survivin反義寡核苷酸逆轉(zhuǎn)順鉑誘導(dǎo)的人肺腺癌細(xì)胞凋亡耐受作用

1、survivin反義寡核苷酸逆轉(zhuǎn)順鉑誘導(dǎo)的人肺腺癌細(xì)胞凋亡耐受作用【關(guān)鍵詞】survivin基因；反義寡核苷酸；多藥耐藥性；細(xì)胞凋亡Keyrds：survivingene；Antisenseligdexynuletides；ultidrugresistane；Apptsis0引言順鉑是肺癌化療中的常用藥物，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是其抗腫瘤的主要作用機(jī)制。然而，由于耐藥的產(chǎn)生，限制了其臨床療效的發(fā)揮。因此，尋找有效的方法逆轉(zhuǎn)肺癌順鉑耐藥性，是打破含順鉑肺癌化療方案療效平臺產(chǎn)生的有效途徑之一，并有望改善肺癌患者的遠(yuǎn)期生存期。本研究以survivin為靶點，將人工合成的反義寡核苷酸體外轉(zhuǎn)染耐順鉑人肺腺癌A54

2、9/DDP細(xì)胞，討論其對順鉑誘導(dǎo)的人肺腺癌細(xì)胞凋亡耐受的影響。1材料與方法1.1細(xì)胞株人肺腺癌敏感細(xì)胞株A549，耐順鉑人肺腺癌細(xì)胞株A549/DDP，均購自湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。1.5二苯胺反響法測定DNA片段化比率取各組細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液1l。1000r/in，離心5in，去上清液，加低滲性細(xì)胞裂解液250l重懸，13000r/in，離心10in，汲取上清液移入另一個EP管。分別向上清液管和沉淀管中參加25和12.5三氯乙酸，混勻后置44過夜。次日13000r/in，離心10in，再分別向上述EP管中參加5三氯乙酸80l重懸細(xì)胞，混勻，90水浴30in。2000r/in，離心10in。參加二

3、苯胺反響液250l和高氯酸20l，50水浴2h。將各組樣品置酶標(biāo)儀上測定吸光度值D405n。根據(jù)以下公式計算DNA片段化比率：DNA片段化比率上清液D405n/上清液D405n+沉淀D405n100。1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率搜集各組細(xì)胞，1000r/in，離心5in，棄上清液，參加4預(yù)冷的70乙醇，輕輕吹打混勻，置4固定2472h。離心，去固定液，PBS洗滌，1000rp離心5in，調(diào)整細(xì)胞濃度為1106/l，再次離心，去上清液，加碘化吡啶溶液PI染液1l，使其終濃度為5g/l，4避光染色30in。置FASSrt型流式細(xì)胞儀上，在激發(fā)波長為488n處進(jìn)展檢測，將所得數(shù)據(jù)資料輸入計算機(jī)，并

4、應(yīng)用相應(yīng)的分析軟件進(jìn)展資料的處理和分析，細(xì)胞凋亡比率AI按以下公式計算：AI%=亞二倍峰細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)100%。1.8TT比色法測定細(xì)胞活力和耐藥性搜集對數(shù)生長期細(xì)胞，接種細(xì)胞至96孔培養(yǎng)板上(5103個細(xì)胞/孔)，置37、52、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。按實驗分組要求處理24h后，每孔參加TT應(yīng)用液5g/l10l，繼續(xù)培養(yǎng)46h。參加DS200l/孔，置振蕩儀上振蕩1015in，使甲瓚藍(lán)顆粒完全溶解。置酶標(biāo)儀上測定吸光度值D，檢測波長為570n，按以下公式分別計算A549和A549/DDP的細(xì)胞存活率，并利用直線加權(quán)回歸方程分別求得A549和A549/DDP對DDP的半效抑制濃度I50

5、。細(xì)胞存活率實驗組D570n/對照組D570n100細(xì)胞生長抑制率1細(xì)胞存活率耐藥指數(shù)A549/DDP的I50A549的I501.9統(tǒng)計學(xué)方法所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差s表示，各試驗組與對照組以及試驗組之間的兩兩比擬采用最小顯著差法theleastsignifiantdifferene,LSD分析；經(jīng)SPSS11.5統(tǒng)計軟件包處理，P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1survivinASDN對A549/DDP細(xì)胞DNA片段化比率的影響含ASDN轉(zhuǎn)染組在不同時間點的DNA片段化比率均增高，以48h最為顯著，單用ASDN組為43.556.07，ASDN和DDP聯(lián)用組

6、為76.732.04%，和各對照組相比擬，差異均有顯著性，P0.05。和單用DDP組及單用ASDN組比擬，ASDN和DDP聯(lián)用組該比率亦顯著增高，P0.05,見圖1。2.2survivinASDN對A549/DDP細(xì)胞凋亡率的影響流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，ASDN在不同時間點均可誘導(dǎo)A549/DDP細(xì)胞凋亡，仍以48h最為明顯，單用ASDN組細(xì)胞凋亡比率為34.032.25%，和對照組比擬，差異有統(tǒng)計學(xué)意義P0.05。而ASDN和DDP聯(lián)用組其細(xì)胞凋亡比率最高可達(dá)65.855.47%，和DDP組、NDN+DDP組及LipDDP組相比擬，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，P0.05，見圖2。圖1各組A549/D

7、DP細(xì)胞DNA片段化比率的比擬略圖2各組A549/DDP細(xì)胞凋亡比率的比擬略2.4survivinASDN對A549/DDP細(xì)胞活性的影響A549/DDP細(xì)胞經(jīng)ASDN轉(zhuǎn)染24h、48h和72h后，應(yīng)用TT比色法檢測其吸光度值，并計算出細(xì)胞的存活率和生長抑制率1-細(xì)胞存活率。表1ASDN轉(zhuǎn)染對A549/DDP生長抑制率的影響略注：1和DDP組比擬：a，P0.05,b，P0.05；2和Lip組比擬：，P0.05,d，P0.05；3和NDN組比擬：e，P0.05,，P0.05；4和LipDDP組比擬：，P0.05,，P0.05；5和NDNDDP組比擬：，P0.05；6和ASDN組比擬：*P0.05

8、結(jié)果顯示，單用ASDN轉(zhuǎn)染即可抑制A549/DDP細(xì)胞的生長，其抑制生長效應(yīng)在24h開場增高37.252.21)%，48h達(dá)頂峰59.33.09)%，但72h反而開場減弱，但仍高于對照組P0.05，ASDN和DDP聯(lián)用后，生長抑制效應(yīng)更為顯著，其細(xì)胞生長抑制率最高達(dá)(83.73.04)P0.05，見表1、圖4。2.5survivinASDN對A549/DDP細(xì)胞耐藥性的影響ASDN和5個梯度濃度的DDP結(jié)合使用，經(jīng)TT檢測發(fā)現(xiàn)，ASDN轉(zhuǎn)染組A549/DDP細(xì)胞對順鉑的半效抑制濃度I50為158.844.256l/L，對順鉑的耐藥指數(shù)為8.39倍，而對照組I50及耐藥指數(shù)分別為225.0310.59l/L和11.9倍，而NSDN組和Lip組的I50及耐藥倍數(shù)均無明顯改變(P0.05),見表2。圖4各組細(xì)胞生長活力的比擬略表2ASDN轉(zhuǎn)染對耐順鉑人肺腺癌細(xì)胞A549/DDP耐藥性的影響略注：和DDP對照組比擬：，P0.05;*，P0.05;a和Lip或NDN組比擬，P0.05;b和Lip組比擬，P0.053討論本研究結(jié)果顯示，survivin反義寡核苷酸體外轉(zhuǎn)染可降