第-十-章-細(xì)胞的培養(yǎng)課件

1、第十章 真核細(xì)胞的培養(yǎng) Eukaryotic cell culture張雙雙 2013.10.9細(xì)胞培養(yǎng)類型和細(xì)胞株獲得細(xì)胞方式細(xì)胞維護(hù)冷凍和細(xì)胞的儲(chǔ)藏污染培養(yǎng)細(xì)胞類型細(xì)胞來源： 原代細(xì)胞 轉(zhuǎn)化細(xì)胞 雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞生長(zhǎng)方式-細(xì)胞是否貼壁： 貼壁細(xì)胞 懸浮細(xì)胞 獲得細(xì)胞方式原代細(xì)胞持續(xù)傳代的細(xì)胞株復(fù)蘇細(xì)胞原代細(xì)胞 原代細(xì)胞是很難分離得到的，這種細(xì)胞通常要?dú)⑺绖?dòng)物并解剖獲取組織，再分離和培養(yǎng)細(xì)胞，這些操作是非常耗時(shí)，也容易出錯(cuò)。多數(shù)細(xì)胞類型都只能得到一點(diǎn)點(diǎn)，而且原代細(xì)胞的生存時(shí)間很短,原代細(xì)胞是最接近實(shí)物的。獲取來源主要自己分離從公司購(gòu)買，但價(jià)格比較貴從其他人手里索要醫(yī)院和醫(yī)學(xué)院要向做同一種實(shí)驗(yàn)的

2、實(shí)驗(yàn)室索求細(xì)胞最常用最可靠的細(xì)胞株來源之一是ATCC /。 ATCC是一家私營(yíng)非盈利性的組織，它收集、保存、銷售各種動(dòng)物和人類的細(xì)胞株，另外它還提供一些微生物、病毒、DNA探針和植物。傳代細(xì)胞復(fù)蘇細(xì)胞 真核細(xì)胞通常懸浮在帶有血清和冷凍劑的培養(yǎng)基內(nèi)，保存在-196的液氮中。如果是商業(yè)訂購(gòu)的，通常儲(chǔ)存在用干冰包裹的凍存管中。所以凍存后的細(xì)胞必須快速解凍后立即培養(yǎng)，以獲得最大生存能力。細(xì)胞維護(hù)換液傳代凍存與復(fù)蘇換液抗生素的使用培養(yǎng)器械細(xì)胞培養(yǎng)基血清的使用注意事項(xiàng)抗生素 大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都使用抗生素，但是如果無菌操作技術(shù)掌握的好的話，抗生素也不是必須的，畢竟抗生素也會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不利的影響。多數(shù)抗生素在37

3、的半衰期很短，故培養(yǎng)基內(nèi)實(shí)際的抗生素濃度要比以為的低。但是如果你養(yǎng)的細(xì)胞很貴重，或者細(xì)胞來源不容易的話，最好還是加入適當(dāng)?shù)目股?，因?yàn)橐坏┪廴玖?，?duì)實(shí)驗(yàn)者來說是非常棘手的。細(xì)胞培養(yǎng)所用的抗生素一般以干粉形式保存，使用時(shí)用無菌水或其他溶劑將其溶解，這樣所得到的抗生素?zé)o需再進(jìn)行過濾滅菌。培養(yǎng)器械培養(yǎng)瓶 選擇培養(yǎng)瓶類型根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的種類和體積來決定，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用錐形瓶或培養(yǎng)皿來培養(yǎng)懸浮或貼壁的細(xì)胞也有一些其他類型的容器用來培養(yǎng)大量細(xì)胞或是特殊的種類的細(xì)胞。 大多數(shù)組織培養(yǎng)容器是一次性聚乙烯材料的，并通過放射線滅菌，而玻璃容器很少使用，使用起來不如一次性的方便。非處理過的塑料器皿常用來培養(yǎng)懸浮生長(zhǎng)

4、的細(xì)胞，而多數(shù)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞在處理過的器皿表面生長(zhǎng)較好。不同的公司處理器皿的方式不一樣，故細(xì)胞生長(zhǎng)可能偏愛某個(gè)公司的產(chǎn)品，因此不要輕易更換耗材提供商。培養(yǎng)基的顏色培養(yǎng)基中都有酚紅或其他染料pH指示劑 酚紅為例：pH6.5以下為檸檬黃 pH6.5為黃色 pH7.0為橙色 pH7.4為紅色 pH7.6為粉紅色 pH7.8為紫色多數(shù)細(xì)胞的最適pH為7.4左右。注意事項(xiàng)向那些保證培養(yǎng)基不被支原體污染的供應(yīng)商訂購(gòu) 細(xì)胞培養(yǎng)基有許多熱不穩(wěn)定的成分，必須低溫保存，但培養(yǎng)基在接觸細(xì)胞前必須事先（一般是使用10min前）預(yù)熱到37，千萬不要將冷的培養(yǎng)基加入細(xì)胞中。最好買500ml瓶裝的培養(yǎng)基或在500ml的瓶?jī)?nèi)

5、配置。細(xì)胞可能會(huì)用盡培養(yǎng)基中的某種成分,生長(zhǎng)緩慢的細(xì)胞也要勤換培養(yǎng)基。血清 血清能提供細(xì)胞生長(zhǎng)所必須的生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)元素，多數(shù)細(xì)胞需求量比較大，但某些細(xì)胞特別是轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞對(duì)于血清的需要量是很低的，在0.5%左右。注意事項(xiàng)血清濃度：大多數(shù)細(xì)胞的適宜濃度為5%20%。血清的種類：有些細(xì)胞偏愛馬血清，組織細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)血清為小牛血清，而有些細(xì)胞則需要更貴的胎牛血清，還有些細(xì)胞（特別是人的）則需要最貴的同種生物血清。血清是否為熱滅活血清。血清的某些成分預(yù)熱失活，比如補(bǔ)體、支原體。細(xì)胞傳代 每種細(xì)胞都有各自的生長(zhǎng)速率，分瓶時(shí)機(jī)也各不相同。而細(xì)胞的密度情況又會(huì)影響到細(xì)胞自身的生理情況，所以必須耐心的將細(xì)

6、胞維持在合適的密度，而且每次實(shí)驗(yàn)時(shí)細(xì)胞的密度也要盡量保持一致。此外，每次分瓶時(shí)都要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。 分瓶時(shí)，貼壁生長(zhǎng)成單層的細(xì)胞必須從培養(yǎng)瓶上洗到懸浮液中，但這些細(xì)胞常常分泌一些細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），且細(xì)胞間也通過依賴鈣離子的受體配體系統(tǒng)粘在一起使得洗下細(xì)胞變得困難。當(dāng)然也可以把細(xì)胞刮下來，但會(huì)損失細(xì)胞，所以一般使用胰酶消化。對(duì)于附著力強(qiáng)的細(xì)胞，則先用EDTA螯合鈣離子，再用胰酶消化。活細(xì)胞的顯微計(jì)數(shù) 細(xì)胞計(jì)數(shù)法是用來計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中細(xì)胞數(shù)量的一種方法。一般利用計(jì)數(shù)板（血球計(jì)數(shù)板）進(jìn)行。即可用于分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)接種前計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，也可用于對(duì)培養(yǎng)物的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。不論計(jì)數(shù)

7、的對(duì)象如何，均須制備分散的細(xì)胞懸液。步驟1、制備細(xì)胞懸液：對(duì)于懸液培養(yǎng)的細(xì)胞，可直接進(jìn)行下面的步驟2（計(jì)數(shù)與計(jì)算過程）。如果計(jì)數(shù)對(duì)象為貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，首先需將培養(yǎng)物按如下步驟制備成細(xì)胞懸液。1）終止培養(yǎng)，將培養(yǎng)液吸出，用PBS洗培養(yǎng)物一次。2）給培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入1ml 0.25胰蛋白酶溶液，于37消化35min 。期間不斷在鏡下觀察。當(dāng)細(xì)胞變圓接近脫壁時(shí)，棄消化液。3）加入一定量的培養(yǎng)液（如果這些培養(yǎng)細(xì)胞不再有用，可加PBS），用吸管吹打，使細(xì)胞脫壁而制成細(xì)胞懸液。2、計(jì)數(shù)與計(jì)算過程1）在細(xì)胞計(jì)數(shù)板中央放置計(jì)數(shù)專用的蓋玻片。2）用玻璃虹吸管吸取細(xì)胞，讓虹吸管在蓋玻片上或下側(cè)的計(jì)數(shù)板凹蹧處流出懸液，

8、至蓋玻片被液體充滿為止。3）置顯微鏡下計(jì)數(shù)四角大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。對(duì)于壓線的細(xì)胞只計(jì)數(shù)在上線和左線者，對(duì)于細(xì)胞團(tuán)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)。4）按下式計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液的密度：細(xì)胞密度（4個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)/4）104個(gè)/ml 。 臺(tái)昐藍(lán)染色與細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞密度（大格細(xì)胞平均數(shù)）2104個(gè)/ml 。 細(xì)胞冷凍和儲(chǔ)存 細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)的表型會(huì)發(fā)生改變或漂變，所以細(xì)胞必須計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)后應(yīng)馬上凍存。 冷凍細(xì)胞前的準(zhǔn)備： 檢查冷凍細(xì)胞所需試劑和器具是否備齊。 確認(rèn)有無菌的可用于冷凍的凍存管。 確認(rèn)液氮里有你凍存細(xì)胞的位置。冷凍細(xì)胞 1.收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞； 2.以25l臺(tái)盼藍(lán)溶液稀釋25l細(xì)胞懸液；用血球 計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞存活率

9、（至少應(yīng)該在90% 以上) 3.細(xì)胞懸液在4 條件下200g離心10分鐘； 4.將沉淀的細(xì)胞重新懸浮在冷凍液中（大約5106 細(xì)胞/0.5 ml 冷凍液）； 5.將細(xì)胞懸液加入到冷凍管中，每管0.5 ml； 6.將冷凍管置于-80冰箱中； 7.24小時(shí)后，將冷凍管移入液氮罐中； 8.在記錄本或電腦中記錄下每一個(gè)冷凍管的位置以確保在以后應(yīng)用時(shí)能夠找到每一個(gè)冷凍管。 污染 發(fā)生污染，既耽誤時(shí)間又是一個(gè)災(zāi)難，熟練的無菌操作能避免許多問題，但早期檢測(cè)污染是一種可以預(yù)警的方法。對(duì)于培養(yǎng)箱中的細(xì)胞都要注意觀察。要養(yǎng)成習(xí)慣，每次打開培養(yǎng)箱時(shí)，迅速看看有沒有發(fā)生污染，并且動(dòng)作要快，不要長(zhǎng)時(shí)間保持培養(yǎng)箱打開狀態(tài)

10、，打開時(shí)也不要說話。識(shí)別污染肉眼觀察 渾濁情況 培養(yǎng)基的顏色 聞！：把鼻子貼在瓶口去聞，許多污染都能聞到特殊的 味道顯微觀察 視不同微生物污染的情況不同污染分類細(xì)菌真菌支原體黑膠蟲原蟲異種細(xì)胞細(xì)菌細(xì)菌污染是實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染，即使在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素，也可能因?yàn)椴僮鞑簧鞫鹞廴尽Ｗ畛Ｒ姷挠懈锾m氏陽(yáng)性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。 培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。 可在培養(yǎng)液中加相應(yīng)的抗生素處理 真菌真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過程中最常見的一種，最常見的真菌

11、有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培養(yǎng)細(xì)胞受真菌污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點(diǎn)，有的散在生長(zhǎng)，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯(cuò)在細(xì)胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。 真菌污染后，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，但最后由于營(yíng)養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。 支原體 支原體是介于細(xì)菌與病毒之間能獨(dú)立生活的最小微生物，最小直徑0.2m，一般過濾除菌無法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件下生存，對(duì)青霉素有抗藥性。多吸附于細(xì)胞表面或散在于細(xì)胞之間。培養(yǎng)細(xì)胞受支原體污染后，部分敏感細(xì)胞可見細(xì)胞生長(zhǎng)增殖變慢，部分細(xì)胞變圓，從

12、瓶壁脫落。但多數(shù)細(xì)胞污染后無明顯變化，或略有變化，但會(huì)造成細(xì)胞功能變化，若不及時(shí)處理，還會(huì)產(chǎn)生交叉污染。 用泰樂菌素，獸用支原體病的藥，但可用于細(xì)胞培養(yǎng)，無任何不良反應(yīng)。Sigma公司的使用時(shí)用50ug/ml Tylosin培養(yǎng)液培養(yǎng)6天或連續(xù)傳兩代即可清除支原體污染。如果作為常用的抗生素的話, 建議用8ug/ml的濃度。 黑膠蟲可穿透濾膜，也可以通過空氣傳播，低倍下為黑色點(diǎn)狀，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去，培養(yǎng)液也是不渾的，一般不會(huì)太影響，細(xì)胞還是可以用的。常常是細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，且觀測(cè)到的運(yùn)動(dòng)物無明顯增多，且培養(yǎng)液顏色、透明度無明顯變化，可在同一批號(hào)的血清養(yǎng)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不會(huì)有明顯影響，在細(xì)胞增殖旺盛之后會(huì)自然消失，除更換血清外無須特殊處理。建議如果細(xì)胞有可能是此種污染的話，可以增加細(xì)胞的種板密度，以提高細(xì)胞的生存率。 原蟲 培養(yǎng)液可輕微渾濁，顯微鏡下那些細(xì)小的點(diǎn)狀物數(shù)量非常多，輕微活動(dòng)，細(xì)胞雖然可以生長(zhǎng)但繁殖速度卻明顯減慢，而且細(xì)胞狀態(tài)不好，邊緣不清