第-十-章-細胞的培養(yǎng)課件

1、第十章 真核細胞的培養(yǎng) Eukaryotic cell culture張雙雙 2013.10.9細胞培養(yǎng)類型和細胞株獲得細胞方式細胞維護冷凍和細胞的儲藏污染培養(yǎng)細胞類型細胞來源： 原代細胞 轉化細胞 雜交瘤細胞細胞生長方式-細胞是否貼壁： 貼壁細胞 懸浮細胞 獲得細胞方式原代細胞持續(xù)傳代的細胞株復蘇細胞原代細胞 原代細胞是很難分離得到的，這種細胞通常要殺死動物并解剖獲取組織，再分離和培養(yǎng)細胞，這些操作是非常耗時，也容易出錯。多數(shù)細胞類型都只能得到一點點，而且原代細胞的生存時間很短,原代細胞是最接近實物的。獲取來源主要自己分離從公司購買，但價格比較貴從其他人手里索要醫(yī)院和醫(yī)學院要向做同一種實驗的

2、實驗室索求細胞最常用最可靠的細胞株來源之一是ATCC /。 ATCC是一家私營非盈利性的組織，它收集、保存、銷售各種動物和人類的細胞株，另外它還提供一些微生物、病毒、DNA探針和植物。傳代細胞復蘇細胞 真核細胞通常懸浮在帶有血清和冷凍劑的培養(yǎng)基內，保存在-196的液氮中。如果是商業(yè)訂購的，通常儲存在用干冰包裹的凍存管中。所以凍存后的細胞必須快速解凍后立即培養(yǎng)，以獲得最大生存能力。細胞維護換液傳代凍存與復蘇換液抗生素的使用培養(yǎng)器械細胞培養(yǎng)基血清的使用注意事項抗生素 大多數(shù)實驗室都使用抗生素，但是如果無菌操作技術掌握的好的話，抗生素也不是必須的，畢竟抗生素也會對細胞產生不利的影響。多數(shù)抗生素在37

3、的半衰期很短，故培養(yǎng)基內實際的抗生素濃度要比以為的低。但是如果你養(yǎng)的細胞很貴重，或者細胞來源不容易的話，最好還是加入適當?shù)目股?，因為一旦污染了，對實驗者來說是非常棘手的。細胞培養(yǎng)所用的抗生素一般以干粉形式保存，使用時用無菌水或其他溶劑將其溶解，這樣所得到的抗生素無需再進行過濾滅菌。培養(yǎng)器械培養(yǎng)瓶 選擇培養(yǎng)瓶類型根據(jù)培養(yǎng)細胞的種類和體積來決定，大多數(shù)實驗室使用錐形瓶或培養(yǎng)皿來培養(yǎng)懸浮或貼壁的細胞也有一些其他類型的容器用來培養(yǎng)大量細胞或是特殊的種類的細胞。 大多數(shù)組織培養(yǎng)容器是一次性聚乙烯材料的，并通過放射線滅菌，而玻璃容器很少使用，使用起來不如一次性的方便。非處理過的塑料器皿常用來培養(yǎng)懸浮生長

4、的細胞，而多數(shù)貼壁生長的細胞在處理過的器皿表面生長較好。不同的公司處理器皿的方式不一樣，故細胞生長可能偏愛某個公司的產品，因此不要輕易更換耗材提供商。培養(yǎng)基的顏色培養(yǎng)基中都有酚紅或其他染料pH指示劑 酚紅為例：pH6.5以下為檸檬黃 pH6.5為黃色 pH7.0為橙色 pH7.4為紅色 pH7.6為粉紅色 pH7.8為紫色多數(shù)細胞的最適pH為7.4左右。注意事項向那些保證培養(yǎng)基不被支原體污染的供應商訂購 細胞培養(yǎng)基有許多熱不穩(wěn)定的成分，必須低溫保存，但培養(yǎng)基在接觸細胞前必須事先（一般是使用10min前）預熱到37，千萬不要將冷的培養(yǎng)基加入細胞中。最好買500ml瓶裝的培養(yǎng)基或在500ml的瓶內

5、配置。細胞可能會用盡培養(yǎng)基中的某種成分,生長緩慢的細胞也要勤換培養(yǎng)基。血清 血清能提供細胞生長所必須的生長因子和營養(yǎng)元素，多數(shù)細胞需求量比較大，但某些細胞特別是轉化后的細胞對于血清的需要量是很低的，在0.5%左右。注意事項血清濃度：大多數(shù)細胞的適宜濃度為5%20%。血清的種類：有些細胞偏愛馬血清，組織細胞培養(yǎng)的標準血清為小牛血清，而有些細胞則需要更貴的胎牛血清，還有些細胞（特別是人的）則需要最貴的同種生物血清。血清是否為熱滅活血清。血清的某些成分預熱失活，比如補體、支原體。細胞傳代 每種細胞都有各自的生長速率，分瓶時機也各不相同。而細胞的密度情況又會影響到細胞自身的生理情況，所以必須耐心的將細

6、胞維持在合適的密度，而且每次實驗時細胞的密度也要盡量保持一致。此外，每次分瓶時都要對細胞進行計數(shù)。 分瓶時，貼壁生長成單層的細胞必須從培養(yǎng)瓶上洗到懸浮液中，但這些細胞常常分泌一些細胞外基質（ECM），且細胞間也通過依賴鈣離子的受體配體系統(tǒng)粘在一起使得洗下細胞變得困難。當然也可以把細胞刮下來，但會損失細胞，所以一般使用胰酶消化。對于附著力強的細胞，則先用EDTA螯合鈣離子，再用胰酶消化。活細胞的顯微計數(shù) 細胞計數(shù)法是用來計數(shù)細胞懸液中細胞數(shù)量的一種方法。一般利用計數(shù)板（血球計數(shù)板）進行。即可用于分離（散）細胞培養(yǎng)接種前計數(shù)所制備的細胞懸液中的細胞數(shù)量，也可用于對培養(yǎng)物的細胞數(shù)量進行計數(shù)。不論計數(shù)

7、的對象如何，均須制備分散的細胞懸液。步驟1、制備細胞懸液：對于懸液培養(yǎng)的細胞，可直接進行下面的步驟2（計數(shù)與計算過程）。如果計數(shù)對象為貼壁生長的細胞，首先需將培養(yǎng)物按如下步驟制備成細胞懸液。1）終止培養(yǎng)，將培養(yǎng)液吸出，用PBS洗培養(yǎng)物一次。2）給培養(yǎng)瓶內加入1ml 0.25胰蛋白酶溶液，于37消化35min 。期間不斷在鏡下觀察。當細胞變圓接近脫壁時，棄消化液。3）加入一定量的培養(yǎng)液（如果這些培養(yǎng)細胞不再有用，可加PBS），用吸管吹打，使細胞脫壁而制成細胞懸液。2、計數(shù)與計算過程1）在細胞計數(shù)板中央放置計數(shù)專用的蓋玻片。2）用玻璃虹吸管吸取細胞，讓虹吸管在蓋玻片上或下側的計數(shù)板凹蹧處流出懸液，

8、至蓋玻片被液體充滿為止。3）置顯微鏡下計數(shù)四角大方格內的細胞總數(shù)。對于壓線的細胞只計數(shù)在上線和左線者，對于細胞團按單個細胞計數(shù)。4）按下式計數(shù)細胞懸液的密度：細胞密度（4個大格細胞總數(shù)/4）104個/ml 。 臺昐藍染色與細胞計數(shù)細胞密度（大格細胞平均數(shù)）2104個/ml 。 細胞冷凍和儲存 細胞生長時的表型會發(fā)生改變或漂變，所以細胞必須計數(shù)，計數(shù)后應馬上凍存。 冷凍細胞前的準備： 檢查冷凍細胞所需試劑和器具是否備齊。 確認有無菌的可用于冷凍的凍存管。 確認液氮里有你凍存細胞的位置。冷凍細胞 1.收集對數(shù)生長期細胞； 2.以25l臺盼藍溶液稀釋25l細胞懸液；用血球 計數(shù)板計數(shù)并計算細胞存活率

9、（至少應該在90% 以上) 3.細胞懸液在4 條件下200g離心10分鐘； 4.將沉淀的細胞重新懸浮在冷凍液中（大約5106 細胞/0.5 ml 冷凍液）； 5.將細胞懸液加入到冷凍管中，每管0.5 ml； 6.將冷凍管置于-80冰箱中； 7.24小時后，將冷凍管移入液氮罐中； 8.在記錄本或電腦中記錄下每一個冷凍管的位置以確保在以后應用時能夠找到每一個冷凍管。 污染 發(fā)生污染，既耽誤時間又是一個災難，熟練的無菌操作能避免許多問題，但早期檢測污染是一種可以預警的方法。對于培養(yǎng)箱中的細胞都要注意觀察。要養(yǎng)成習慣，每次打開培養(yǎng)箱時，迅速看看有沒有發(fā)生污染，并且動作要快，不要長時間保持培養(yǎng)箱打開狀態(tài)

10、，打開時也不要說話。識別污染肉眼觀察 渾濁情況 培養(yǎng)基的顏色 聞?。喊驯亲淤N在瓶口去聞，許多污染都能聞到特殊的 味道顯微觀察 視不同微生物污染的情況不同污染分類細菌真菌支原體黑膠蟲原蟲異種細胞細菌細菌污染是實驗室細胞培養(yǎng)中常見的污染，即使在細胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素，也可能因為操作不慎而引起污染。最常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。 培養(yǎng)細胞受細菌污染后，會出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。污染后細胞發(fā)生病理改變，胞內顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。 可在培養(yǎng)液中加相應的抗生素處理 真菌真菌污染是細胞培養(yǎng)過程中最常見的一種，最常見的真菌

11、有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培養(yǎng)細胞受真菌污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點，有的散在生長，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯在細胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。 真菌污染后，細胞生長變慢，但最后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。 支原體 支原體是介于細菌與病毒之間能獨立生活的最小微生物，最小直徑0.2m，一般過濾除菌無法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結構。開始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件下生存，對青霉素有抗藥性。多吸附于細胞表面或散在于細胞之間。培養(yǎng)細胞受支原體污染后，部分敏感細胞可見細胞生長增殖變慢，部分細胞變圓，從

12、瓶壁脫落。但多數(shù)細胞污染后無明顯變化，或略有變化，但會造成細胞功能變化，若不及時處理，還會產生交叉污染。 用泰樂菌素，獸用支原體病的藥，但可用于細胞培養(yǎng)，無任何不良反應。Sigma公司的使用時用50ug/ml Tylosin培養(yǎng)液培養(yǎng)6天或連續(xù)傳兩代即可清除支原體污染。如果作為常用的抗生素的話, 建議用8ug/ml的濃度。 黑膠蟲可穿透濾膜，也可以通過空氣傳播，低倍下為黑色點狀，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去，培養(yǎng)液也是不渾的，一般不會太影響，細胞還是可以用的。常常是細胞生長狀態(tài)良好，且觀測到的運動物無明顯增多，且培養(yǎng)液顏色、透明度無明顯變化，可在同一批號的血清養(yǎng)的細胞中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。對細胞生長狀態(tài)不會有明顯影響，在細胞增殖旺盛之后會自然消失，除更換血清外無須特殊處理。建議如果細胞有可能是此種污染的話，可以增加細胞的種板密度，以提高細胞的生存率。 原蟲 培養(yǎng)液可輕微渾濁，顯微鏡下那些細小的點狀物數(shù)量非常多，輕微活動，細胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢，而且細胞狀態(tài)不好，邊緣不清