建梅發(fā)的重點分子生物學new

1、組：是 DNA 分子上具有遺傳效應的特定核苷酸序列的總和，是負責編碼 DNA或一條多肽鏈的 DN段，包括編碼序列、編碼以外的側翼序列和序列。結構：中編碼 RNA 或蛋白質的 DNA 序列部分。結構在理論上有如下兩種功能：其核苷酸順序決定一條多肽鏈(蛋白質鏈)一級結構上的氨基酸序列，即一個順反子(cistron)(帶著足以決定一個蛋白質分子的全部組成需要信息的最短 DN段)；其核苷酸順序也決定一條多核苷酸鏈(如 mRNA)的核苷酸順序。啟動子：啟動子是一段位于結構5端上游區(qū)的 DNA 序列，能活化 RNA 聚合酶，使之與模板 DNA 準確地相結合并具有轉錄起始的特異性。啟動子是（gene）的一個

2、組成部分，控制表達（轉錄）的起始時間和表達的程度。啟動子（Promoters）就像“開關”，決定是成序列的核苷酸（nucleotides），那么啟動子也應由核苷活動，而是通過與稱為轉錄（transcription）因子的這種活動的。轉錄因子就像一面“旗子”，指揮著酶（enzymes）的活動。既然酸組成。啟動子本身并不控制蛋白質（proteins）結合而控制(RNA 聚合酶 polymerases) 的活動。這種酶指導著 RNA。真核細胞含有 3 類不同的RNA 聚合酶，根據(jù)其對 -鵝膏蕈堿的敏感性不同，分為 RNA 聚合酶（A）、RNA聚合酶（ B）、RNA 聚合酶（ C）。增強子：其含有多個

3、作用原件，可以特異性地與轉錄因子結合，增強的轉錄活性的段短 DNA 序列。增強子(enhancer)指增加同它連鎖的轉錄頻率的 DNA 序列。增強子是通過啟動子來增加轉錄的。有效的增強子可以位于的 5端，也可位于的 3端，有的還可位于的內(nèi)含子中。增強子的效應很明顯，一般能使轉錄頻率增加 10200 倍， 有的甚至可以高達上千倍。例如， 人珠蛋白的表達水平在巨細胞(cytomegalo，CMV)增強子作用下可提高 6001 000 倍。增強子的作用同增強子的取向(5一 3或 3一 5)無關，甚至遠離靶達幾千kb 也仍有增強作用。多順反子 mRNA：能夠反子 mRNA：只能的結構特點：人類多條 R

4、NA、翻譯多種蛋白質的結構一條 RNA、翻譯一種蛋白質的結構；。的顯著特征是含有內(nèi)含子（非編碼的序列），兩表達、調(diào)控側各有一段不被轉錄的序列，如啟動子、增強子、終止子等，對具有重要作用。組：是了生物體或細胞中一套完整“單倍體”的遺傳物質的總和，現(xiàn)在常指細胞或生物體的遺傳信息；組的大小通常以一個組中的 DNA含量來表示，稱為生物體的C 值；組包括內(nèi)和 產(chǎn)物的外。假：是指某些與功能結構相似，但不能表達DNA：是出現(xiàn)在非編碼區(qū)的串聯(lián)重復序列，通常存在于間隔 DNA 和內(nèi)含子中反向重復序列：是指兩個順序相同的拷貝在 DNA 鏈上呈反向排列。形式存在的真核組 DNA 末端都有一種特殊的結構叫端端粒：以線

5、性粒。該結構是一段 DNA 序列和蛋白質形成的一種復合體，僅在真核細胞末端存在。端粒 DNA 由重復序列組成，人類端粒一端是 TTAGGG 另一端是AATCCC.回文結構：在 DNA 鏈上，兩個拷貝反向串聯(lián)在一起，中間沒有間隔序列。問答題：序列，即：內(nèi)含子 5端大多數(shù)是以 GT 開始，3端大多是以 AG 結束。GT-AG 法則：真核生物的外顯子與內(nèi)含子接頭處都有一段高度保守的一致性原核生物與真核生物組的結構特點不同？結構特點組編碼序列比例重復序列轉錄的 mRNA原核生物數(shù)量小，結構簡單50%很少多順反子真核生物龐大3%大量反子1.成組通常僅由一條環(huán)狀雙鏈 DNA 分子組成。結構。其 DNA 是

6、與蛋白質結合，不形2.功能相關的幾個結構調(diào)控區(qū)控制。往往串聯(lián)排列在一起組成子結構，受上游共同的3.組中密度非常高,結構是連續(xù)的多為單一拷貝。4.結構無現(xiàn)象，組中任何一段 DNA 不會用于編碼 2 種蛋白質。5.在原核生物組中含有編碼同工酶的。6.在不同原核生物組中 GC 含量變化很大。7.原核生物組的非編碼區(qū)內(nèi)主要是調(diào)控序列。8.細菌組中的可移動成分能產(chǎn)生轉座現(xiàn)象。9.除細菌外，還有能的雙鏈環(huán)狀 DNA 分子，稱為質粒。真核組的特點：1、真核生物組的化學本質為 DNA，多與蛋白質結合形成染色質，基本結構為核小體。每一種真核生物都有一定的數(shù)目，除配子為單倍體外，體細胞一般為雙倍體，即含兩份同源組

7、。2、個 3、組遠大于原核生物，結構復雜，數(shù)龐大，具有許多起始點，每子大小不一。不存在子結構，功能相關分散在不同的上。都由一個結構與相關的調(diào)控區(qū)組成，轉錄產(chǎn)物為反子，即一分子 mRNA 只能翻譯成一種蛋白質。4、列。 5、組中有大量低度（重復頻率103）、中度（重復頻率105）和高度重復序是不連續(xù)的（斷裂），由外顯子和內(nèi)含子鑲嵌排列而成。6、非編碼區(qū)（占 90%以上）遠大于編碼區(qū)。7、功能相關的各種，它們可串聯(lián)在一起，亦可相距很遠，但即使串聯(lián)在一起的成簇的也是分別轉錄的。8、組中也存在一些可移動的遺傳，這些 DNA 順序并無明顯生物學功能，mRNA 的轉錄、加工、翻譯調(diào)控真核生物轉錄水平的調(diào)控

8、機制？答：真核生物在轉錄水平的調(diào)控主要是通過反式作用因子、順式作用元件和 RNA聚合酶的相互作用來完成的，主要是反式作用因子結合順式作用元件后影響轉錄起始復合物的形成過程。1、 轉錄起始復合物的形成：真核生物 RNA 聚合酶識別的是由通用轉錄因子與 DNA 形成的蛋白質-DNA 復合物，只有當一個或多個轉錄因子結合到 DNA 上，形成有功能的啟動子，才能被 RNA 聚合酶所識別并結合。似乎為自己的目的而組織，故有自私 DNA 之稱，其移動多被 RNA 介導，也有被DNA 介導的。原核組的特點：轉錄起始復合物的形成過程為：TFD 結合A 盒；RNA 聚合酶識別并結合TNA 復合物形成一個閉合的復

9、合物；其他轉錄因子與 RNA 聚合酶結合在這個過程中，反式作用因子的作用是：促進或抑制 TFD 與A 盒結合；形成一個開放復合物。促進或抑制 RNA 聚合酶與TNA 復合物的結合；促進或抑制轉錄起始復2、 反式作用因子：一般具能域（DNA 識別結合域、轉錄活性域和結合其的他形蛋成白。結域）；能識別并結合上游調(diào)控區(qū)中的順式作用元件；對達有正性或負性調(diào)控作用。3、 轉錄起始的調(diào)控：的表反式作用因子的活性調(diào)節(jié)：表達式調(diào)節(jié)反式作用因子出來就具有活性；共價修飾磷酸化和去磷酸化，糖基化；配體結合許多激素受體是反式作用因子；與順蛋式白作質用與元蛋件白的質結相合互：作反用式作用蛋因白子質被與激蛋活白后質，即復

10、可合識物別的并解結離與合形上成游。啟子元件和增強子中的保守性，對轉錄起調(diào)節(jié)作用。反式作用因子的作用方式成環(huán)、Oozing。、滑反式作用因子的組合式調(diào)控作用：每一種反式作用因子結合順式作用元件后雖然可以發(fā)揮促進或抑制作用，但反式作用因子對 而真是核幾生種物因轉子錄組后合水發(fā)平揮的特調(diào)定控的機作制用？。調(diào)控不是由單一因子完成的答 （1）、5，端加帽和 3，聚腺苷酸化的調(diào)控意義：5，端加帽和 3，聚腺苷酸化是保持mRNA 穩(wěn)定的一個重要中不被降解。，它至少保證 mRNA 在轉錄過程（2）、mRNA 選擇性剪接對表達調(diào)控的作用（3）、mRNA的控制細胞信號轉導G 蛋白偶聯(lián)受體的信號轉導機制：根據(jù)效應器

11、蛋白的不同及效應器所產(chǎn)生第二信使的類型，G 蛋白偶聯(lián)受體的信號轉導通路分為以下三種1. cc信號傳導通路PKA 途徑-活化：由G 蛋白耦聯(lián)受體所介導的細胞信號通路主要包括：c肌醇信號通路。信號通路和磷脂酰c信號通路又稱 PKA 系統(tǒng)(protein kinase A system, PKA)，是環(huán)核苷酸系統(tǒng)的一種。在這個系統(tǒng)中，細胞外信號與相應受體結合，通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)第二信使c的水平而引起反應的信號通路。信號分子通常是激素，對 c水平的調(diào)節(jié)，是靠腺苷酸環(huán)化酶進行的。該通路是由質膜上的五種成分組成：激活型受體(stimulate receptor, RS)，抑制型受體(inhibite rece

12、ptor, Ri)，激活型和抑制型調(diào)節(jié)G 蛋白(Gs 和Gi)和腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase, AC)。cPKA 途徑-失活：信息分子與受體解離，受體失活G 蛋白失活（GTP被水解成 GDP，亞基重新聚合）AC 失活c PKA 失活。2. 磷脂酰肌醇雙信使信號傳導通路被磷酸二酯酶水解而在磷脂酰肌醇信號通路中胞外信號分子與細胞表面G 蛋白耦聯(lián)型受體結合，激活質膜上的磷脂酶 C（PLC-），使質膜上 4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）水解成 1，4，5-三磷酸肌醇（IP3）和二?；视停―G）兩個第二信使，胞外信號轉換為胞內(nèi)信號，這一信號系統(tǒng)又稱為“雙信使系統(tǒng)”（double

13、 messenger system）。3. G 蛋白偶聯(lián)受體介導離子通道的調(diào)控信號分子與受體結合，引起受體構象變化受體激活G 蛋白Gq激活PLC（磷酸酯酶C）水解 PIP2產(chǎn)生 IP3、DAG。酶偶聯(lián)受體的信號轉導機制：生長因子RTK接頭蛋白Sos 蛋白Ras 蛋白Raf 蛋白（S/T 激酶）MEK蛋白（T/Y 激酶）MAPK（S/T 激酶）其他蛋白激酶、細胞質蛋白和轉錄因子表皮生長因子介導的信號傳導途徑？答：表皮生長因子受體是一個典型的蛋白酪氨酸激酶受體，這個信號轉導途徑的主要步驟是：1、 受體二聚化的形成及其磷酸化：表皮生長因子與受體的結合使受體發(fā)生二聚化，從而改變受體構象，使蛋白酪氨酸激

14、酶活性增強，受體自身的幾個蛋白酪氨酸殘基在激酶的作用下發(fā)生磷酸化。2、 募集接頭蛋白Grb2：表皮生長因子受體自身被磷酸化后，不僅其激酶活性增強，而且其構象發(fā)生變化，從而適合與含SH2 結構域的蛋白分子相結合。Grb2 是作為接頭蛋白結合到受體上。 3、 調(diào)控分子SOS 的活化：SOS 含有可與SH3 結構域相結合的富含脯氨酸基序，當Grb2 結合到磷酸化的表皮生長因子受體后，它的兩個SH3 結構域即可結合SOS，使之活化。4、 低分子量G 蛋白 Ras 的活化：SOS 可促進 RasGDP，結合GTP 的反應，使 Ras 激活?；罨?Ras 作用其下游分子 Raf，使之活化。Raf 是MA

15、PK級聯(lián)反應的第一個分子，由此啟動了MAPK 的三級激活過程。5、 MAPK 的級聯(lián)激活：Raf 是一種MAPKKK，它作用于MEK，使之磷酸化而激活，活化的 MEK 在作用于MAPK三級激活。的ERK1，使之磷酸化激活由此完成了6、 轉錄因子的磷酸化及轉錄調(diào)控作用：活化的 ERK 可以轉至細胞核內(nèi)，使某些轉錄調(diào)控因子發(fā)生磷酸化，從而影響G 蛋白偶聯(lián)受體與單次跨膜受體的特性的轉錄。G 蛋白偶聯(lián)型受體 含有 7 個跨膜 a 螺旋，與配體結合，激活G 蛋白，激活靶蛋白酶，導致細胞內(nèi)小分子信使含量及分布的迅速改變從而調(diào)節(jié)靶分子的活性并改變細胞的功能。G 蛋白偶聯(lián)受體均是膜內(nèi)在蛋白（egral mem

16、brane protein），每個受體內(nèi)包含七個 螺旋組成的跨膜結構域，這些結構域將受體分割為膜外 N 端（N-terminus），膜內(nèi) C端（ C-terminus），3 個膜外環(huán)（Loop）和 3 個膜內(nèi)環(huán)。受體的膜外部分經(jīng)常帶有糖基 化修飾。膜外環(huán)上包含有兩個高度保守的半胱氨酸殘基，它們可以通過形成二硫鍵穩(wěn)定受體的空間結構。當配體與受體結合，三聚體 G 蛋白解離，并發(fā)生 GDP 與 GTP 交換，游離的 GaGTP處于活化的開啟態(tài)，導致結合并激活效應器蛋白，從而傳導信號；當 GaGTP 水解成 GaGDP 時，則處于失活關閉態(tài)，終止信號傳遞并導致三聚體 G 蛋白的重新組裝，系統(tǒng)恢復進入靜

17、息狀態(tài)單次跨膜受體含有 1 個跨膜 a 螺旋，與配體結合被激活，多數(shù)受體表現(xiàn)某種酶促活性，介導的信號轉導過程則主要通過蛋白分子的相互作用而介導,并且有蛋白酪氨酸激酶的廣泛參與。表達調(diào)控管家：生物體各類細胞中都表達，對維持細胞存活和生長所必需的蛋白質編碼的。如 rRNA、通用轉錄因子、代謝酶系、細胞骨架蛋白等。管家表達水平受環(huán)境影響較小，而是在各個生長階段的大多數(shù)，或幾乎全部組織中持續(xù)表達，或變化很小，因此常存在于生物細胞核的常染色質中。它的表達只受啟動序列或啟動子與 RNA 聚合酶相互作用的影響，而不受其他機制調(diào)節(jié)。奢侈：特定類型細胞中為其執(zhí)行特定功能蛋白質編碼的。具有相同遺傳信息的同一細胞間

18、其所利用的并不相同，有的活動是維持細胞基本代謝所必需的，而有的則在一些分化細胞中活動，這正是細胞分化、生物發(fā)育的基礎。這類同的選擇性表達的與各類細胞的特殊性有直接的關系, 是在各種組織中進行不。順式作用元件：是指與結構們通過與轉錄因子結合而調(diào)控串聯(lián)的特定 DNA 序列，是轉錄因子的結合位點，它轉錄的精確起始和轉錄效率。順式作用元件順式作用元件(ciingelement)存在于旁側序列中能影響它們的作用是參與表達的調(diào)控。順式作用元件本身不編碼任何蛋白質，僅僅反式作用因子：是指能直接或間接地識別或結合在各類順式作用元件序提供一個作用位點，要與反式作用因子相互作用而起作用。表達的序列。順式作用元件包

19、括啟動子、增強子、調(diào)控序列和可誘導元件等，子有兩個重要的功能結構域:DNA 結合結構域和轉錄活化結構域,它們是其發(fā)揮轉錄 調(diào)控功能的必需結構，此外還包含有連接區(qū)。反式作用因子可被誘導合成, 其活性也受多種因素的調(diào)節(jié)。阻遏蛋白：阻遏蛋白（repressor protein）是基于某種調(diào)節(jié)基因所制成的一種控制蛋白質，在原核生物中具有抑制特定基因（ 群）產(chǎn)生特征蛋白質的作用。由于它能識別特定的操縱基因（即操縱子是阻遏蛋白的結合位點）， 當操縱序列結合阻遏蛋白時會阻礙 RNA 聚合酶與啟動序列的結合，或使 RNA 聚合酶不能沿 DNA 向前移動，阻遏轉錄， 介導負性調(diào)節(jié)， 因而可抑制與這個操縱基因相聯(lián)

20、系的基因群， 也就是操縱子的 mRNA 合成。選擇性剪接：選擇性剪接（也叫可變剪接）是指從一個 mRNA 前體中通過不 同的剪接方式（選擇不同的剪接位點組合）產(chǎn)生不同的 mRNA 剪接異構體的過程，而最終的蛋白產(chǎn)物會表現(xiàn)出不同或者是相互拮抗的功能和結構特性，若可變剪接產(chǎn)生的 mRNA 編碼框不同：a.可在同一細胞中產(chǎn)生多種蛋白質。b.在不同細胞中有不同的剪接方式，表現(xiàn)出組織特異性。c.在不同發(fā)育時期或不同條件下采取不同剪接方式，表達不同蛋白。RNA 干擾：將與 mRNA 對應的正義 RNA 和反義 RNA 組成的雙鏈 RNA(dsRNA)導入細胞，可以使 mRNA 發(fā)生特異性的降解，導致其相應

21、的基因沉默。這種轉錄后基因沉默機制被稱為 RNA 干擾（RNAi）。是在進化過程中高度保守的、由雙鏈 RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)的、同源 mRNA 高效特異性降解的現(xiàn)象。由于使用 RNAi 技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，所以該技術已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領域。乳糖操縱子的調(diào)控機制：負調(diào)控機制： A 阻遏作用：調(diào)節(jié)基因合成阻遏蛋白，沒有乳糖時阻遏蛋白識別操縱子并結合，RNA 聚合酶就不能與啟動子結合，不能轉錄。B 誘導作用：乳糖存在時，其代謝產(chǎn)生物可與阻遏蛋白結合，使阻遏蛋白改變構象，不能與操縱子結合，于是 RNA

22、聚合酶與啟動子結合，可以轉錄，然后合成分解乳糖的三種酶。正調(diào)控機制：Plac 是弱啟動子，細菌從以葡萄糖為碳源的環(huán)境轉變?yōu)橐匀樘菫樘荚吹沫h(huán)境時，cAMP 濃度升高結合 CAP，CAP 發(fā)生變構成與 CAP 結合位點序列特異結合，增強 RNA 聚合酶的轉錄活性，促進結構基因的轉錄，對乳糖操縱子實行正調(diào)控，加速合成分解乳糖的三種酶。協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)：乳糖操縱子中的阻遏蛋白的負調(diào)控與 CAP 的正調(diào)控兩種機制，互相協(xié)調(diào)、互相制約。真核生物 DNA 水平的調(diào)控方式a 染色質丟失；b 基因擴增：某些腫瘤中 c-myc 的擴增；c 基因重排：免疫球蛋白、TCR 的重排等；d DNA 甲基化；e 染色質結構變化?；?/p>

23、者，在相同的細胞中由于表達水平的不同而導致不同的表型。真核基因中內(nèi)含子的存在是可變剪接的分子基礎。若可變剪接產(chǎn)生的 mRNA 差異僅在 5和 3非翻譯區(qū)，因此產(chǎn)生的蛋白相同，差異區(qū)對翻譯起調(diào)控作用。列上參與調(diào)控靶基因轉錄效率的蛋白質。有時也稱轉錄因子。大多數(shù)真核轉錄調(diào)節(jié)因子由某一基因表達后，可通過另一基因的特異的順式作用元件相互作用，從而激活另一基因的轉錄。這種調(diào)節(jié)蛋白稱反式作用因子。反式作用因反式作用因子的三個基本特征一般具有三個功能結構域：DNA 結合域、轉錄激活域和蛋白結合域；能識別并結合調(diào)控區(qū)的順式作用元件；對表達有正性或負性的調(diào)控作用。DNA 體外重組技術克?。和ㄟ^無性繁殖過程所產(chǎn)生

24、的與親代完全相同的子代群體。通常是利用生物技術由無性生殖產(chǎn)生與原有完全相同組織后代的過程。分子克?。涸隗w外對 DNA 分子按照既定目的和方案進行人工重組，將重組分子導入合適宿主，使其在宿主中擴增和繁殖，以獲得該 DNA 分子的大量拷貝。工程(genetic engineering)：有目的地通過分子克隆技術，人為地操作改造，改變生物遺傳性狀的系列過程。工程（genetic engineering）又稱拼接技術和DNA 重組技術，是以分子遺傳學為理論基礎，以分子生物學和微生物學的現(xiàn)代方法為，將不同來源的按預先設計的藍圖，在體外構建雜種 DNA 分子，然后導入活細胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得

25、新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品。工程技術為的結構和功能的研究提供了有力段。獲取目的的方法1 從組文庫(genomic DNA library)分離篩選2 通過 cDNA 文庫(cDNA library)分離篩選的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列3 化學法 要求：已知目的4 聚合酶鏈反應擴增(polymerase工程的基本過程（如圖表）：chain reactioR)反式作用因子是真核細胞內(nèi)重要的表達調(diào)控蛋白。真核細胞內(nèi)含有的大量可以通過直接或間接結合順式作用元件而調(diào)節(jié)轉錄活性的蛋白質因子。在結構上含有與 DNA 結合的結構域。反式作用因子在轉錄調(diào)控過程中的作用是：促進或抑制 TFD 與A 盒結合；促進或抑制

26、RNA 聚合酶與TNA 復合物的結合；促進或抑制轉錄起始復合物的形成。限制性核酸內(nèi)切酶：限制性核酸內(nèi)切酶是細菌產(chǎn)生的一類能識別和切割雙鏈 DNA分子內(nèi)特定堿基順序的核酸水解酶。載體：能在連接酶作用下和外源 DNA 片段連接并運送 DNA 分子進入受體細胞的DNA 分子?？寺≥d體(cloning vector) 是能攜帶目的 DNA 片段 并將其運輸入宿主細胞的DNA 分子。表達載體(expression vector)為使插入的外源 DNA 序列可轉錄翻譯成多肽鏈而特意設計的載體。質粒：細菌細胞內(nèi)一種自我復制的環(huán)狀雙鏈 DNA 分子，能穩(wěn)定地獨立存在于染色體外，并傳遞到子代，一般不整合到宿主染

27、色體上。現(xiàn)在常用的質粒大多數(shù)是經(jīng)過改造或人工構建的，常含抗生素抗性基因，是重組 DNA 技術中重要的工具?；蚪M DNA 文庫：含有某種生物體全部基因的隨機片段的重組 DNA 克隆群體，它象一個儲存有基因組全部序列的信息庫。cDNA 文庫：含重組 cDNA 的細菌或噬菌體克隆群體，含有某種生物的全部的 mRNA的信息。轉化：指質粒 DNA 或以它為載體構建的重組 DNA 導入細菌的過程。轉導：指以噬菌體為媒介（載體），在細菌之間轉移 DNA 的過程,有時也指在真核細胞之間通過逆轉錄病毒轉移和獲得細胞 DNA 的過程.插入失活法的原理：目前使用的質粒載體都有抗藥標記。被轉化的細菌在含有這種（些）

28、抗生素的培養(yǎng)基中能夠生長，而未被轉化的細菌則不能生長或被殺死。然而，當限制酶作用于載體 DNA 的某一抗藥基因上并在此插入外源 DNA 時，載體上原有的抗藥基因即被破壞。由此重組體轉化的宿主細胞，則對這個抗生素敏感，這樣便可篩選出轉化菌株。真核系統(tǒng)表達的意義和目的：研究蛋白功能、研究蛋白功能域、大規(guī)模制備蛋白。DNA 序列測定DNA 測序常用的 SANGER 雙脫氧鏈終止法的原理？1. DNA polymerase 作用下的引物延伸；2. 特異性的鏈終止；3. 可區(qū)別單堿基長度的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。具體如下：DNA 鏈中核苷酸以 3,5-磷酸二酯鍵連接，合成 DNA 所用的底物

29、是 2-脫氧核苷三磷酸。2,3ddNTP 與普通dNTP 不同，它們在脫氧核糖的 3位置缺少一個羥基。在 DNA 聚合酶作用下通過三磷酸基團摻入到延伸的 DNA 鏈中，但由于沒有 3羥基，不能同后續(xù)的dNTP 形成磷酸二酯鍵，因此，正在延伸的 DNA 鏈不能繼續(xù)延伸。在 DNA 合成反應混合物的 4 種普通 dNTP 中加入少量的一種 ddNTP，鏈延伸將與偶然發(fā)生但卻十分特異的鏈終止競爭，產(chǎn)物是一系列的核苷酸鏈，其長度取決于引物末端到出現(xiàn)過早鏈終止位置間的距離。在 4 組獨立酶反應中分別采用 4 種不同的 ddNTP，結果將產(chǎn)生 4 組寡核苷酸，它們將分別終止于模板鏈的A、C、G 或T 位置

30、。聚合酶鏈反應定量 PCR（real-timePCR）：在 PCR 反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個 PCR 進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。PCR 技術的基本原理：依據(jù) DNA 半保留復制的機理；體外 DNA 分子于不同溫度下可變性和復性的性質。作為引物的一對寡核苷酸與模板 DNA 同源序列按照堿基互補配對原則形成局部雙鏈，然后在TaqDNA 聚合酶作用下引導新鏈 DNA 的合成，經(jīng)過 25-30 個變性、退火和延伸的循環(huán)，獲得特異性的 DNA 片段擴增產(chǎn)物。RT-PCR 的原理：先在逆轉錄酶的作用下、以 mRNA 為模板合成互補的 cDNA（complem

31、entary DNA），再以 cDNA 為模板進行PCR 反應。細胞增生和凋亡的分子機制主要的細胞凋亡信號轉導途徑（一）死亡受體途徑Fas 結合 Fas LFas 三聚體， 激活死亡結構域 募集 FADD 分子 Fas-FasL-FADD 形成死亡誘導信號復合物（DISC），并激活死亡效應域caspase 8 自我激活激活 caspase 3 細胞凋亡。（二）線粒體途徑通常在生長因子缺乏、生長環(huán)境不適、化學物質或射線導致 DNA 損傷后發(fā)生，細胞色素C 進入胞漿是關鍵步驟，需要調(diào)節(jié)蛋白 Bcl2 家族參與。進入胞漿的細胞色素C 與 Apaf 1、ATP/dATP 結合形成凋亡體Apaf 1 通過胱天蛋白酶募集域（CARD）與 caspase 9 前體的 CARD 作用募集 caspase 9 前體 caspase