高GC的模板缺失難以擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)總結(jié)

1、GC含量較高的模板缺失難以擴(kuò)增情況的實(shí)驗(yàn)總結(jié):可以從以下2個(gè)方面考慮：第一個(gè)方面是反轉(zhuǎn)錄酶的問題：GC含量高，可能會(huì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，而且在低溫時(shí)很難打開,因此使用普通的反轉(zhuǎn)錄酶可能難以奏效。常用反轉(zhuǎn)錄酶有（MMLV）,最適作用溫度為37C和AMV,最適作用溫度為42C。除此之外，還有2種：Thermusthermophilus、Thermusflavus等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉(zhuǎn)錄酶：在Mn2+存在下，允許高溫反轉(zhuǎn)錄RNA,以消除RNA模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)；MMLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH-突變體：商品名為Superscript和SuperScriptII。此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉(zhuǎn)換成cD

2、NA,這一特性允許從含二級(jí)結(jié)構(gòu)的、低溫反轉(zhuǎn)錄很困難的mRNA模板合成較長(zhǎng)cDNA。當(dāng)然這些酶代價(jià)較高?？梢栽囈幌聦MV的延伸溫度提高到55C,雖然在這樣溫度下，引物延伸反應(yīng)的得率通常降低，單可以消除次級(jí)結(jié)構(gòu)。AMV對(duì)次級(jí)結(jié)構(gòu)耐受。第二個(gè)方面就是PCR的問題了。（你的反應(yīng)72延伸時(shí)時(shí)間可以長(zhǎng)點(diǎn)）GC含量的模板，需要其他的措施。影響DNA熔解溫度的添加劑提供了提高產(chǎn)物特異性和產(chǎn)量的另外一種方法。為獲得最好的結(jié)果需要模板的完全變性。另外，二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)阻止引物結(jié)合和酶的延伸。PCR添加劑，包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜堿以及PCRxEnhancerSolution可以增強(qiáng)擴(kuò)增。它們可能的機(jī)理是降低熔

3、解溫度，從而有助于引物退火并輔助DNA聚合酶延伸通過二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)。PCRxSolution還有其他優(yōu)點(diǎn)。在同PlatinumTaqDNA聚合酶和PlatinumPfxDNA聚合酶一起使用時(shí)，僅需很少的鎂離子優(yōu)化。這樣，將Platinum技術(shù)同添加劑結(jié)合，增強(qiáng)了特異性，同時(shí)減少了第三種方法-鎂離子優(yōu)化的依賴。為獲得最佳結(jié)果，應(yīng)優(yōu)化添加劑的濃度，尤其是會(huì)抑制TaqDNA聚合酶的DMSO，甲酰胺和甘油、甜菜堿。1甘油（5%-10%）,甲酰胺（1%-5%）或者DMSO（2%-10%）、13mol/L甜菜堿可以加到高GC含量DNA模板的PCR反應(yīng)（這些試劑改變了引物模板配對(duì)反應(yīng)的Tm和聚合酶的熱穩(wěn)定性）。

4、還有研究發(fā)現(xiàn)：無或單一的添加劑都不能獲得目的基因片段，只有當(dāng)同時(shí)使如DMSO和甜菜堿，并在適當(dāng)濃度時(shí)才能夠獲得特異產(chǎn)物。在PCR系統(tǒng)中包含復(fù)合增強(qiáng)劑能有助于高GC%、長(zhǎng)基因片段的擴(kuò)增，為解決此類問題提供了一種有效的途徑。2三甲銨乙內(nèi)酯（0.5-2M）也有助于高GC含量和長(zhǎng)DNA的PCR反應(yīng)。進(jìn)行滴定以確定最佳濃度。使用三甲銨乙內(nèi)酯時(shí)，降低熔解溫度（92-93C）和退火溫度（低1-2C）。BSA（高達(dá)0.8pg/pl）也可以提高PCR反應(yīng)的效率。PCRXEnhancerSolution（Cat.No.11495-017）是一種新型的PCR混合溶液，有助于高效擴(kuò)增富含GC的序列和克服與問題模板PC

5、R相關(guān)的困難。5還可以使用一些公司的擴(kuò)增高GC含量的BUFFER或產(chǎn)品。例子：以Huntingtonsdisease基因（舞蹈病HD基因IT15CAG重復(fù)）為模板，擴(kuò)增262bp（GC含量73%）及358bp（GC含量71.5%）的DNA片段。PCR反應(yīng)Buffer分別使用了LAPCRBufferII、2XGCBufferI、2XGCBufferII以及B公司制的GCKitBuffer。擴(kuò)增條件見圖。根據(jù)圖所示，使用LAPCRBufferII和B公司制的GCKitBuffer目的產(chǎn)物擴(kuò)增，而使用TaKaRa的兩種GCBuffer時(shí)擴(kuò)增良好。時(shí)都沒有M1234M常4vg?2rr99z78公司邑GCKit（壩突Manual謖左）94v1min941C30secear3m滴6&v3m諂30Cyds圖用GCBuffer擴(kuò)增GC含量DNA時(shí)的結(jié)果上樣量：8p1/50plLane酶Buffertemplate量1:TaKaRaLATaq10LAPCRBufferII100ng2:TaKaRaLATaq2xGCBuff