國家食品沙門氏菌檢測(內(nèi)含簡圖很有用)

1、國家食品沙門氏菌檢測（內(nèi)含簡圖很有用）國家食品沙門氏菌檢驗(yàn)刖百沙門氏菌是腸桿菌科中一種重要的人畜共患病原菌，革蘭氏陰性，是細(xì)菌性食物中毒的重要致病菌。血清型種類繁多，目前全世界已分離出2523個(gè)血清型，我國已發(fā)現(xiàn)216個(gè)1.。與人類疾病有關(guān)的血清型主要集中于AE群，包括傷寒沙門氏菌、（甲、乙、丙型）副傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、腸炎沙門氏菌等，其中以鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌及豬霍亂沙門氏菌最為常見。它不僅能導(dǎo)致雞白痢、雞傷寒、副傷寒、仔豬副傷寒等動(dòng)物疾病，還能使人類發(fā)生傷寒、副傷寒、敗血癥、胃腸炎和食物中毒2。根據(jù)國際慣例，要求對易受沙門氏菌污染的食品進(jìn)行分類管理以使大多

2、數(shù)食物不含沙門氏菌，從而有效預(yù)防沙門氏菌引發(fā)的各種疾病。20世紀(jì)50年代以來，國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的研究，從以傳統(tǒng)方法為基礎(chǔ)發(fā)展到以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的或以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的快速檢測方法，并在實(shí)踐檢驗(yàn)中不斷取得新進(jìn)展。這些方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法、免疫磁珠法、免疫熒光標(biāo)記法、噬菌體裂解試驗(yàn)法、核酸探針法等3。本實(shí)驗(yàn)采用的是傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，包括前增菌，選擇性增菌，選擇性平板分離，生化試驗(yàn)，血清學(xué)分型鑒定五個(gè)步驟。材料與方法1.1設(shè)備和材料恒溫培養(yǎng)箱：36C1C,42C1C拍擊式均質(zhì)器。1.1.3電子天平：感量0.1g。1.1.4無菌錐型瓶：容量500ml，250ml。微量移液器及吸頭。1.1.6無

3、菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。1.1.7無菌試管：3mmx5mm、10mmx75mmo1.1.8無菌毛細(xì)管。1.1.9三角燒瓶。1.2培養(yǎng)基和試劑1.2.1緩沖蛋白胨水（BPW）:稱取蛋白胨10g,NaCl5g,Na2HPO412H2O9g，KH2PO41.5g加蒸餾水1L,攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝三瓶，121C,滅菌20min。1.2.2四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液：稱取18.72g,加蒸餾水200ml,攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝試管，每管10ml,121C,滅菌20min,此上配制的為基礎(chǔ)液，冷卻至50C,每100ml基礎(chǔ)液加入碘液2ml,0.1%煌綠液1ml,混勻備用。1.2.3亞硒酸

4、鹽胱氨酸（SC）增菌液：稱取4.6g，加蒸餾水200ml,攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝試管，每管10ml,無需高壓滅菌，冷卻至常溫立即使用。1.2.4亞硫酸鉍（BS）瓊脂：稱取39.3g，加蒸餾水950ml,攪拌加熱煮沸至完全溶解，無需高壓滅菌，為基礎(chǔ)液；稱取8g指示劑，加水50ml,水浴50X左右，攪拌溶解，將50ml指示劑加入950ml已冷卻到50C的基礎(chǔ)液，混勻后立即傾注平板。HE（HektoenEnteric）瓊脂：稱取牛肉膏5g,蛋白胨10g,NaCl5g,瓊脂20g，加蒸餾水1L,攪拌加熱煮沸至完全溶解，無需高壓滅菌，冷卻到50X,立即傾注平板。1.2.6三糖鐵（TSI）瓊脂：1.

5、2.7蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑：1.2.8尿素瓊脂（PH7.2）:1.2.9氰化鉀（KCN）培養(yǎng)基及其對照氰化鉀培養(yǎng)基：1.2.10賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基及其對照培養(yǎng)基：1.2.11甘露醇及山梨醇培養(yǎng)基：1.2.12鄰硝基酚B-D半乳糖苷（ONPG）培養(yǎng)基：1.3、檢驗(yàn)程序41.3.1沙門氏菌檢驗(yàn)程序見圖1. .3.2.1培養(yǎng)基的配制按照1.2的部分配制。1.3.2.2前增菌稱取25g樣品放入盛有25mlBPW的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打仆2min。樣品為液態(tài)，直接進(jìn)行培養(yǎng)，于36C1C培養(yǎng)8h18h。1.3.2.3選擇性增菌輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)過的樣品混合物，移取1ml,轉(zhuǎn)種于10mlTTB培養(yǎng)基

6、內(nèi)；于42C士1C,18h24h培養(yǎng)。另取1ml,轉(zhuǎn)種于10mlSC內(nèi)，于36C1C,18h24h培養(yǎng)。1.3.選擇性平板分離分別用接種環(huán)取經(jīng)TTB增菌液1環(huán)，劃線接種于一個(gè)BS瓊脂平板和一個(gè)HE瓊脂平板。同時(shí)，另取SC增菌液1環(huán)，劃線接種于個(gè)BS瓊脂平板和一個(gè)HE瓊脂平板。于36C1C分別培養(yǎng)18h24h（HE瓊脂平板）或40h48h（BS瓊脂平板），觀察各個(gè)平板上生長的菌落，各個(gè)平板上的菌落特征見表1表1沙門氏菌在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征選擇性瓊脂平板沙門氏菌BS瓊脂菌落為黑色有金色光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變HE瓊脂藍(lán)綠

7、色或藍(lán)色，多數(shù)菌落中心黑色或幾乎全黑色；有些菌株為黃色，中心黑色或幾乎全黑色1.3.生化試驗(yàn)1.3.2.5.1擴(kuò)培典型或可以菌落自選擇性瓊脂平板上挑取一個(gè)典型或可以菌落，營養(yǎng)瓊脂平板，與36C1C培養(yǎng)18h24h,必要時(shí)可延長至48h。得到純培養(yǎng)。1.3.2.5.2接種生化培養(yǎng)基將營養(yǎng)瓊脂平板上的純培養(yǎng)物接種三糖鐵瓊脂，現(xiàn)在先在斜面劃線，在于底層穿刺；接種針不要滅菌，直接接種賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基。賴氨酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)要同時(shí)接種試驗(yàn)管和對照管。同時(shí)，可直接接種蛋白胨水（供作靛基質(zhì)試驗(yàn)）、尿素瓊脂H7.2）、氰化鉀（KCN）培養(yǎng)基、甘露醇和山梨醇試驗(yàn)。所有試管于36C1C培養(yǎng)18h24h氰化鉀必要時(shí)

8、可延長至48h，將已挑菌落的平板儲(chǔ)存于2C5C或室溫至少保留24h,以備必要時(shí)復(fù)查。1.3.2.5.3結(jié)果觀察與判斷1.3. .5.3.1通過TSI和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)進(jìn)行初步判斷，反應(yīng)結(jié)果見表2三糖鐵瓊脂賴氨酸脫竣酶試初步判斷表2沙門氏菌屬在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果三稱鐵瓊脂賴氨酸脫竣酶試初步判斷屬的可能，同時(shí)也有不是沙門氏菌屬的可能。 #.5. #.5.注：TSI結(jié)果判定方法：斜面黃色為+,紅色為-；底層黃色為+,紅色為-；產(chǎn)氣可以觀察培養(yǎng)基內(nèi)的氣孔；硫化氫的判斷是培養(yǎng)基轉(zhuǎn)黑色為+,黃色為-,入試管地步全部為黑色可以判斷底層為+。賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)試管為藍(lán)綠色，對照變黃為

9、陽性，試驗(yàn)管和對照管均變黃為陰性。1.3.2.5.3.2通過TSI反應(yīng)中的H2S、靛基質(zhì)試驗(yàn)、尿素瓊脂(pH7.2)、KCN實(shí)驗(yàn)結(jié)果，查表3將可疑反應(yīng)分為A1、A2、A3。表3沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表1.3.2.5.3.3反應(yīng)系列號A1:典型反應(yīng)為沙門氏菌屬。如尿素、氰化鉀和賴氨酸脫羧酶3項(xiàng)中有一項(xiàng)異常，按表4可判斷為沙門氏菌屬。如2項(xiàng)異常為非沙門氏菌屬。表4沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒定表pH兀2尿素亂化鉀(KCN)賴氨酸脫隸酶鄭定結(jié)果-甲型副傷寒沙門氏菌屬(要求血淸學(xué)鑒定結(jié)果)-+沙門氏歯IV或V(要求符合本群生化特征4-+沙門氐荊個(gè)別變體姿求血清學(xué)驚定結(jié)果)注：十陽性；-陰性1.3.2.

10、5.3.4反應(yīng)序號A2:補(bǔ)做甘露醇和山梨醇實(shí)驗(yàn)，沙門氏菌靛基質(zhì)陽性變體兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽性，但需要結(jié)合血清學(xué)鑒定結(jié)果進(jìn)行判定。甘露醇和山梨醇實(shí)驗(yàn)結(jié)果為黃色是陽性，紫色是陰性。1.3.2.5.3.5反應(yīng)序號A3:補(bǔ)做ONPG。ONPG陰性為沙門氏菌，同時(shí)賴氨酸脫羧酶陽性，甲型副傷寒沙門氏菌為賴氨酸脫羧酶陰性。1.3.2.5.API20E生化鑒定試劑盒如選擇API20E生化鑒定試劑盒可根據(jù)表2的初步判定結(jié)果，從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落，用生理鹽水制備成濁度適當(dāng)?shù)木鷳乙海褂肁PI生化鑒定試劑盒或VITEK全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。1.3.2.6血清學(xué)鑒定1.3.2.6.1抗原的準(zhǔn)備一般釆用1

11、.2%1.5%瓊脂培養(yǎng)物作為玻片凝集實(shí)驗(yàn)用的抗原。本次試驗(yàn)釆用擴(kuò)大培養(yǎng)營養(yǎng)瓊脂平皿上的菌落做實(shí)驗(yàn)。1.3.2.6.2多價(jià)菌體抗原(O)鑒定在玻片上畫出兩個(gè)約1cmX2cm的區(qū)域，挑取1環(huán)待測菌，各放1/2環(huán)于玻片上的每一區(qū)域上部，在其中一個(gè)區(qū)域下部加1滴多價(jià)菌體(O)抗血清，在另一區(qū)域下部加入1滴生理鹽水，作為對照。再用無菌的接種環(huán)或針分別將兩個(gè)區(qū)域內(nèi)的菌落研成乳狀液。將玻片傾斜搖動(dòng)混合1min,并對著黑暗背景進(jìn)行觀察，任何程度的凝集現(xiàn)象皆為陽性反應(yīng)。2結(jié)果與分析2.1樣品在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果如下表三糖鐵瓊脂賴氨酸脫數(shù)酶試驗(yàn)培養(yǎng)基初步判斷鼎面底層產(chǎn)氣硫化氫-+(-)H-)+可讎沙門氏菌屬結(jié)果顯示有沙門氏菌屬的可能，同時(shí)也有不是沙門氏菌屬的可能。2.2樣品生化反應(yīng)結(jié)果如下表硫化氫(H2S)靛基演pH7.2尿素執(zhí)化鉀(KCN)賴氨酸脫按酶+r4-結(jié)果符合序列A2,補(bǔ)做甘露醇和山梨醇實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，甘露醇和山梨醇實(shí)驗(yàn)結(jié)果為紫色，是陰性。2.3血清學(xué)鑒定結(jié)果經(jīng)過多價(jià)