ELISA的原理PPT課件(PPT 30頁)

1、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA ）1-第1頁，共30頁。ELISA的基本原理使抗原或抗體結(jié)合固相載體表面，并保持活性。使抗體或抗原與某種酶連接成酶標(biāo)抗體或抗原。在測(cè)定時(shí)，把受檢抗體（或抗原）和酶標(biāo)抗原（或抗體）按不同的步驟與固相載體表面的抗原（或抗體）起反應(yīng)。2-第2頁，共30頁。用洗滌的方法去除未結(jié)合的酶標(biāo)抗原（或抗體），最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物。產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺來定性或定量分析。3-第3頁，共30頁。免

2、疫標(biāo)記定義： 將抗原-抗體反應(yīng)與標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，用放射性同位素、酶或熒光素標(biāo)記的已知抗體或抗原，通過檢測(cè)標(biāo)記物，間接測(cè)定未知的抗原或抗體。分類：放射免疫測(cè)定法：131I，32P免疫熒光技術(shù)：FITC異硫氰酸熒光素，PE藻紅蛋白免疫酶測(cè)定法：HRP辣根過氧化物酶，AP堿性磷酸酶4-第4頁，共30頁。免疫酶測(cè)定法(Enzyme Immuno Assay,EIA)用酶標(biāo)記的抗原或抗體進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。 辣根過氧化物酶(HRP)，堿性磷酸酶(AP)特點(diǎn)：高度特異性：保持抗原抗體反應(yīng)的特異性高靈敏度：酶催化底物顯色的高效性，pg水平微量檢測(cè)定性定量檢測(cè)：反應(yīng)液顏色深淺或光密度值分類：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)：

3、可溶性抗原或抗體酶免疫組化法： 組織中或細(xì)胞表面的抗原。5-第5頁，共30頁。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)用酶標(biāo)記抗原或抗體檢測(cè)液體（血液、細(xì)胞液）中未知抗體或抗原的方法。1.定義2.分類間接法（Indirect ELISA）：將已知抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)記二抗檢測(cè)液相中未知抗體雙抗體夾心法（Sandwich ELISA)：將已知抗體吸附于固相載體，酶標(biāo)記一抗檢測(cè)液相中的可溶性抗原競(jìng)爭(zhēng)法（Competitive ELISA) ：將已知抗體或抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)記抗原或抗體檢測(cè)液相中的可溶性抗原或抗體6-第6頁，共30頁

4、。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)7-第7頁，共30頁。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)8-第8頁，共30頁。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)9-第9頁，共30頁。 ELISA的試劑ELISA中有三個(gè)必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；（3）酶的底物；（4）陰性對(duì)照品和陽性對(duì)照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品；（5）結(jié)合物及標(biāo)本

5、的稀釋液；（6）洗滌液；（7）酶反應(yīng)終止液10-第10頁，共30頁。11-第11頁，共30頁。標(biāo)本的采取和保存 體液、分泌物和排泄物等均可作標(biāo)本以測(cè)定其中某種抗體或抗原成份。 未抗凝血標(biāo)本離心前一般令其自行凝集，不可用木棍等剝離凝血塊。通常于室溫（2025）放置3060min，血標(biāo)本可自發(fā)完全凝集，析出血清；或37水浴2030min，析出血清。 以3000r/min轉(zhuǎn)速離心510min，使血清分離完全。 若過早離心，分離不全，血清中會(huì)殘留部分纖維蛋白原，吸附于反應(yīng)微孔，并且不易洗去，可與酶標(biāo)記物非特異性結(jié)合，造成假陽性。 12-第12頁，共30頁。標(biāo)本的采取和保存（1）要注意避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血、

6、脂血標(biāo)本。 血紅蛋白中鐵卟啉具有類似過氧化物酶的活性，因此，在以辣根過氧化物酶（HRP）為標(biāo)記酶的ELISA測(cè)定中，如標(biāo)本溶血，血清中血紅蛋白濃度較高，則其很容易在溫育過程中吸附于固相，從而與后面加入的底物反應(yīng)，從而產(chǎn)生非特異性顯色。 脂血標(biāo)本血清中大量的脂質(zhì)小粒易黏附于反應(yīng)孔內(nèi)壁，非離子型洗滌劑(如乳化劑OP)難以洗去，易產(chǎn)生非特異性吸附干擾。13-第13頁，共30頁。標(biāo)本的采取和保存（2）血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測(cè)，要注意盡量避免細(xì)菌污染。 血清標(biāo)本如在冰箱中保存過久，IgG可發(fā)生聚合，AFP可形成二聚體，使本底加深，產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。 細(xì)菌生長(zhǎng)所分泌的一些酶可能會(huì)對(duì)抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用；

7、一些細(xì)菌的內(nèi)源性酶可對(duì)以相應(yīng)酶作標(biāo)記的測(cè)定方法產(chǎn)生非特異性干擾。標(biāo)本在保存中如出現(xiàn)細(xì)菌污染所致的混濁或絮狀物時(shí)，應(yīng)離心沉淀后取上清檢測(cè)。14-第14頁，共30頁。標(biāo)本的采取和保存 （3）冰凍保存的標(biāo)本須注意避免因停電等造成的反復(fù)凍融。 標(biāo)本的反復(fù)凍融所產(chǎn)生的機(jī)械剪切力將對(duì)標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，從而引起假陰性結(jié)果。此外，凍結(jié)樣本溶解后，蛋白質(zhì)局部濃縮、分布不均，應(yīng)上下顛倒輕緩混勻，避免氣泡，不要在混勻器上強(qiáng)烈振蕩。 反復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)跌落，所以測(cè)抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測(cè)，宜少量分裝冰凍保存。15-第15頁，共30頁。試劑的準(zhǔn)備 1.放冰箱內(nèi)保存的試劑、在使用前應(yīng)先恢復(fù)到室溫。

8、2.仔細(xì)檢查試劑各組分是否變質(zhì)。3.保存試劑的冰箱應(yīng)定期檢查其貯存溫度（正常為2- 8），并盡量避免冰箱頻繁開關(guān)。 4.試劑盒中本次試驗(yàn)不需用的部分應(yīng)及時(shí)放回冰箱保存。5. ELISA 中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的。 16-第16頁，共30頁。在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。1 嚴(yán)格按照說明書要求，按規(guī)定的量和順序進(jìn)行。2 使用的微量加樣器應(yīng)注意保養(yǎng)并定期校正。3 加樣前應(yīng)使溶液充分混勻，并將液體加在孔底，避免加在孔壁上部，注意不可出現(xiàn)氣泡。加樣前要看移液器的液面是否平齊。4 加樣時(shí)避免樣本濺出，如有樣本濺出孔外時(shí)，應(yīng)用吸水紙輕輕

9、拭干，并做相應(yīng)記錄。5 加樣后微孔板應(yīng)及時(shí)溫育，盡量縮短加樣后溫育前的等待時(shí)間。6. 如果加樣槍漏氣以至于加樣的量不夠，不能用槍吸出再加，避免污染整條甩掉再重新加。加樣:17-第17頁，共30頁。溫育抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過程稱為溫育(incubation)。溫育常采用的溫度有43、37、室溫和4（冰箱溫度）等。37是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。注意3點(diǎn)：1 嚴(yán)格按照說明書要求，按規(guī)定的溫度和溫育時(shí)間進(jìn)行。2 為避免孔內(nèi)液體蒸發(fā)，可用封板膠將ELISA板面密封后進(jìn)行溫育。3 溫育時(shí)盡量少開啟恒溫箱門，不能人為縮短或延長(zhǎng)溫育時(shí)間。18-第18頁，共30頁。洗滌洗滌在

10、ELISA過程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。ELSIA洗滌：達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。可以說在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動(dòng)洗滌儀外，手工操作有流水沖洗式和浸泡式兩種：19-第19頁，共30頁。（1）流水沖洗式 流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌液為蒸餾水，自來水。洗滌效果更為徹底，且也簡(jiǎn)便、快速。已有實(shí)驗(yàn)表明，流水沖洗式同樣適用于微量滴定板的洗滌。讓水流沖擊

11、板孔表面，洗滌效果更佳。 （2）浸泡式 微量滴定板多采用。洗滌液為非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán)，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。20-第20頁，共30頁。顯色HRP的底物DH2+ H2O2 E D+ 2H2O 上式中， DH2為供氫體， H2O2為受氫體。DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。DH2如：鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和ABTS 。 TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液。酶反應(yīng)終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃

12、色，可在比色計(jì)中定量，最適吸收波長(zhǎng)為450nm，是HRP結(jié)合物最常用的底物。 。 HRP對(duì)氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物(urea peroxide)。21-第21頁，共30頁。22-第22頁，共30頁。23-第23頁，共30頁。顯色是酶催化無色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。TMB（四甲基聯(lián)苯胺）受光照的影響。但為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時(shí)間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐漸減弱，至2

13、小時(shí)后即可完全消退至無色。不使用過期顯色劑，肉眼可見淺蘭色的TMB顯色劑不能使用。 顯色劑避免在空氣中暴露時(shí)間過長(zhǎng)。 加顯色劑盡量避免濺出孔外。37度避光顯色。24-第24頁，共30頁。比色拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀中。以蒸餾水校零點(diǎn)，測(cè)讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過程的孔），以記錄本次試驗(yàn)的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果以光密度（oplical density，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長(zhǎng)寫

14、于A字母的右下角，如OPD的吸收波長(zhǎng)為492nm，表示方法為A492nm或OD492nm。25-第25頁，共30頁。酶標(biāo)比色儀酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱酶標(biāo)儀，通常指測(cè)讀ELISA光度計(jì)。針對(duì)固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設(shè)計(jì)。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測(cè)讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測(cè)范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到0.001，準(zhǔn)確性為1%，重復(fù)性達(dá)0.5%。操作時(shí)室溫宜在15-30，使用前先預(yù)熱儀器15-30分鐘，測(cè)讀結(jié)果更穩(wěn)定。測(cè)讀A值時(shí)，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長(zhǎng)。有的酶標(biāo)儀可用雙波長(zhǎng)式測(cè)讀。各種酶標(biāo)儀性能有所不同，使用中應(yīng)詳細(xì)閱讀

15、說明書。26-第26頁，共30頁。6 結(jié)果判斷 定性測(cè)定定性測(cè)定的結(jié)果判斷作出“有”或“無”的回答，分別用“陽性”、“陰性”表示。在這種半定量測(cè)定中，將標(biāo)本作一系列稀釋后進(jìn)行試驗(yàn)，呈陽性反應(yīng)的最高稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的強(qiáng)弱，這比觀察不稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強(qiáng)陽性、弱陽性更具定量意義。在間接法和夾心法ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。在競(jìng)爭(zhēng)法ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽性孔。27-第27頁，共30頁。4. ELISA的操作要點(diǎn)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑O(shè)計(jì)，優(yōu)質(zhì)的試劑，正確的操作和良好的儀器是保證ELISA必要條件。嚴(yán)格遵照規(guī)定操作，必能得出準(zhǔn)確的結(jié)果。28-第28頁，共30頁。ELISA的優(yōu)點(diǎn)：血清學(xué)方法有很多種, 如傳統(tǒng)的瓊脂擴(kuò)散( A G ID ) 、 血凝抑制( H A / H I ) 、 乳膠凝集、 試管凝集、補(bǔ)體結(jié)合等方法，但這些方法不是最合適的檢測(cè)方法。EILSA技