素標(biāo)記的抗體（或抗原）檢測組織、細(xì)胞或血清中的相應(yīng)抗原（或抗體）的方法。由于熒光抗體具有安全、靈敏的特點，因此已廣泛應(yīng)用在免疫熒光檢測和流式細(xì)胞計數(shù)領(lǐng)域。根據(jù)熒光素標(biāo)記的方式不同，可分為直標(biāo)熒光抗體和間標(biāo)熒光抗體。間標(biāo)熒光抗體中一抗并不直接連接熒光素，而是先將一抗結(jié)合到蛋白，然后帶有熒光素的二抗再結(jié)合至一抗。通過二抗的結(jié)合，能將信號進(jìn)行放大，因此能在一定程度上提高檢測的靈敏度，但是隨之帶來的高背景也降低了檢測的特異性。近年來，隨著熒光素和熒光檢測技術(shù)的不斷進(jìn)步，熒光檢測的靈敏度已經(jīng)接近同位素檢測的水平，直接標(biāo)記的熒光抗體逐漸取代間接標(biāo)記抗體。這些標(biāo)記了熒光素的抗體直接結(jié)合至抗原，

7、大大提高了檢測的特異性，使檢測的結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。熒光檢測技術(shù)的發(fā)展，使得免疫熒光技術(shù)在傳染病診斷上有廣泛的用途，如在細(xì)菌、病毒、螺旋體感染的疾病，檢查IgM抗體，做為近期接觸抗原的標(biāo)志。利用單克隆熒光直接標(biāo)記抗體鑒定淋巴細(xì)胞的亞類。通過流式細(xì)胞儀，針對細(xì)胞表面不同抗原，可以同時使用多種不同的熒光抗體，對同一細(xì)胞進(jìn)行多標(biāo)記染色。放射免疫檢測(jin c)放射免疫檢測技術(shù)(jsh)是目前靈敏度最高的檢測技術(shù)，利用放射性同素標(biāo)記抗原（或抗體），與相應(yīng)抗體（或抗原）結(jié)合后，通過測定抗原抗體結(jié)合物的放射性檢測結(jié)果。放射性同位素具有pg 級的靈敏度，且利用反復(fù)曝光的方法可對痕量物質(zhì)進(jìn)行定量檢測。但放射性

8、同位素對人體的損傷(snshng)也限制了該方法的使用。3酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）酶聯(lián)免疫檢測是目前應(yīng)用最廣泛的免疫檢測方法。該方法是將二抗標(biāo)記上酶，抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶催化底物的作用結(jié)合起來，根據(jù)酶作用底物后的顯色顏色變化來判斷試驗結(jié)果，其敏感度可達(dá)ng 水平。常見用于標(biāo)記的酶有辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶（AP）等。由于酶聯(lián)免疫法無需特殊的儀器，檢測簡單，因此被廣泛應(yīng)用于疾病檢測。常用的方法有間接法、夾心法以及BASELISA。間接法是先將待測的蛋白抱被在孔板內(nèi)，然后依次加入一抗、標(biāo)記了酶的二抗和底物顯色，通過儀器（例如酶標(biāo)儀）定量檢測抗原。這種方法操作簡單但由于高背景而

9、特異性較差。目前已逐漸被夾心法取代。夾心法利用二種一抗對目標(biāo)抗原進(jìn)行捕獲和固定，在確保靈敏度的同時大大提高了反應(yīng)的特異性。近年來，抗原的定量檢測技術(shù)也不斷推陳出新。近年來，在夾心法ELISA 的基礎(chǔ)上，開發(fā)了多抗原檢測試劑盒，能同時檢測微量液相樣本中多個抗原含量。這項技術(shù)的應(yīng)用大大縮短了診斷的時間，提高診斷的可靠性和及時性。4免疫金膠體(jio t)技術(shù)膠體金技術(shù)經(jīng)過30 多年(du nin)的發(fā)展到現(xiàn)在已日趨成熟，該方法是將二抗標(biāo)記上膠體金顆粒，利用抗原抗體間的特異性反應(yīng)，最終將膠體金標(biāo)記的二抗吸附于滲濾(shn l)膜上，此方法簡單，快速，廣泛應(yīng)用于臨床篩查。內(nèi)容總結(jié)（1）常用免疫學(xué)檢驗技術(shù)的基本原理 免疫學(xué)檢測即是根據(jù)抗原、抗體反應(yīng)的原理，利用