分子熒光和磷光光譜分析法講解

1、分子熒光和磷光光譜分析法講解 分子熒光: Fluorescence分子磷光: Phosphorescence第一節(jié) 基本原理一、熒光、磷光產(chǎn)生的機(jī)理1、熒光、磷光的產(chǎn)生 當(dāng)物質(zhì)分子吸收入射光子的能量之后，發(fā)生了價電子從較低的能級到較高能級的躍遷，這時分子被激發(fā)而處于激發(fā)態(tài)，稱為電子激發(fā)態(tài)分子。這一電子躍遷過程經(jīng)歷的時間約為10-15 s。 躍遷所涉及的兩個能級間的能量差，等于所吸收光子的能量。紫外、可見光區(qū)的光子能量較高，足以引起價電子發(fā)生電子能級間的躍遷。 激發(fā)態(tài)分子不穩(wěn)定，它可能通過輻射躍遷和非輻射躍遷的衰變過程而返回基態(tài)。 輻射躍遷的衰變過程伴隨著光子的發(fā)射，即產(chǎn)生 熒光或磷光。 非輻射

2、躍遷：振動弛豫（VR） 內(nèi)轉(zhuǎn)化（ic） 系間竄越（isc） 這些衰變過程導(dǎo)致激發(fā)能轉(zhuǎn)化為熱能傳遞給介質(zhì)。振動弛豫：分子將多余的振動能量傳遞給介質(zhì)而 衰變到同一電子能級的最低振動能級 的過程。內(nèi)轉(zhuǎn)化：相同多重態(tài)的兩個電子態(tài)間的非輻射躍 遷過程。系間竄越：不同多重態(tài)的兩個電子態(tài)間的非輻射 躍遷過程。例如： S1 S0 T2 T1 例如： S1 T1 T1S0S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l 2l 1l 3 外轉(zhuǎn)換l 2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫 假如分子被激發(fā)到S2以上的某個電子激發(fā)單重態(tài)的不同振動能級上，處于這種激發(fā)態(tài)的分子，很快（約10-12 10-14s）發(fā)生振動弛豫

3、而衰減到該電子態(tài)的最低振動能級，然后又經(jīng)過內(nèi)轉(zhuǎn)化及振動弛豫而衰變到S1態(tài)的最低振動能級。接著，有以下幾種衰變到基態(tài)的途徑：S1 S0 輻射躍遷 熒光S1 S0 內(nèi)轉(zhuǎn)化S1 T1 系間竄越 T1 S0 輻射躍遷 磷光 T1 S0 系間竄越 內(nèi)轉(zhuǎn)化速率很快（k為1011 1013s-1 ）， S2以上的激發(fā)單重態(tài)的壽命很短（ 10-1 10-13s ），因而除極少數(shù)例外，通常在發(fā)生輻射躍遷之前便發(fā)生了非輻射躍遷而衰變到S1態(tài)。所以所觀察到的熒光壽命通常是來自S1態(tài)的最低振動能級的輻射躍遷。 系間竄越是自旋禁阻的，因而其速率常數(shù)小得 多（ 102 106s-1 ）。 熒光是來自最低激發(fā)單重態(tài)的輻射躍

4、遷過程所伴隨的發(fā)光現(xiàn)象。發(fā)光過程的速率常數(shù)大，激發(fā)態(tài)的壽命短。 磷光是來自最低激發(fā)三重態(tài)的輻射躍遷過程所伴隨的發(fā)光現(xiàn)象，發(fā)光過程的速率常數(shù)小，激發(fā)態(tài)的壽命相對較長。2、熒光、磷光的壽命和量子產(chǎn)率熒光壽命f ：熒光分子處于S1激發(fā)態(tài)的平均壽命：熒光發(fā)射過程的速率常數(shù)：各種分子的非輻射衰變過程的速率常 數(shù)的總和。典型的 在10-8 10-10s 磷光壽命p ：磷光分子處于T1激發(fā)態(tài)的平均壽命。T1 S0 自旋禁阻的躍遷達(dá)到毫秒級：t=0 熒光強(qiáng)度：t=t 光強(qiáng)度 熒光（或磷光）強(qiáng)度的衰變 熒光量子產(chǎn)率（f）定義為熒光物質(zhì)吸光后所發(fā)射的熒光的光子數(shù)與所吸收的激發(fā)光的光子數(shù)之比值。 熒光量子產(chǎn)率的大小

5、取決于熒光發(fā)射與非輻射躍遷過程的競爭結(jié)果。 F苯其激發(fā)態(tài)常由環(huán)外的羥基或氨基上的n電子激發(fā)轉(zhuǎn)移到環(huán)上而產(chǎn)生的，它們的n電子的電子云幾乎與芳環(huán)上的軌道平行，從而共享共軛電子結(jié)構(gòu)。 吸電子取代基使熒光減弱 醛基、羰基、羧基、硝基例如： 苯 熒光 硝基苯 無熒光 Cl、Br、I等重原子取代基，通常導(dǎo)致熒光減弱、磷光增強(qiáng)。 雖也含有n電子，但n電子的電子云并不與芳環(huán)上的電子云共平面，其 n *的躍遷為禁阻躍遷，且 S1 T1系間竄越的概率大，故而熒光減弱。 *：自旋許可的躍遷 摩爾吸光系數(shù)大， 104 激發(fā)態(tài)壽命短 S1 T1系間竄越概率較小 4、 最低電子激發(fā)單重態(tài)的性質(zhì) n *：自旋禁阻的躍遷 摩

6、爾吸光系數(shù)小，102 激發(fā)態(tài)壽命長 S1 T1系間竄越的幾率大熒光： * n *磷光： n * 有利不含N、O、S等雜原子的芳香化合物：最低激發(fā)單重態(tài) S1（、*） 含N、O、S等雜原子的芳香化合物：最低激發(fā)單重態(tài) S1（n、*） 三、影響分子發(fā)光的環(huán)境因素1、溶劑的影響（1）溶劑極性的影響 熒光體的偶極與溶劑分子的偶極之間存在著 靜電作用，溶劑分子圍繞在熒光分子的周圍組成 了溶劑籠。 許多共軛芳族化合物，激發(fā)時發(fā)生了 * 躍遷，其激發(fā)態(tài)比基態(tài)具有更大的極性，隨著溶劑 極性的增大，激發(fā)態(tài)比基態(tài)能量下降得更多，結(jié) 果熒光光譜向長波長方向移動。 熒光體的基態(tài)分子與溶劑分子形成氫鍵絡(luò)合物，熒光物質(zhì)的

7、吸收光譜、熒光光譜都受影響，熒光體的激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子形成氫鍵絡(luò)合物，熒光光譜受影響。（2）熒光體與溶劑間的特殊化學(xué)作用（氫鍵） n *躍遷、某些分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移躍遷 涉及非鍵的孤對電子 隨溶劑形成氫鍵能力增大 熒光光譜向短波方向移動 某些芳族羰基化合物和氮雜環(huán)化合物非極性、疏質(zhì)子溶劑中 激發(fā)單重態(tài)（n、*） 熒光弱或無 高極性的氫鍵溶劑中 激發(fā)單重態(tài)（ 、*） 熒光強(qiáng)例如: 異喹啉 在環(huán)己烷中 無熒光 發(fā)磷光 在水中 發(fā)熒光如果熒光物質(zhì)是一種有機(jī)弱酸或弱堿，它們的分子及其相應(yīng)的離子，可視為兩種具有不同熒光特性的型體，介質(zhì)的酸堿性變化將使兩種不同型體的比例發(fā)生變化，從而對熒光光譜的形狀和強(qiáng)度產(chǎn)

8、生很大的影響。2 、介質(zhì)酸堿性的影響 例如： 水楊醛 ( ) 不發(fā)熒光，強(qiáng)磷光 堿性溶液中 酚基解離 強(qiáng)熒光 濃無機(jī)酸溶液中 羰基質(zhì)子化 強(qiáng)熒光 （ 、*） （n、*）3 、介質(zhì)的溫度和黏度的影響4、有序介質(zhì)的影響 表面活性劑或環(huán)糊精溶液屬于有序介質(zhì)，對發(fā)光分子的發(fā)光特性有著顯著的影響。T VR ic F p黏度 VR ic F p 四溶液熒光、磷光的熄滅 熒光的熄滅廣義的包括了任何可使熒光增強(qiáng)度降低的作用。狹義的僅僅指那些由于熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子的相互作用所引起的熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象，這些會引起熒光的熄滅的物質(zhì)稱為熄滅劑 。 狹義的熒光熄滅的原因是溶液中熄滅劑分子和熒光物質(zhì)分子

9、之間發(fā)生相互作用而引起熒光物質(zhì)分子的熒光效率降低或熒光物質(zhì)激發(fā)態(tài)的壽命縮短，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的降低。 淬滅劑動態(tài)淬滅：在動態(tài)猝滅的過程中，發(fā)光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子通過與淬滅劑分子的碰撞作用，以能量轉(zhuǎn)移的形式或電荷轉(zhuǎn)移的機(jī)制喪失能量返回基態(tài)。淬滅劑與發(fā)光物質(zhì)激發(fā)態(tài)分子發(fā)生相互作用靜態(tài)淬滅淬滅劑與發(fā)光物質(zhì)基態(tài)分子發(fā)生相互作用著名的熄滅劑:鹵素離子重金屬離子氧分子硝基化合物 鹵素離子對于奎寧的熒光有顯著的熄滅作用，但對某些物質(zhì)的熒光并不發(fā)生熄滅作用，這表明熄滅劑和熒光物質(zhì)分子之間的相互是有選擇性的。 熒光熄滅作用在熒光分析中有著降低待測物質(zhì)的熒光強(qiáng)度的不良作用，但另一方面，我們可以利用某一物質(zhì)對某一熒光

10、物質(zhì)的熄滅作用建立對該物質(zhì)的熒光熄滅法檢測。該法常具有更高的選擇性。 1.碰撞熄滅 溶液中熒光物質(zhì)分子M和熄滅劑Q相碰撞 而引起熒光熄滅。 比較速率MhM*(吸光) 1 M* Mh (發(fā)生熒光) k1 M* M* +Q M+Q+熱 k2 M* Q Stern-Volmer方程式 k：熄滅常數(shù) Q：熄滅劑濃度(M) F0,F分別是熄滅劑Q不存在時及存在時的溶液的熒光強(qiáng)度2. 組成化合物的熄滅 某些熒光物質(zhì)溶液在加入一些熄滅劑之后，溶液的熒光強(qiáng)度顯著降低; 隨著溫度的升高，熒光強(qiáng)度而增強(qiáng)。 上述情況可能是由于一部分熒光物質(zhì)分子M與熄滅劑分子Q作用而生成了絡(luò)合物MQ，如絡(luò)合物MQ的形成是由于微弱的范

11、德華引力的作用，則所形成的絡(luò)合物并不發(fā)生熒光，且對solu的吸收并不發(fā)生任何影響。 發(fā)生熒光的物質(zhì)仍為M*分子，品種并沒有改變，所以熒光分子的平均壽命也沒有改變，至于solu溫度升高熒光強(qiáng)度之所以增強(qiáng)，可能是由于溫度升高時該絡(luò)合物較不穩(wěn)定，較多地分解為M和Q分子的緣故。這一點可以作為這一類型熄滅不同于碰撞熄滅的標(biāo)志。 如果絡(luò)合物MQ的形成是由于強(qiáng)大的力，則絡(luò)合物MQ將具有它自己的吸光特性，溶液的吸收光譜也將發(fā)生改變。3. 轉(zhuǎn)入三重線級的熄滅 E C位 E 能 * G D A BCBD處于單線態(tài)的基態(tài)EGF為第一激發(fā)單線態(tài)虛線為激發(fā)三線態(tài) 當(dāng)由單線態(tài)轉(zhuǎn)移至三線態(tài)時，多余的振動能在碰撞中損失掉，s

12、olu中絕大多數(shù)轉(zhuǎn)入三重線級的分子在一般溫度下是不會發(fā)光的，它們把多余的能量消耗于它們與其它分子的碰撞之中，因而引起熒光的熄滅 。 轉(zhuǎn)入三重態(tài)的分子在低溫下可由三線態(tài)重新返回到基態(tài)，在這一過程中將放出波長較長的磷光。 含溴、碘化合物、重氮、羰基、羧基及某些雜環(huán)化合物容易轉(zhuǎn)變至三線態(tài)，因而易使熒光熄滅。電子自旋方向的改變系有強(qiáng)烈磁場的誘導(dǎo)作用所引起的，在原子核附近，尤其是在Br或I這樣重的原子核附近，存在著強(qiáng)烈的磁場，所以含溴、碘的化合物容易使溶液熒光熄滅。 幾乎所有會發(fā)生熒光的有機(jī)化合物都會被溶解在溶液中的氧分子熄滅劑熄滅到不同的程度。 三線態(tài)的氧分子和單線態(tài)的熒光物質(zhì)分子碰撞 單線態(tài)的氧分子

13、和三線態(tài)的熒光物質(zhì)分子碰撞 4. 發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的熄滅 某些熄滅劑分子與熒光物質(zhì)分子相互作用時，發(fā)生了電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，即氧化還原反應(yīng)，即引起熒光的熄滅。 例：甲基藍(lán)熒光溶液被Fe2+離子熄滅 D + h D* D* D + h D * + Fe2+ D + Fe3+ D + H DH（半醌） 2DH D + DH2 （無色染料） 發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的熄滅劑并不限于金屬離子，I，Br，CNS，S2O32等易于給出電子的陰離子對奎寧，羅丹明及熒光素鈉等有機(jī)熒光物質(zhì)也會發(fā)生熄滅作用。5. 熒光物質(zhì)的自熄滅 當(dāng)C 1M時，常發(fā)生自熄滅現(xiàn)象。 自熄滅的原因是多樣的： （1）M* M 例：F熄滅 苯和蒽 （

14、2）多聚體的形成 多聚體與單體具有不同的吸收光譜，但不會發(fā)生熒光或熒光強(qiáng)度很弱。 消除： （1）熒光熄滅作用均隨著熄滅劑的濃度增大而加大，因此若對solu稀釋可消除或減低熒光的熄滅作用； （2）溶解氧的除去，通入氮氣。五 熒光（磷光）強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系 A =-lgT =bc T = F ( ) F =f 若用級數(shù)展開，略去高次項，得f kC k = bf稱為熒光的量子產(chǎn)率，f 濃度效應(yīng)1. 內(nèi)濾效應(yīng)2. 發(fā)光分子形成基態(tài)或激發(fā)態(tài)的聚合物3. 發(fā)光的再吸收第二節(jié) 儀器 與UV-Vis的區(qū)別： 1.檢測方向與入射方向垂直，以便使被散射的入射光的直接檢出減至最少2.兩個單色器 3.檢測池四面透明

15、 4.激發(fā)光譜 5.發(fā)射光譜 LM1SM2DR光源(1) 弧光燈和白熾燈 高壓氙燈 250800nm(2) 激光器 強(qiáng)度大，單色性好，靈敏度高單色器 光柵光檢測器 PMT CCD激發(fā)光譜：固定熒光的發(fā)射波長（即測定波長）而不斷改變激發(fā)光（即入射光）的波長，并記錄相應(yīng)的熒光強(qiáng)度，所得到的熒光強(qiáng)度對激發(fā)波長的譜圖發(fā)射光譜：如果使激發(fā)光的波長和強(qiáng)度保持不變，而不斷改變熒光的測定波長（即發(fā)射波長）并記錄相應(yīng)的熒光強(qiáng)度，所得到的熒光強(qiáng)度對發(fā)射波長的譜圖第三節(jié) 熒光的測定方法一、直接測定法 只要分析物本身發(fā)熒光，便可通過測定其熒光強(qiáng)度而測定其濃度。 工作曲線法二、間接測定法 有些分析物，或者本身不發(fā)熒光，

16、或者因熒光量子產(chǎn)率太低而無法進(jìn)行直接測定，便只能采用間接測定的辦法。1、熒光衍生法 熒光衍生法是運用某種手段將自身不發(fā)熒光的分析物，轉(zhuǎn)變成一種發(fā)熒光的化合物，再通過測定該化合物的熒光強(qiáng)度，以間接測定分析物。 化學(xué)衍生法： 化學(xué)反應(yīng) 電化學(xué)衍生法： 電化學(xué)反應(yīng) 光化學(xué)衍生法： 光化學(xué)反應(yīng) 許多無機(jī)金屬離子的測定： 與某些金屬螯合劑反應(yīng)生成具有熒光的螯合物之后加以測定。 某些不發(fā)光的有機(jī)化合物： 可通過降解反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)、偶聯(lián)反應(yīng)、縮合反應(yīng)、酶催化反應(yīng)或光化學(xué)反應(yīng)等辦法，使它轉(zhuǎn)化為熒光物質(zhì)。例如： 維生素B1（無熒光）維生素B1+鐵氰化鉀硫胺熒（發(fā)熒光）2、熒光猝滅法 有些分析物本身不發(fā)熒光，但卻能使某種熒光試劑的熒光發(fā)生猝滅，且熒光猝滅的程度與分析物的濃度有著定量的關(guān)系，通過測定該熒光試劑熒光強(qiáng)度的下降程度，便可間接地測定該分析物。3