08酶工程制藥 -酶工程制藥

1、 第八章 酶工程制藥第一節(jié) 酶工程概論第二節(jié) 藥用酶的來源和生產(chǎn)第三節(jié) 固定化酶工程第四節(jié) 酶工程應用實例第五節(jié) 酶工程研究進展第一節(jié) 酶工程概論一、酶的定義和分類二、酶的特性三、酶的來源四、酶的生產(chǎn)菌種五、產(chǎn)酶菌株的制備和優(yōu)化一、酶的定義和分類酶的定義-酶是生物體內(nèi)具有特殊催化功能的蛋白質。酶的分類-分為6大類1、氧化-復原酶2、轉移酶3、水解酶4、裂合酶5、異構酶6、連接酶合成酶二、酶的特性1、專一性強2、催化效率高3、反響條件溫和4、酶活性的調(diào)控機制復雜醛糖復原酶的活性中心三、酶的來源一來源類別二利用微生物生產(chǎn)酶制劑的優(yōu)點三各種能夠生產(chǎn)酶的微生物一來源類別1、酶作為生物催化劑普遍存在于動

2、物、植物、微生物中，可以直接從生物體中別離提純而獲得，早期酶的生產(chǎn)多是以動植物為主要原料提取而得。2、人工合成酶的方法，目前還受到試劑、設備條件的限制。3、利用動物、植物細胞和組織培養(yǎng)方法來生產(chǎn)酶，由于周期較長、本錢較高，也存在一定難度。4、利用微生物生產(chǎn)酶制劑。二利用微生物生產(chǎn)酶制劑的優(yōu)點1能夠生產(chǎn)酶的微生物種類繁多，有較大的選擇余地。2微生物繁殖快、培養(yǎng)周期短、培養(yǎng)方法簡便，培養(yǎng)過程容易控制，3微生物具有較強的適應性，能夠培育出新的高產(chǎn)菌株。三各種能夠生產(chǎn)酶的微生物1、氧化-復原酶1葡萄糖氧化酶來源于霉菌2D氨基酸氧化酶來源于霉菌、腎臟3尿激酶來源于酵母菌、腎臟4過氧化氫酶來源于細菌、霉菌

3、、紅血球5近氧化物酶來源于植物2、轉移酶1轉氨基酶來源于細菌、動物肝臟2核苷磷酸轉移酶來源于細菌3、水解酶4、裂合酶5、異構酶3、水解酶脂肪酶來源于細菌、霉菌、胰臟5-磷酸二酯酶來源于霉菌淀粉酶來源于細菌、霉菌、胰臟、麥芽果膠酶來源于細菌、霉菌纖維素酶來源于霉菌、蘑菇半纖維素酶來源于霉菌溶菌酶來源于細菌、雞卵白蜜二糖酶來源于霉菌乳糖酶來源于細菌、霉菌轉化酶來源于細菌、酵母透明質酸酶來源于細菌、動物睪丸凝乳酶來源于霉菌、小牛胃、羊胃天冬酰胺酶來源于細菌脲酶來源于豆科植物青霉素?；竵碓从诩毦?、霉菌氨基?；竵碓从诩毦⒚咕?、牛腎臟橙皮苷酶來源于霉菌蛋白酶來源于霉菌、放線菌、動物內(nèi)臟、植物瓜果裂合

4、酶和異構酶4、裂合酶天冬氨酸-脫羧酶來源于細菌-酪氨酸酶來源于細菌延胡索酸酶來源于細菌谷氨酸脫羧酶來源于細菌5、異構酶氨基酸消旋酶來源于細菌、霉菌、酵母葡萄糖異構酶來源于細菌、放線菌四、酶的生產(chǎn)菌種1、對生產(chǎn)菌種的要求2、目前常用的產(chǎn)酶微生物1、對生產(chǎn)菌種的要求1產(chǎn)酶量高2不是致病菌3性能穩(wěn)定，不容易變異、退化、不易感染噬菌體。4能夠利用廉價的原料，發(fā)酵周期短、易于培養(yǎng)。2、目前常用的產(chǎn)酶微生物大腸桿菌-用來生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶、天門冬氨酸酶、青霉素酰化酶、-半乳糖苷酶。曲霉黑曲霉、黃曲霉-用來生產(chǎn)糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、氨基?；?、脂肪酶。枯草桿菌-用于生產(chǎn)a-淀粉酶、-葡

5、萄糖氧化酶、堿性磷酸酯酶。啤酒酵母-用來生產(chǎn)轉化酶、丙酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶。青霉菌-用于生產(chǎn)葡萄糖氧化酶、青霉素酰化酶、5-磷酸二酯酶、脂肪酶。木霉菌-用于生產(chǎn)纖維素酶。根霉菌-用于生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶。鏈霉菌-用來生產(chǎn)葡萄糖異構酶。五、產(chǎn)酶菌株的制備和優(yōu)化1、產(chǎn)酶菌株的培養(yǎng)條件2、菌種的別離篩選3、菌種的變異誘導技術4、原生質體誘導實際生產(chǎn)例子1、產(chǎn)酶菌株的培養(yǎng)條件1產(chǎn)酶促進劑2影響酶產(chǎn)量的各種因素3誘導劑和抑制劑1產(chǎn)酶促進劑在酶制劑的生產(chǎn)過程中，如果添加少量的某種物質就能增加酶的產(chǎn)量，那么這類物質就稱為產(chǎn)酶促進劑。產(chǎn)酶促進劑多數(shù)是酶的誘導物、或者是外表活性劑，常用的產(chǎn)酶促進劑有：

6、A吐溫-80B脂肪酰胺磺酸鈉C聚乙烯醇D糖脂E乙二胺四乙酸EDTA2影響酶產(chǎn)量的各種因素A、溫度-各種產(chǎn)酶微生物對于溫度的要求是各不相同的。細菌：35-37度霉菌：30度酵母菌：30-35度B、PH值-通過掌握原料的配比保持一定的C/N水平、或者通過添加緩沖劑、能夠控制發(fā)酵液的PH值。C、通氣量供氧量訖今為止，產(chǎn)酶和微生物都是需氧性的微生物。在液體深層發(fā)酵中，微生物利用的氧必須是溶解于培養(yǎng)基中和溶解氧。空氣中的氧氣-培養(yǎng)基溶解氧-透過細胞膜進入原生質。精確測定時采用溶氧儀。D、攪拌-攪拌可將泡沫打碎、增加氧氣的溶解速度、加強了液體的湍流作用，有利于營養(yǎng)物質與菌體細胞的接觸，促進細胞新陳代謝。E

7、、泡沫E、泡沫酶制劑發(fā)酵過程中泡沫較多。泡沫的存在會阻止CO2的排除、同時直接影響O2的溶解。排除常常采用：機械力消泡沫法、化學消泡劑消泡沫法。常用的消泡劑有：天然油類、礦物油類、醇類、脂肪酸類、胺類、酰胺類、醚類、磷酸酯類、金屬皂類、聚硅氧烷等等物質。國內(nèi)酶制劑工業(yè)常用的消泡劑為：甘油聚醚聚氧丙烯甘油醚泡敵聚環(huán)氧丙烷環(huán)氧乙烷甘油醚3誘導劑和抑制劑某些酶反響，當培養(yǎng)基中不存在誘導物質時，其酶的合成就受到抑制，而當添加誘導物質時，酶的合成就能順利進行，這類物質稱作誘導劑。使用某些酶的抑制劑常常能夠促進酶的合成，如在多粘芽孢桿菌的培養(yǎng)基中添加淀粉酶抑制劑S-AI，能增加淀粉酶的產(chǎn)量。在酶的生產(chǎn)中，

8、參加適量外表活性劑，也能提高酶制劑產(chǎn)量，如用爪哇真青霉生產(chǎn)纖維素酶時，如果添加0.1%的吐溫-80，那么纖維素酶的產(chǎn)量可提高4倍。2、菌種的別離篩選1含菌樣品質采集2富集培養(yǎng)3菌種純化3、菌種的變異誘導技術1采用物理、化學方法進行誘導物理方法-紫外線、X射線、-射線、高能電子、快速中子?；瘜W方法-亞硝基胍、亞硝酸。2采用基因工程技術進行誘導德國的生物技術人員，提取出大腸桿菌的青霉素?；富颍ㄟ^質粒pBR233，克隆到宿主大腸桿菌中，新構建的工程菌，其產(chǎn)酶能力提高了50倍。在國內(nèi)，有人將產(chǎn)生葡萄糖異構酶的放線菌基因，通過質粒pBR233，克隆到宿主大腸桿菌中，新構建的工程菌，其表觀活力提高了

9、5倍。有人在研究霉菌的淀粉酶基因、或者纖維素基因克隆到酵母菌中，一旦獲得成功，就能夠利用淀粉、纖維素為原料，以酵母菌作為載體，通過發(fā)酵來生產(chǎn)酒精。3采用原生質體融合技術進行誘導原生質體融合育種的頻率要高于普通雜交的方法。不同種屬之間也可進行融合。在曲霉與曲霉、青霉與青霉、鏈霉菌與鏈霉菌、芽孢桿菌與芽孢桿菌之間的融合應用較多。4、原生質體誘導實際生產(chǎn)例子蛋白酶產(chǎn)生菌種之間的原生質體融合共分為7步：A、使用的親本菌株B、菌株標記的獲得C、原生質體的制備D、細胞的再生E、原生質的融合F、融合子的繼代培養(yǎng)、檢驗和生產(chǎn)性能A、使用的親本菌株二親本為：1枯草桿菌2地衣芽孢桿菌二者都是野生型，對利福平和鏈霉

10、素敏感。B、菌株標記的獲得采用紫外線進行誘變，篩選營養(yǎng)缺陷型菌株、和抗藥性菌株，經(jīng)過十代以上傳代，形成穩(wěn)定的突變菌株。C、原生質體的制備二親本接種入完全培養(yǎng)基，37搖瓶培養(yǎng)20小時離心收集菌體，懸浮于0。55mol的NaCl溶液中經(jīng)4000r/min離心15分鐘，洗滌2-3次，離心，棄去上清液菌體細胞懸浮于SMM緩沖液中參加采用SMM液配制的溶菌酶1000單位/ml，置恒溫水浴溶解細胞壁，定時取樣鏡檢，并用計數(shù)板計數(shù)。待原生質球形成之后，以4000-6000r/min離心2次，每次15分鐘，洗滌2-3次、離心放于無菌蒸餾水中，使原生質體膨脹適當稀釋，涂布于完全培養(yǎng)基上32下、培養(yǎng)20小時得原生

11、質體D、細胞的再生mol的NaCl溶液之中適當稀釋，涂布于完全培養(yǎng)基上32下、培養(yǎng)24小時得原生質體再生的細胞E、原生質的融合取等量的二親本原生質體、參加SMM溶液混勻經(jīng)4000r/min離心25分鐘，棄上清液參加由SMM配制的、含30%的、分子量為6000的PEG2-4ml在40下攪勻、保溫2-3分鐘。參加3-10倍量的SMMml/皿涂布到含有二種抗生素的高滲完全培養(yǎng)基上，鏈霉素含量為2000單位/ml，利福平含量為10單位/ml，32下、培養(yǎng)20-36小時得初步的原生質體融合子F、融合子的繼代培養(yǎng)和檢驗和生產(chǎn)性能將初步的原生質體融合子在含有鏈霉素+利福平的平板培養(yǎng)基上連續(xù)傳代，可以檢測出穩(wěn)

12、定的原生質體融合子。融合菌株的生產(chǎn)性能比親株高出30%。 第二節(jié) 藥用酶的生產(chǎn)一、激肽釋放酶二、雙鏈酶三、超氧化物歧化酶四、鏈激酶五、鏈道酶六、彈性酶七、胰酶八、含糖蛋白酶九、糜胰蛋白酶十、淀粉酶十一、菠蘿蛋白酶十二、-半乳糖苷酶十三、天門冬酰胺酶十四、尿激酶一、激肽釋放酶1、藥理功能-具有擴張血管的功能，并能提高血管通透性，起到改善血液循環(huán)的作用。2、臨床應用-治療動脈硬化、血管炎、四肢皮膚潰瘍。3、生產(chǎn)方法1提取法生產(chǎn)-以豬的頷下腺為原料進行提取。2提取法生產(chǎn)-以豬的胰臟為原料進行提取。二、雙鏈酶1、藥理作用-內(nèi)含二種酶，二者合用可去除炎癥物、膿塊、瘀血，促進外傷傷愈合。 1為鏈激酶SK、

13、又稱為溶栓酶。能溶解血栓和滲出物的纖維局部。2為鏈道酶SD、又稱為脫氧核糖核酸酶。能夠液化死細胞2、臨床應用-治療血腫、膿腫、骨髓炎、創(chuàng)傷性感染、潰瘍。3、生產(chǎn)方法-細菌發(fā)酵法生產(chǎn)。三、超氧化物歧化酶1、藥理作用-能專一性地去除人體內(nèi)的超氧陰離子自由基。2、臨床應用-治療類風濕關節(jié)炎，自身免疫疾病、心肌缺血、抗衰老、斷肢再植、整形美容。3、生產(chǎn)方法1提取法-從新鮮豬血中提取2提取法-從玉米中提取鏈激酶和鏈道酶四：鏈激酶鏈激酶SK稱為溶栓酶。能溶解血栓和滲出物的纖維局部。生產(chǎn)方法-由-溶血性鏈球菌發(fā)酵生產(chǎn)五：鏈道酶鏈道酶SD又稱為脫氧核糖核酸酶。能夠液化死細胞。發(fā)酵法生產(chǎn)-由-溶血性鏈球菌發(fā)酵生

14、產(chǎn)。六、彈性酶1、藥理作用-能夠水解彈性蛋白、血纖維蛋白、血紅蛋白。2、臨床應用-用于治療高血脂、慢性支氣管炎、動脈硬化、高血壓、脂肪肝。3、生產(chǎn)方法提取法生產(chǎn)-以豬的胰臟為原料進行提取。七、胰酶1、藥理作用-其成份為胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶。能夠消化淀粉、蛋白質、脂肪。2、臨床應用-助消化，增加食欲。3、生產(chǎn)方法提取法生產(chǎn)-以豬的胰臟為原料進行提取。八、含糖蛋白酶1、藥理作用-是一種蛋白質消化酶2、臨床應用-助消化，增加食欲3、生產(chǎn)方法提取法生產(chǎn)-以豬的胰臟為原料進行提取。九、糜胰蛋白酶1、藥理作用-是一種蛋白質消化酶2、臨床應用-助消化，增加食欲3、生產(chǎn)方法提取法生產(chǎn)-以牛羊的腸粘膜為

15、原料進行提取。十、淀粉酶1、藥理作用-是一種消化酶2、臨床應用-助消化，增加食欲3、生產(chǎn)方法發(fā)酵法生產(chǎn)-以黃曲霉發(fā)酵生產(chǎn)。十一、菠蘿蛋白酶1、藥理作用-具有消炎、抗水腫的作用。2、臨床應用-治療炎癥、水腫、血腫、支氣管炎、肺之、乳腺炎、靜脈炎。3、生產(chǎn)方法提取法生產(chǎn)-以菠蘿的皮為原料進行提取。十二、-半乳糖苷酶1：藥理作用-消化酶，能夠消化乳糖2：臨床應用-適用于嬰兒乳糖消化不良。3：生產(chǎn)方法發(fā)酵法生產(chǎn)-以毛霉米曲酶發(fā)酵生產(chǎn)。十三、天門冬酰胺酶一藥理作用和臨床應用1、藥理作用-對腫瘤細胞具有抑制作用。2、臨床應用-抗腫瘤制劑二生產(chǎn)方法二生產(chǎn)方法發(fā)酵法生產(chǎn)-以大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)。大腸桿菌種子級菌種

16、參加玉米漿，發(fā)酵罐、37下培養(yǎng)7小時取發(fā)酵液，參加丙酮后壓濾濾餅風干，得干菌體參加硼酸緩沖液，PH=8、37下提取得提取液，加醋酸調(diào)節(jié)PH=4。3，得沉淀物，即為干粗酶參加甘氨酸，60熱處理30分鐘得酶溶液，參加聚乙二醇，在不同的PH值下進行精制得無熱源酶液凍干、無菌分裝得天門冬酰胺酶凍干制劑十四、尿激酶1、藥理作用-是一種蛋白質水解酶，具有溶血作用和降血壓作用2、臨床應用-抗血栓3、生產(chǎn)方法提取法生產(chǎn)-以男性新鮮尿液為原料進行提取。第三節(jié) 固定化酶工程一、酶和細胞的固定化二、固定化酶的制備技術三、固定化細胞的制備技術四、固定化生物反響器一、酶和細胞的固定化一固定化酶的定義二固定化生物催化劑的

17、特點三酶固定化的方法分類四細胞固定化的方法分類五固定化技術所用載體一固定化酶的定義固定化酶是指限制或者固定于特定空間位置的酶，具體來說，就是指經(jīng)過物理、化學方法處理，使酶變成不易隨水流失的固定化催化劑。制備固定化酶的過程稱為酶的固定化。酶可以采用經(jīng)過別離后高純度的提純酶、也可以是菌體細胞碎片上的酶系，甚至可以是死細胞上的酶。二固定化生物催化劑的特點1固定化酶屬于修飾酶，這種酶可以通過化學、生物、分子工程手段加以改進。2固定化酶的穩(wěn)定性很高，可以屢次連續(xù)使用。3反響以后，產(chǎn)物中不含酶，易于純化。4反響條件易于控制，可實現(xiàn)連續(xù)化和自動控制。5酶的利用率高，酶的實際使用量較少。6固定化酶比水溶性酶更

18、適合進行多酶反響。三酶固定化的方法分類1、載體結合法2、交聯(lián)法3、包埋法1、載體結合法1物理吸附法2離子結合法3共價鍵結合法1物理吸附法A、物理吸附法的優(yōu)點：1操作簡單2可選用不同的吸附劑3酶失活之后，載體可以再生B、物理吸附法的缺點：1酶的最適吸附量無規(guī)律可尋2酶與載體之間的吸附力不強，酶容易脫落。C、常用的吸附劑C、常用的吸附劑活性炭碳酸鈣-每克載體能吸附1mg酶蛋白。纖維素多孔玻璃酸性白土漂白土高嶺石氧化鋁硅膠膨潤土羥基磷灰石磷酸鈣金屬氧化物-二氧化鈦覆蓋后的不銹鋼顆粒，直徑為100-200um，每克載體能吸附17mg酶蛋白。淀粉谷蛋白陶瓷丁基葡聚糖凝膠已基葡聚糖凝膠單寧纖維素衍生物2離

19、子結合法A、離子結合法的優(yōu)點-操作簡單、處理條件溫和，酶的活性中心不容易被破壞。B、離子結合法的缺點-載體和酶的結合力較弱、常常發(fā)生酶脫落的現(xiàn)象C、常用的離子結合劑樹脂-陰離子交換樹脂、陽離子交換樹脂、多糖類離子交換劑、合成高分子類離子交換劑。每克載體能吸附50-150mg酶蛋白。DEAE-纖維素Amberlite-CG-50Amberlite-XE-97 Amberlite-IR-45Dowex-503共價鍵結合法酶分子上的氨基、羧基、羥基、咪唑基、巰基與載體外表的反響基團形成共價鍵，因而將酶固定在載體上的方法。A、共價鍵結合法的優(yōu)點-酶與載體結合牢固，酶不會發(fā)生脫落。B、共價鍵結合法的缺點

20、-操作復雜、反響條件苛刻，酶的活性中心會遭到局部性的破壞。C、共價鍵結合法的類別重氮化迭氮化酸酐活化法酰氯法異硫氰酸酯法縮合劑法溴化氰活化法烷基化法紀硅烷基化法2、交聯(lián)法1交聯(lián)的優(yōu)缺點2交聯(lián)法的類別和內(nèi)容3參與交聯(lián)的酶蛋白功能團和常用的交聯(lián)劑1交聯(lián)的優(yōu)缺點交聯(lián)法是采用雙功能、或者多功能試劑，使得酶與酶之間發(fā)生交聯(lián)的固定化方法。基團之間的交聯(lián)通過共價鍵結合。交聯(lián)法的優(yōu)點-交聯(lián)后的酶活性較高交聯(lián)法的缺點-反響條件劇烈、酶的回收率低。2交聯(lián)法的類別和內(nèi)容類別酶與酶交聯(lián)法酶與輔助蛋白交聯(lián)法吸附交聯(lián)法載體交聯(lián)法內(nèi)容分子內(nèi)交聯(lián)分子間交聯(lián)酶與輔助蛋白分子之間交聯(lián)酶與載體之間交聯(lián)3參與交聯(lián)的酶蛋白功能團和常用

21、的交聯(lián)劑參與交聯(lián)的酶蛋白功能團N-末端的-氨基賴氨酸的-氨基酪氨酸的酚基半胱氨酸的巰基組氨酸的咪唑基常用的交聯(lián)劑戊二醛雙重氮聯(lián)苯胺-2、2-二磺酸1、5-二氟-2、4-二硝基苯已二酰亞胺二甲酯3、包埋法包埋法的優(yōu)點-不需要改變酶的高級結構，酶的回收率較高。包埋法的缺點-包埋酶容易導致酶的失活，包埋法只適用于小分子底物的反響過程，大分子底物由于無法進入凝膠，故不適用。包埋法分為三類1凝膠包埋法2微囊化包埋法3纖維包埋法1凝膠包埋法凝膠包埋法也稱網(wǎng)格法，是指將酶包埋在高分子凝膠的細策網(wǎng)格之中。凝膠包埋法是目前因定化技術中用得最多的方法。所用的凝膠有：聚丙烯酰胺聚乙烯醇光敏樹脂淀粉明膠膠原海藻膠卡拉

22、膠角叉菜膠2微囊化包埋法將酶包埋在高分子半透膜中的方法，稱為微囊化包埋法。微囊化固定化酶的優(yōu)點-微囊化固定化酶的直徑為幾微米到幾百微米之間的球狀體，其顆粒較小，有利于大分子底物進行反響。微囊化固定化酶的缺點-反響條件要求高，制備本錢也較高。3纖維包埋法此法適用于大規(guī)模生產(chǎn)。纖維包埋法所形成的聚合物，每克能夠包埋1500mg的轉化酶，并且具有良好的穩(wěn)定性。制備時，先把含酶水溶液在高聚物醋酸纖維素、聚氯乙烯的有機溶劑二氯甲烷中進行乳化，然后將乳化液通過一多孔噴絲頭擠壓進凝結浴池中，形成纖維酶溶液便被包裹在纖維內(nèi)將纖維編織成各種酶布，以適合反響器的要求。四細胞固定化的方法分類1交聯(lián)法2包埋法3選擇性

23、熱變性法-此法專用于細胞固定化，是將細胞在適當溫度下處理，使其細胞膜蛋白質變性，但不使其酶變性，從而使酶固定于細胞內(nèi)的方法。五固定化技術所用載體1、固定化載體必須符合的條件1固定化過程不傳統(tǒng)引起酶變性。2對酸堿具有一定的耐受性。3具有一定的機械強度。4具有一定的親水性，并且具有良好的穩(wěn)定性。5具有一定的疏松網(wǎng)狀結構，顆粒均勻。6進行共價鍵結合時，具有可活化基團。7有耐受酶和微生物細胞的能力。8廉價易得。2、常用的固定化載體1物理吸附載體2離子吸附載體3包埋法吸附載體4共價鍵結合載體1物理吸附載體活性炭碳酸鈣纖維素漂白土高嶺石石英砂氧化鋁硅膠礬土膨潤土膠棉羥基磷灰石磷酸鈣凝膠淀粉谷蛋白陶瓷二氧化

24、硅皂土煤渣多孔玻璃酸性白土金屬氧化物二氧化鈦覆蓋后的不銹鋼顆粒丁基葡聚糖凝膠單寧纖維素衍生物已基葡聚糖凝膠2離子吸附載體陽離子交換樹脂陰離子交換樹脂DEAE-纖維素TEAT-纖維素羧甲基纖維素DEAE-SephadexA50Amberlite-CG-50Amberlite-XE-97Amberlite-IR-45Dowex-503包埋法吸附載體聚丙烯酰胺凝膠三醋酸纖維素二醋酸纖維素甲殼素硅膠聚乙烯醇丙烯酸高取物瓊脂瓊脂糖光敏樹脂淀粉明膠膠原海藻膠卡拉膠角叉菜膠4共價鍵結合載體纖維素SephadexA200瓊脂瓊脂糖苯胺多孔玻璃對氨基苯纖維素聚丙烯酰胺膠原尼龍多聚氨基酸多孔玻璃珠金屬氧化物二、固

25、定化酶的制備技術一固定化酶的制備二固定化酶的形狀和性質三固定化酶的活力測定方法一固定化酶的制備1、固定化方法的選擇1固定化酶應用的平安性，應該附合藥用和食用標準。2固定化酶的穩(wěn)定性，能夠長期反復使用。3固定化酶的本錢、水、電、氣、設備、勞務等費用。2、固定化酶的選擇-目前在工業(yè)化大生產(chǎn)經(jīng)常應用的有：1聚乙烯醇2卡拉膠3海藻膠。3、固定化酶制備技術3、固定化酶制備技術1物理吸附法-將酶的水溶液與具有高度吸附能力的載體混合，然后洗去雜質和未吸附的酶，即得固定化酶。2離子吸附法-將解離狀態(tài)的酶溶液與離子交換基混合后，洗去雜質和未吸附的酶，即得固定化酶。3凝膠包埋法-將凝膠材料卡拉膠、海藻膠、瓊脂及明

26、膠與水混合，加熱使之溶解，再降至其凝固點溫度，然后參加預保溫的酶溶液、混合均勻，最后冷卻凝固成型、即成固定化酶。4凝固包埋聯(lián)合法-在進行聚丙烯酰胺包埋時，將酶、混合單體、交聯(lián)緩沖劑一起混合，再參加催化劑，在單體產(chǎn)生聚合反響形成凝膠的同時，將酶限制在網(wǎng)格之中，經(jīng)過破碎后就成為固定化酶。5脂質體包埋法-這是一種采用外表活性劑和磷脂酰膽堿等物質，形成液膜來包埋酶的方法。6纖維包埋法-即前面已經(jīng)講述的酶布包埋方法。7共價鍵結合法-實質上是一種酶 與包埋劑之間的化學反響過程8界面沉降微囊包埋法9界面聚合微囊包埋法10交聯(lián)法8界面沉降微囊包埋法采用與水不相溶的、沸點比水低的有機相A。將酶液在有機相A中乳化

27、、形成油包水的微滴。再在乳化液中參加溶于有機溶劑的高聚物B。再參加不能溶解高聚物B的另上種有機溶劑C。結果使得高聚物在油水界面上沉淀、析出，形成微囊型固定化酶。9界面聚合微囊包埋法含酶的、10%的血紅蛋白溶液 + 已甲叉二胺水溶液-充分混合參加1%的Span-85的氯仿-環(huán)已烷進行分散乳化，再參加溶于有機相的癸二酰氯，酶和載體在油-水界面上發(fā)生聚合反響，棄去上清液，參加Tween-20去乳化，洗去有機溶劑用未聚合的單體，將聚合物轉移到水相之中，就成微囊。所制得的微囊直徑在1-300um之間，每1ml酶溶液可以制得2500cm2總外表積的微囊。10交聯(lián)法是指向酶液中參加多功能試劑，在一定的條件下

28、使酶在分子內(nèi)、或者在分子間形成網(wǎng)絡結構，最終形成固定化酶的技術。交聯(lián)法可以分為：1酶與輔助蛋白交聯(lián)法2吸附交聯(lián)法3載體交聯(lián)法。如0.2%的木瓜蛋白酶和0.3%的戊二醛、在PH=、溫度為0的條件下，24小時即完成酶的固定化。二固定化酶的形狀和性質1、固定化酶的形狀2、固定化酶的性質3、酶穩(wěn)定性的變化1、固定化酶的形狀固定化酶的形狀-酶膜、酶管、酶纖維、微囊、顆粒狀的固定化酶。1顆粒狀的固定化酶-又可分為酶珠、酶塊、酶片和酶粉。其制備方法簡單、顆粒比外表積大，轉化效率高，適用于各類反響器。2纖維狀的固定化酶-只適用于填充床式反響器。3膜狀的固定化酶-也稱為酶膜，其外表積大、滲透阻力小，可用于酶電極

29、、破碎之后也可用于填充床反響器，目前已經(jīng)用于生產(chǎn)木瓜酶、葡萄糖氧化酶、過氧化物酶、氨基?；?、脲酶等。4管狀的固定化酶-其機械強度大，切短之后可用于填充床式反響器，也可組裝成列管式反響器。2、固定化酶的性質1酶活力的變化-經(jīng)過固定化之后，酶的活力大都發(fā)生下降。2酶反響特性的變化-底物專一性，酶經(jīng)過固定化之后，由于位阻效應，其活性會下降。3最適PH值-酶經(jīng)過固定化之后，其最適PH值會發(fā)生變化。4最適溫度-酶經(jīng)過固定化之后，其空間結構更加穩(wěn)定，因此，其最適溫度也會提高。5米氏常數(shù)-改變不顯著。6最大反響速度-會產(chǎn)生一定的差異。3、酶穩(wěn)定性的變化1操作穩(wěn)定性-當固定化酶的穩(wěn)定半衰期到達1個月以上時，

30、就具有工業(yè)應用價值。2貯藏穩(wěn)定性-固定化的胰蛋白酶在20保存數(shù)月，其活性不變。3對熱穩(wěn)定性-由于加熱提高了反響速度，從而提高反響效率。4對蛋白酶的穩(wěn)定性-大多數(shù)天然酶在經(jīng)過固定化之后，它們對于蛋白酶的耐受力均有大幅度提高。這在工業(yè)生產(chǎn)中是極為有利的。三固定化酶的活力測定方法在酶促反響中，其底物或者產(chǎn)物具有光吸收、旋光、電位差、熒光等變化，可以使用分光光度計進行直接測定。1分批測定法固定化酶在攪拌、振蕩的情況下，每間隔一定時間取樣，過濾之后按常規(guī)方法測定。2連續(xù)測定法從反響器中引出反響液到流動比色杯中，在分光光度計中進行連續(xù)測定?；蛘咄ㄟ^測定反響過程中氧氣、NH4、電導率、消化系數(shù)來確定酶的活力

31、。酶活力測定儀器三、固定化細胞的制備技術1、固定化細胞的制備2、固定化細胞的形狀和性質訖今為止技術上還沒有過關的原因：1細胞培養(yǎng)技術存在著難題。2固定化之后，細胞的生物學活性存在著障礙。3細胞固定方法上在套用酶固定化技術，但是細胞不同于酶的單分子蛋白質，技術共用難度很大。在此只能作為標題介紹，不宜展開。四、固定化生物反響器1、酶反響器2、固定化反響器的類型和特點3、固定化反響器的選擇依據(jù)1、酶反響器用于酶催化反響的裝置稱為酶反響器，它可用于溶液酶、也可用于固定化酶。2、固定化反響器的類型和特點1間歇式攪拌反響罐BSTR2連續(xù)流動攪拌反響罐CSTR3填充式反響罐PBR4流化床反響器FBR5循環(huán)反

32、響器RCR6連續(xù)流動攪拌超濾膜反響器CSTR/UF7其它反響器1間歇式攪拌反響罐BSTR也稱為分批攪拌反響器。其特點是結構簡單、操作方便。其缺點是，經(jīng)過單一批次的反響之后，酶就隨著反響產(chǎn)物流失。主要用于游離酶反響。當前食品和飲料工業(yè)中常用這類反響器。其方法是將酶和底物一起參加到反響器中，控制反響溫度，當?shù)竭_預期的轉化率時，隨即放料。2連續(xù)流動攪拌反響罐CSTR這是一種連續(xù)進料、連續(xù)出料的反響器。結構上與間歇式攪拌反響器根本相同。3填充式反響罐PBR屬于使用最普遍的反響器。主要用于固定化酶生產(chǎn)的反響器。固定化酶通常以各種形狀如球形、碎片、薄片、丸粒填充于反響層內(nèi)。固定化酶所使用的載體有多也玻璃珠

33、、珠狀離子交換樹脂、聚丙烯酰胺凝膠、二乙胺乙基葡聚糖凝膠，膠原蛋白薄膜片。填充式反響罐系統(tǒng)運轉時，底物按照向上流動的方向以恒定的速度通過反響床。4流化床反響器FBR在流化床反響器，底物溶液以足夠大的流速向上通過反響床。使得固體顆粒處于流化狀態(tài)，從而來增加反響效率。由于流化床反響器具有混合程度高，傳熱性能良好等特點，因此可以用來處理粘性較強的底物、或者用來處理含有固體顆粒的底物。5循環(huán)反響器RCR這種反響器是讓局部反響產(chǎn)物流出，流出物再與原始底物混合之后重新流入反響系統(tǒng)的方法。循環(huán)反響器能夠提高液體的流速，并能減少底物在固定化酶外表沉積，從而到達較高的轉化效率。當反響底物是不溶性物質時，可以采用

34、循環(huán)反響器生產(chǎn)。6連續(xù)流動攪拌-超濾膜反響器CSTR/UF連續(xù)流動攪拌-超濾膜反響器=連續(xù)流動攪拌反響器 + 超濾膜裝置。超濾膜被安裝在連續(xù)流動攪拌反響器的出口處，這種膜只允許反響產(chǎn)物、或者是未曾反響的底物通過，而分子量較大的酶就被截留在反響器中，從而實現(xiàn)酶的反復利用。7其它反響器淤漿式反響器滴流床反響器氣栓式流動反響器轉盤式反響器篩板反響器復合類反響器3、固定化反響器的選擇依據(jù)1根據(jù)固定化酶的形狀來選擇。2根據(jù)底物的物理性質來選擇。3根據(jù)外界環(huán)境條件對于酶的穩(wěn)定性來選擇。4根據(jù)操作要求和固定化酶反響器的投資費用來選擇。第四節(jié) 酶工程應用實例一、L-天門冬酸生產(chǎn)工藝二、固定化細胞法生產(chǎn)6-氨基

35、青霉烷酸三、固定化酶法生產(chǎn)5-復合單核苷酸注射液四、固定化酶法生產(chǎn)L-氨基酸五、r-氨基丁酸的生產(chǎn)工藝六、L-多巴的生產(chǎn)工藝實例1、酶 工程產(chǎn)品益生源，用于飼料添加劑例2、酶工程產(chǎn)品萬壽膠囊，用于補充人體營養(yǎng)物質例3、生態(tài)復合酶制劑，用于改善環(huán)境例4、酶工程藥品和化裝品原料例5、膜反響器，用于污水處理第五節(jié) 酶工程研究進展一、酶的化學修飾二、酶的人工模擬三、有機相中的酶反響四、基因工程酶的構建略一、酶的化學修飾1、關于酶的化學修飾2、常用的化學修飾劑3、化學修飾方法4、修飾酶所具有的新特征1、關于酶的化學修飾1原因-但是由于酶是一種蛋白質，常常在應用過程中出現(xiàn)異體蛋白的抗原性、容易被水解、容易

36、受抑制、在反響系統(tǒng)中半衰期較短等缺點。因此提高酶的穩(wěn)定性、解除酶的抗原性就成為技術關鍵。2定義-酶的化學修飾就是在分子水平上，采用化學方法對酶進行改造，通過添加一些化學基團，或者采用具有生物相容性的大分子進行共價鍵聯(lián)接，從而改變酶分子性質的一種技術。2、常用的化學修飾劑化學修飾劑的要求-具有較大的分子量，具有良好的生物相容性、具有水溶性，分子外表具有較多的反響基團。1糖以及糖的衍生物-右旋糖苷、右旋糖苷硫酸酯、糖肽、葡聚糖凝膠、聚乳糖。2高分子多聚物-聚乙二醇PEG、聚乙烯醇PVA、聚N-乙烯吡咯烷酮PVP、聚丙烯酸PAA。3生物大分子-肝素、血漿蛋白質、聚氨基酸。4雙功能試劑-戊二醛、二異硫

37、氰酸、二胺類。5其它試劑-糖基化試劑、甲基化試劑、乙基化試劑。3、化學修飾方法1修飾酶的功能基團-如氨基、羧基、羥基、巰基、咪唑基。來提高穩(wěn)定性。2在酶分子內(nèi)進行交聯(lián)、或者進行分子間的交聯(lián)-提高酶解能力、消除抗原性。3修飾酶的輔助因子-提高穩(wěn)定性。4使酶與高分子化合物相結合-提高穩(wěn)定性。4、修飾酶所具有的新特征1對熱的穩(wěn)定性有所提高。2具有對抗各類失活因子的能力。3抗原性消除。4體內(nèi)的半衰期有所延長。5最適PH值發(fā)生改變。6酶反響特性發(fā)生變化。7在人體組織中的分布能力發(fā)生變化，有利于被靶器官選擇性的吸收。二、酶的人工模擬根據(jù)酶的作用原理，采用人工方法合成的，具有活性中心和催化反響作用的、非蛋白

38、質結構的化合物，稱為人工模擬酶。人工模擬酶的構成條件：1具有能夠識別底物的分子結構，2具有酶活性部位的催化基團。1、環(huán)糊精2、分子印跡技術1、環(huán)糊精它具有一個疏水的結合部位，能與有機分子形成包絡物，同時，它還能催化一些反響。環(huán)糊精分子是一個椅子狀的空穴結構，空穴的邊緣是一些葡萄糖羥基，使得環(huán)湖精能夠溶液于水。空穴的中間那么是疏水結構，能夠將有機小分子束縛到空穴之中。環(huán)糊精的酶促反響過程為-參與反響的底物先被環(huán)糊精分子包束，然后再發(fā)生酶促反響。環(huán)糊精所模擬的胰凝乳蛋白酶，其催化效率與天然的胰凝乳蛋白酶相同。但是，環(huán)糊精的對熱穩(wěn)定性、對PH值穩(wěn)定性那么大大高于天然的胰凝乳蛋白酶。2、分子印跡技術分子印跡技術是制備針對某一特定分子具有特異性結合能力的聚合物的過程。其實質已經(jīng)接近于基因芯片技術1分子印跡技術的過程2分子印跡技術的應用價值1分子印跡技術的過程1特定分子 + 特異性結合的功能單體，發(fā)生互補性結合作用，形成特定分子-功能單體復合物。2采用交聯(lián)劑，在特定分子-功能單體復合物周圍發(fā)生聚合反響，形成交聯(lián)聚